不同耐熱三色堇材料HSP70基因克隆及熱脅迫下的表達(dá)分析

牛楊莉，朱小佩，楊亞萍，葛曉敏，杜曉華，劉會(huì)超

(河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

三色堇(Violatricolor)，又名蝴蝶花、貓臉花，為堇菜科堇菜屬多年生草本觀賞花卉，作為重要的花壇花卉，在我國(guó)很多城市栽培應(yīng)用，市場(chǎng)需求量很大。然而三色堇不耐高溫，當(dāng)氣溫超過30 ℃便不能進(jìn)行花芽分化，且植株生長(zhǎng)不良[1]。因此，高溫是影響三色堇推廣應(yīng)用的一個(gè)限制因素。

熱激蛋白(Heat shock protein，HSP)是細(xì)胞受到高溫或其他脅迫條件誘導(dǎo)而表達(dá)提高的一類功能型蛋白，廣泛分布于原核生物和真核生物中，作為分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊，促使其他蛋白質(zhì)的重新折疊、穩(wěn)定、組裝、胞內(nèi)運(yùn)輸和降解，增強(qiáng)細(xì)胞抵抗脅迫環(huán)境的忍耐力，從而提高適應(yīng)性[2]。其中,HSP70是熱激蛋白家族中重要成員，在植物受到熱脅迫時(shí)，能夠被快速誘導(dǎo)并大量表達(dá)[3]。擬南芥在熱脅迫中過表達(dá)HSP70-1基因，證明HSP70能有效提高轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性[4]。HSP70基因家族成員龐大，目前，發(fā)現(xiàn)擬南芥有18個(gè)HSP70基因[5]，水稻32個(gè)[6]，芝麻21個(gè)[7]，大豆61個(gè)[8]，棉花30個(gè)[9]，辣椒21個(gè)[10]。HSP70基因家族結(jié)構(gòu)高度保守，且分布于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和葉綠體等細(xì)胞的各個(gè)部分。

河南科技學(xué)院三色堇資源與育種課題組自2006年開始進(jìn)行三色堇資源的收集評(píng)價(jià)工作，通過自交選育、生理指標(biāo)分析及田間耐熱性鑒定，從100多份三色堇材料中篩選出了3份耐高溫三色堇材料HAR、DFM-16和DFM-17。在熱脅迫下，這些耐熱材料的熱害指數(shù)和細(xì)胞膜受損程度都明顯低于不耐熱材料[11]。前期從耐高溫材料HAR中分離到了1個(gè)HSP70基因[12]。但其他耐熱材料的HSP70基因是否與其相同，熱敏材料的HSP70是否存在差異，是值得探索的問題。為此，以耐熱材料DFM-16和熱敏材料08H為試材，測(cè)定其HSP70基因序列，并分析熱脅迫條件下基因的表達(dá)模式，為進(jìn)一步解析三色堇的耐高溫分子機(jī)制提供基礎(chǔ)，同時(shí)也為挖掘和鑒定重要的高溫應(yīng)答基因、培育耐高溫三色堇新種質(zhì)提供重要的基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材為本課題組選育的耐熱三色堇資源DFM-16和熱敏三色堇資源08H,其來源與表型見表1。試驗(yàn)所用幼苗經(jīng)種子播種繁殖，在育苗室培育。培育條件：晝/夜溫度20 ℃/15 ℃，光照16 h/d，2個(gè)月后植株真葉數(shù)達(dá)到6～7片時(shí)進(jìn)行處理、取材。

表1 三色堇資源名稱及表型Tab.1 The names and phenotypes of pansy resource

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒和DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、凝膠回收試劑盒、熒光定量試劑、TaqDNA聚合酶、pMD18-T載體以及DNA Marker購自TaKaRa生物公司。

1.3 cDNA合成及基因組DNA(gDNA)提取

cDNA合成：從培養(yǎng)的DFM-16和08H植株材料上分別剪取幼嫩葉片，迅速放入液氮中研磨，總RNA提取根據(jù)天根RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，然后用NanoDrop 2000測(cè)定提取的RNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，以質(zhì)量檢測(cè)合格(OD260/280為1.9～2.1，電泳顯示2條清晰且無拖尾條帶)的RNA為模板，參照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書合成cDNA。

gDNA提?。簭呐囵B(yǎng)的DFM-16和08H植株材料上分別剪取幼嫩葉片，迅速放入液氮中研磨，DNA提取按照天根DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，用NanoDrop 2000檢測(cè)提取的DNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，提取質(zhì)量合格的DNA(OD260/280為1.8左右，電泳顯示1條清晰條帶)用作后續(xù)擴(kuò)增基因序列的模板。

1.4 VtHSP70 cDNA序列及gDNA序列擴(kuò)增

根據(jù)已測(cè)定的三色堇HAR材料中HSP70基因序列[12]，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物(表2)。PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：cDNA或gDNA模板約為100 ng，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，TaqDNA聚合酶0.5 U，無菌水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，48 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并利用TaKaRa凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收產(chǎn)物連接于pMD18-T載體上，經(jīng)E.coil感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選后，將重組載體菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

表2 VtHSP70基因克隆及qRT-PCR分析所用引物序列

1.5 VtHSP70 cDNA序列及gDNA序列分析

測(cè)序結(jié)果利用Seq Man軟件進(jìn)行拼接。采用NCBI的ORF finder預(yù)測(cè)開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)。從NCBI網(wǎng)站下載其他植物的HSP70序列，利用DNAMAN軟件做系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 VtHSP70基因表達(dá)水平分析

選取DFM-16和08H生長(zhǎng)一致且健壯的植株，放在光照培養(yǎng)箱中于42 ℃下分別熱激處理0、1、2、6、12 h，每個(gè)處理包括5株植株，處理結(jié)束后取5株植株的新鮮葉片進(jìn)行混樣，用液氮迅速冷凍，提取樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA序列?；跀U(kuò)增的VtHSP70cDNA序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，選用三色堇β-Actin基因作為內(nèi)參，引物序列見表2。qRT-PCR反應(yīng)體系為:TB Green Premix ExTaqⅡ(2×)7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA(10 ng/μL) 1 μL，補(bǔ)超純水至15 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析產(chǎn)物的熒光值變化曲線和熔解曲線，采用2-ΔΔCT法計(jì)算每個(gè)樣本中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平(ΔΔCT=ΔCT.Gene-ΔCT.Control，其中，ΔCT.Gene為待測(cè)組目的基因與內(nèi)參基因CT的差值，ΔCT.Control為對(duì)照組目的基因與內(nèi)參基因CT的差值)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，在同一批次完成目的基因和內(nèi)參基因的PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VtHSP70基因cDNA序列及gDNA序列擴(kuò)增

以DFM-16和08H材料的cDNA為模板，擴(kuò)增2個(gè)材料中VtHSP70cDNA序列。電泳結(jié)果顯示，2個(gè)材料中VtHSP70cDNA序列大小相同，略大于2 000 bp(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，2個(gè)VtHSP70cDNA序列均為2 042 bp，預(yù)測(cè)ORF都為1 950 bp，推測(cè)編碼649個(gè)氨基酸，序列相似性為98.61%。

以DFM-16和08H材料的DNA為模板，擴(kuò)增2個(gè)材料中VtHSP70gDNA序列。電泳結(jié)果顯示，2個(gè)材料中VtHSP70gDNA序列大小也基本相同，在3 000 bp左右(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，DFM-16中VtHSP70gDNA為2 514 bp，08H中為2 505 bp，序列相似性達(dá)到92.19%。cDNA和gDNA序列分析顯示，2個(gè)基因都含有1個(gè)內(nèi)含子，DFM-16材料中內(nèi)含子長(zhǎng)度為570 bp，位置在218—787 bp，08H材料中內(nèi)含子長(zhǎng)度為561 bp，位置在218—778 bp(圖2)。

1.DFM-16 cDNA；2.08H cDNA；3.DFM-16 gDNA；4.08H gDNA

黃色區(qū)域?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼區(qū)，黑色直線為內(nèi)含子區(qū)域，藍(lán)色區(qū)域?yàn)閁TR區(qū)

2.2 VtHSP70基因同源比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)預(yù)測(cè)出的VtHSP70基因編碼的氨基酸序列，與擬南芥、水稻和芝麻中HSP70基因編碼序列進(jìn)行比對(duì)(圖3)，氨基酸相似度分別達(dá)到96.26%、95.85%、93.49%。結(jié)果表明，三色堇VtHSP70基因與擬南芥的同源性較高，與水稻和芝麻次之。其中，三色堇VtHSP70氨基酸序列C末端含有一段EEVD序列，該序列為胞質(zhì)HSP70的特征序列，表明本研究分離的VtHSP70基因編碼產(chǎn)物可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。

在同源比對(duì)的基礎(chǔ)上，為分析三色堇中VtHSP70的進(jìn)化關(guān)系和分類，選取擬南芥、水稻、芝麻中HSP70家族所有成員，共71個(gè)HSP70氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從親緣遠(yuǎn)近來看，2個(gè)三色堇材料首先聚類，其次與擬南芥聚類，接著是水稻，最后是芝麻，表明在所選的幾種植物中，三色堇與擬南芥親緣關(guān)系最近，與芝麻最遠(yuǎn)(圖4)。并且2個(gè)三色堇材料所聚的這類HSP70都屬于胞質(zhì)HSP70，證明2個(gè)三色堇材料中的HSP70都定位在細(xì)胞質(zhì)中。

紅框內(nèi)為細(xì)胞質(zhì)中高度保守的HSP70 C末端標(biāo)志序列EEVD; Vt：三色堇；At：擬南芥；Os：水稻；Si：芝麻

2.3 高溫脅迫下VtHSP70基因的表達(dá)

42 ℃熱激處理后，耐熱材料DFM-16在12 h內(nèi)生長(zhǎng)狀況良好，形態(tài)無明顯變化。而熱敏材料08H在2 h時(shí)葉片開始出現(xiàn)輕微皺縮萎蔫，隨著熱激時(shí)間延長(zhǎng)，萎蔫癥狀加重，至12 h時(shí)，嚴(yán)重萎蔫并伴隨植株倒伏(圖5)。

采用qRT-PCR檢測(cè)不同熱激時(shí)間下2種材料中VtHSP70基因的表達(dá)水平，以未經(jīng)熱激(0 h)處理的08H材料的樣本為對(duì)照，經(jīng)42 ℃熱激處理后，2個(gè)材料中VtHSP70基因的轉(zhuǎn)錄水平在4個(gè)處理時(shí)間都升高，且在2 h時(shí)有最高表達(dá)水平，6 h和12 h時(shí)表達(dá)水平相似，都有所回落，但仍然高于對(duì)照水平。比較2個(gè)材料中VtHSP70基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，耐熱材料DFM-16中VtHSP70基因的表達(dá)量在室溫和熱激處理?xiàng)l件下都高于熱敏材料08H，DFM-16材料中最高表達(dá)倍數(shù)為其0 h的524倍，而08H材料僅為其0 h的36倍(圖5)。

星號(hào)標(biāo)記為DFM-16和08H VtHSP70蛋白，弧線標(biāo)記為定位在胞質(zhì)的HSP70

圖5 不同熱激時(shí)間下三色堇的表觀特征及VtHSP70基因的表達(dá)水平

3 結(jié)論與討論

HSP70是HSP家族中非常保守的一類應(yīng)激蛋白。本研究測(cè)定了耐熱材料DFM-16和熱敏材料08H中VtHSP70的cDNA序列，與擬南芥、水稻和芝麻中HSP70基因編碼的氨基酸序列相似性均在90%以上，這與陳曦[13]的研究結(jié)果一致，說明VtHSP70基因高度保守。

編碼細(xì)胞質(zhì)HSP70的基因通常具有0個(gè)或1個(gè)內(nèi)含子，而編碼細(xì)胞器HSP70的基因具有多個(gè)內(nèi)含子[14]。通過基因結(jié)構(gòu)分析，2個(gè)材料中VtHSP70均含有1個(gè)內(nèi)含子，由此推測(cè)DFM-16和08H材料中的VtHSP70編碼細(xì)胞質(zhì)的HSP70。根據(jù)HSP70亞細(xì)胞位置，可分成細(xì)胞核HSP70、細(xì)胞質(zhì)HSP70、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)HSP70、線粒體HSP70和葉綠體HSP70。本研究中2個(gè)三色堇VtHSP70 氨基酸序列均含有一段胞質(zhì)HSP70的特征序列EEVD，依據(jù)蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)和功能的相似性，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹的聚類，可根據(jù)已知的蛋白質(zhì)特性來推測(cè)同一類未知的蛋白質(zhì)特性[15]。根據(jù)2個(gè)三色堇材料與擬南芥、水稻和芝麻的氨基酸聚類結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2個(gè)材料中的VtHSP70首先與其他植物中的胞質(zhì)HSP70聚類，進(jìn)一步說明VtHSP70定位于細(xì)胞質(zhì)中。

大量研究表明，HSP70基因在調(diào)控植物抗逆過程中發(fā)揮了重要作用，植物在受到不利條件，如高溫逆境脅迫時(shí)，會(huì)上調(diào)HSP70的表達(dá)量，增強(qiáng)對(duì)高溫脅迫的抵抗力[16-17]。大部分植物在37～45 ℃的環(huán)境下，HSP70基因都會(huì)在0.5～2 h后被大量誘導(dǎo)表達(dá)[18-19]；擬南芥[20]和小麥幼苗[21]在40 ℃處理1 h時(shí)，HSP70基因的表達(dá)量均達(dá)到最高值，42 ℃處理蠟梅1 h時(shí)，CpHSP70基因表達(dá)量也達(dá)到最高，將近對(duì)照的10倍[22]；本研究中，與其他植物相類似，42 ℃熱脅迫處理下，DFM-16和08H材料中VtHSP70基因表達(dá)量都明顯上升，且在1 h就能被誘導(dǎo)，表達(dá)模式為隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，基因表達(dá)水平先升高后降低。推測(cè)當(dāng)高溫脅迫時(shí)，HSP70基因激活并快速大量表達(dá)以維持功能蛋白穩(wěn)態(tài)，但脅迫持續(xù)進(jìn)行使植物體長(zhǎng)時(shí)間處于亞健康狀態(tài)時(shí)，超越了HSP70維持機(jī)體功能蛋白穩(wěn)態(tài)的限度，各種生理功能開始受到影響，HSP70表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。但與擬南芥、蠟梅和小麥中研究結(jié)果[20-22]不同，三色堇VtHSP70基因在2 h表達(dá)量最高，這可能是物種差異，也可能是由于HSP70基因成員不同而出現(xiàn)的差異。在42 ℃熱脅迫處理下，08H材料較DFM-16材料對(duì)熱脅迫的反應(yīng)更敏感，比較其VtHSP70基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，耐熱材料DFM-16中VtHSP70基因的表達(dá)量在室溫條件和熱激處理?xiàng)l件下都明顯高于熱敏材料08H，DFM-16材料中最高表達(dá)倍數(shù)達(dá)到對(duì)照的524倍，而08H材料僅為對(duì)照的36倍，表明VtHSP70基因的表達(dá)水平可能與三色堇的耐熱性呈正相關(guān)。這種表達(dá)水平上的差異可能與基因的調(diào)控區(qū)域以及DNA甲基化等有關(guān)。