6種中藥體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用

劉 云，朱善元，龔祝南，秦 楓，夏文龍，吳 雙，吳曉潔

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 泰州 225300； 2.南京師范大學 生命科學學院，江蘇 南京 210000)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸障礙的高度傳染性疾病，能引起豬分娩率降低、晚期墮胎，以及死胎數(shù)量增加等問題，對全球經(jīng)濟造成了嚴重的影響[1]。目前，對該病的主要防治手段是接種疫苗。市面上的PRRSV疫苗主要有滅活苗和弱毒苗，但是這2種疫苗均存在免疫效果差和安全性低等問題[2]，因此，急需開發(fā)安全有效的針對PRRSV的特效藥物。

近年來，已有許多學者研究了中藥抗PRRSV的作用，發(fā)現(xiàn)很多中藥具有較強的抗病毒活性。中藥對病毒具有多重作用，毒副作用小且很少產(chǎn)生耐藥性，一些中藥還具有解熱、增強機體免疫功能等優(yōu)勢。PRINGPROA等[3]研究了狗牙根提取物體外抗PRRSV的作用，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為0.78 mg/mL的狗牙根粗提物可使PRRSV失活并在體外抑制PRRSV的復制。孫加節(jié)等[4]研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖在體外可有效阻斷PRRSV對Marc-145細胞的感染，可作為預防和治療PRRSV的候選藥物。胡安君等[5]、劉櫻等[6]、汪志等[7]還發(fā)現(xiàn)，甘草酸、黃芪、葛根連芩提取液在體外對PRRSV也有抑制作用。

荊芥具有抗痙攣、利尿、平喘、鎮(zhèn)咳等功效，可用于兒童皮疹、蛇和蝎子等動物咬傷后的局部治療[8]，其藥理作用在國內(nèi)研究較少，國外也主要研究其揮發(fā)油成分的藥理作用[9]。委陵菜可清熱解毒、止血、止痢，目前對其藥理學作用的研究較少。啤酒花具有抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、抗瘧原蟲等多種生物活性[10]，可用于治療消化不良、浮腫、小便淋痛、失眠、痢疾、結(jié)核、麻風等[11-12]。翻白草是一種多年生草本，具有清熱、解毒、止血、消腫的功效。劉蕾等[13]研究發(fā)現(xiàn)，翻白草油能增加感染呼吸道合胞病毒細胞的存活率，且有一定的劑量依賴性。百部的主要活性成分為百部生物堿，具有驅(qū)蟲、殺蟲、鎮(zhèn)咳平喘、抗腫瘤和抗菌等作用[14]?；⒄染哂欣懲它S、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效[15]，SEMPLE等[16]報道了2型和3型小兒麻痹病素能夠被虎杖中的大黃酚顯著地抑制。荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖均具有清熱解毒的功效，但目前尚未有關(guān)于這6種中藥抗PRRSV的研究。為此，選取這6種藥物，研究它們體外抗PRRSV的作用，以尋找出有效預防和控制PRRS的措施。

1 材料和方法

1.1 細胞與病毒

Marc-145細胞、PRRSV SH1705毒株、病毒滴度為105TCID50/mL的PRRSV SH1705病毒液、針對PRRSV ORF7編碼序列的特異性引物(F:5′-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3′，R:5′-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3′)、拷貝數(shù)為4.34×109的pMD-ORF7標準質(zhì)粒均由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)、PBS(上海培源公司)、青鏈霉素混合液(100×)(Solarbio公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)、二甲基亞砜(DMSO)(Solarbio公司)、病毒核酸純化試劑盒(TaKaRa公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)、染料法熒光定量試劑盒(TaKaRa公司)、噻唑藍(MTT)(Sigma公司，用PBS溶液配制成2 mg/mL，用前新鮮配制)。

1.2.2 主要儀器 生物安全柜(MVE公司)、酶聯(lián)免疫檢測儀(Bioteck公司)、CO2培養(yǎng)箱(NVAIRE公司)、ABI 7300(Thermo公司)、倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)、-80 ℃ 超低溫冰箱(Thermo公司)。

1.3 中藥提取

用傳統(tǒng)水煎煮法對荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖這6種中藥進行提取。每種中藥稱取10 g，加10倍水浸泡過夜，煎煮2次，每次30 min，合并濾液，濃縮至1 g/mL，真空干燥，稱質(zhì)量，計算得率，并置于干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥物安全性測定

1.4.1 Marc-145細胞培養(yǎng) 取出凍存的細胞，擰緊管蓋，立即置于37 ℃恒溫水浴鍋中，不停搖動使其快速融化。將該細胞轉(zhuǎn)入含有預熱的完全培養(yǎng)基的離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清，用預熱的完全培養(yǎng)基將其重懸后加入細胞培養(yǎng)瓶中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長至單層后進行消化，傳代備用[17]。

1.4.2 藥物安全性試驗 采用MTT法檢測藥物對細胞的抑制率，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定其OD值，根據(jù)OD值計算細胞生長抑制率[18]。

將細胞瓶中長至單層的細胞消化后計數(shù)，用含10% FBS的DMEM稀釋至約2×105個/mL，加入96孔板,每孔100 μL細胞懸液。待細胞長至單層后，棄去培養(yǎng)液，第1～10列依次從低質(zhì)量濃度至高質(zhì)量濃度加入稀釋藥液，每個質(zhì)量濃度重復4孔，每孔100 μL,11～12列加入細胞培養(yǎng)液作為細胞對照,置于 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)72 h后，棄去藥液，加入MTT溶液(PBS溶解，2 mg/mL),50 μL/孔，培養(yǎng)4 h后，棄去MTT溶液，加入DMSO完全溶解結(jié)晶，測OD490值。計算生長抑制率：生長抑制率=(細胞對照組OD490值-藥物組OD490值)/細胞對照組OD490值×100%。

1.5 PRRSV病毒滴度測定

1.5.1 PRRSV的擴增 將細胞瓶中長至單層的細胞消化后，棄去舊培養(yǎng)液，用 PBS洗2 遍。用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋 PRRSV，接種病毒液至細胞中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察，當出現(xiàn)80%～90%細胞病變時，終止培養(yǎng)。將病變細胞在-80 ℃與4 ℃反復凍融3次后，收集細胞懸液，5 000 r/min離心5 min，收集上清液[19]，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝至EP管內(nèi)，標注好分裝時間與批次等信息后，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 熒光定量PCR法測定病毒滴度

1.5.2.1 RNA的提取 按照TaKaRa病毒核酸純化試劑盒的操作說明，從PRRSV SH1705病毒液和保存的已知病毒滴度為105TCID50/mL的病毒液中提取RNA，所得RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2.2 反轉(zhuǎn)錄 按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，反應體系：PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA 2 μL，DDW 6 μL。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保溫，并將獲得的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2.3 熒光定量PCR 取標準質(zhì)粒，依次10倍倍比稀釋，配制成10-1～10-9的稀釋液，共9個梯度，每個梯度設(shè)3個重復，作為模板，按照TaKaRa染料法熒光定量試劑盒說明書的反應體系配制反應液，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板以及稀釋好的標準品，用PRRSV ORF7特異性引物，在ABI 7300儀器上進行熒光定量PCR反應[20]。反應體系：SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，ORF7F(10 μmol/L)0.8 μL，ORF7R(10 μmol/L) 0.8 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，DNA 模板2 μL，DDW 6 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸31 s，共擴增40個循環(huán)。延伸結(jié)束收集熒光信號。

1.6 6種中藥水提物體外抗PRRSV的效果測定

以荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖水提物的最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度，用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液2倍倍比稀釋成4個質(zhì)量濃度梯度，每個質(zhì)量濃度梯度重復4孔。將PRRSV病毒液稀釋為100TCID50，另設(shè)利巴韋林陽性對照，病毒對照及細胞對照。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察細胞病變情況，待病毒對照組細胞病變程度達到80%～90%后，采用MTT法測各孔OD值，計算藥物對病毒抑制率[21]：

藥物對病毒的抑制率=(加藥孔OD490值-病毒對照組OD490值)/(細胞對照孔OD490值-病毒對照孔OD490值)×100%。

1.6.1 阻斷作用試驗 Marc-145細胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，加入以最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度的中藥液，每孔100 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去藥液，加入100TCID50PRRSV病毒液，每孔100 μL，培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液。

1.6.2 抑制作用試驗 Marc-145細胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，加入100TCID50PRRSV病毒液，每孔100 μL，培養(yǎng)2 h后，棄去病毒液，加入以最大安全質(zhì)量濃度為起始質(zhì)量濃度的中藥液，每孔100 μL，培養(yǎng)4 h后，棄去中藥液，加入含2% FBS 的DMEM培養(yǎng)液。

1.6.3 直接滅活試驗 Marc-145細胞在96孔板中長至單層后，棄去舊培養(yǎng)液，同時加入50 μL藥液和50 μL病毒液(使藥液最高質(zhì)量濃度為最大安全質(zhì)量濃度和病毒液終含量為100TCID50)，培養(yǎng)4 h后，棄去藥液，加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液。

1.7 數(shù)據(jù)處理及藥效評價

每天用顯微鏡觀察上述各藥物組細胞病變情況并記錄，根據(jù)中藥對病毒的抑制率評價其抗病毒的效果，抑制率越高，說明其抗病毒作用越強。應用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種中藥水提物得率

荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖經(jīng)提取干燥后粉末質(zhì)量分別為2.32 g、2.22 g、3.61 g、2.26 g、5.27 g和3.49 g，其得率分別為23.2%、22.2%、36.1%、22.6%、52.7%和34.9%。

2.2 6種中藥水提物對細胞的安全質(zhì)量濃度測定結(jié)果

細胞病變觀察發(fā)現(xiàn)，不同藥物對Marc-145細胞都有一定程度的毒性作用，并且藥物質(zhì)量濃度越高毒性作用越強，主要表現(xiàn)為細胞折光性增加，變圓、粘連、破碎，甚至脫落。根據(jù)公式以O(shè)D490值計算藥物對細胞的生長抑制率，當抑制率為0時，則該質(zhì)量濃度下藥物對細胞沒有毒性作用，從而確定藥物的最大安全質(zhì)量濃度，結(jié)果見表1。荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖水提物的最大安全質(zhì)量濃度分別為0.25 mg/mL、1.25 mg/mL、0.63 mg/mL、0.31 mg/mL、0.16 mg/mL和0.47 mg/mL。

表1 中藥水提物對Marc-145細胞的抑制率及安全質(zhì)量濃度

注：A、B、C、D、E、F分別表示荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖。委陵菜、啤酒花、翻白草和百部的起始質(zhì)量濃度為5 mg/mL，荊芥和虎杖的起始質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL、15 mg/mL。

Notes: A, B, C, D, E, and F respectively representNepetacatariaL.,PotentillachinensisSer.,HumuluslupulusLinn.,PotentilladiscolorBge.,Stemonajaponica(Blume) Miq. andReynoutriajaponicaHoutt respectively.The initial mass concentrations ofPotentillachinensisSer.,HumuluslupulusLinn.,PotentilladiscolorBge. andStemonajaponica(Blume) Miq. are 5 mg/mL,NepetacatariaL. andReynoutriajaponicaHoutt. are 1 mg/mL and 15 mg/mL, respectively.

2.3 PRRSV的TCID50測定結(jié)果

檢測結(jié)果表明，已知病毒滴度為105TCID50/mL PRRSV病毒液的病毒載量為1.98×108拷貝/mL，擴增后得到的PRRSV病毒液的病毒載量為5.27×108拷貝/mL，經(jīng)計算，擴增后得到的PRRSV病毒液的病毒滴度為2.66×105TCID50/mL。

2.4 6種中藥水提物抗PRRSV的藥效

2.4.1 細胞形態(tài)觀察 各試驗組3種作用方式下的細胞形態(tài)見圖1—3。病毒對照組細胞大部分出現(xiàn)圓縮、團聚、脫落現(xiàn)象，而細胞對照組細胞呈單層生長，形態(tài)完好。

2.4.1.1 對PRRSV的阻斷作用 從圖1可以看出，翻白草藥物組細胞病變嚴重，細胞大量圓縮、團聚，并伴有脫落現(xiàn)象，荊芥和啤酒花藥物組出現(xiàn)了輕微細胞病變，細胞出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，其他藥物組基本無病變，細胞生長正常，有較好的保護作用。

2.4.1.2 對PRRSV的抑制作用 從圖2可以看出，啤酒花藥物組細胞病變程度嚴重，細胞圓縮、脫落，荊芥、翻白草和百部藥物組出現(xiàn)了細胞團聚現(xiàn)象，有輕微細胞病變，委陵菜和虎杖藥物組細胞呈單層生長，形態(tài)完好，未出現(xiàn)細胞病變，對細胞保護作用良好。

1：荊芥藥物組(0.25 mg/mL)；2:委陵菜藥物組(1.25 mg/mL)；3：啤酒花藥物組(0.63 mg/mL)；4：翻白草藥物組(0.31 mg/mL)；

圖2 藥物對PRRSV的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of drugs on PRRSV

2.4.1.3 對PRRSV的直接滅活作用 從圖3可以看出，委陵菜和虎杖藥物組未出現(xiàn)細胞病變，顯示出對細胞的保護作用，其他藥物組都出現(xiàn)不同程度的細胞病變。

2.4.2 6種中藥水提物對細胞的保護作用 MTT法檢測中藥處理組OD490值，其值越高，說明藥物對細胞的保護作用越強，即對PRRSV的抑制作用越強，6種中藥水提物抗PRRSV作用的抑制率見表2。從表2可以看出，這6種中藥抗PRRSV效果最好的藥物質(zhì)量濃度大部分為最大安全質(zhì)量濃度，隨著質(zhì)量濃度越來越低，其抑制作用逐漸變?nèi)酢?/p>

從阻斷作用來看，翻白草對PRRSV沒有阻斷作用，委陵菜、百部和虎杖對PRRSV的阻斷作用最強，其對PRRSV的最高抑制率分別為115.8%、120.2%和110.4%，其次是荊芥和啤酒花，其對PRRSV的最高抑制率分別為80.6%和61.5%，也表現(xiàn)出了對細胞良好的保護作用。

圖3 藥物對PRRSV的直接滅活作用Fig.3 Direct inactivation of drugs on PRRSV

Tab.2 Inhibition rate of PRRSV by different mass concentrations of water extracts of traditional Chinese medicines %

注：C1、C2、C3、C4表示從中藥水提物的最大安全質(zhì)量濃度開始2倍倍比稀釋的4個不同質(zhì)量濃度。

Notes: C1, C2, C3 and C4 represent 4 different mass concentrations diluted from the maximum safe mass concentration of the Chinese herbal medicine water extracts.

從抑制作用看，除啤酒花對細胞幾乎沒有保護作用外，翻白草對PRRSV的抑制作用最強，其對PRRSV的最高抑制率為129.4%，可以較好地保護細胞，其次是委陵菜和虎杖，其對PRRSV的最高抑制率分別為93.0%和94.3%，對細胞具有很好的保護作用，荊芥和百部對PRRSV的最高抑制率分別為52.2%和61.8%，也可以對細胞起到一定的保護作用。

從直接滅活作用來看，這6種中藥水提物對細胞都有不同程度的保護作用，其中委陵菜和虎杖的效果最好,對PRRSV的最高抑制率分別為125.4%和130.8%。

綜合3種作用方式的細胞病變情況和抑制率結(jié)果，荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖6種中藥水提物均具有抗病毒活性，對PRRSV具有不同程度的抗病毒作用。其中，委陵菜和虎杖體外抗PRRSV效果最好，其次是荊芥和百部。啤酒花的阻斷作用和直接滅活作用明顯強于抑制作用，幾乎沒有抑制作用。翻白草對PRRSV無阻斷作用，但其抑制作用和直接滅活作用較強。

3 結(jié)論與討論

中藥是天然存在的具有藥用價值的一類植物，自從其藥用價值被發(fā)現(xiàn)以后，就一直被用來治療各種疾病，且療效顯著[22]。水煎煮法是最早使用的中藥提取的傳統(tǒng)方法，該方法以水為溶劑，易操作，應用廣泛。隨著科技的進步，許多新型提取技術(shù)得到了越來越廣泛的應用，如超臨界液體萃取法、超聲波提取法、半仿生提取法等，這些提取技術(shù)具有提取速度快、效率高、收率好、無污染的特點[23]。但考慮到試驗的成本及溶劑的殘留可能對細胞造成的毒性作用，本試驗采用水煎煮法對荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖6種中藥進行提取。

體外細胞毒性試驗是一種在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境，檢測生物醫(yī)用材料或藥物等作用于細胞后所造成的細胞死亡、細胞溶解和細胞生長抑制的方法[24]。該方法具有效率高、成本低等優(yōu)點。評價中藥提取物對細胞是否具有毒性最直觀的方法是觀察細胞的生長狀態(tài)。中藥提取物對細胞有毒性時，主要表現(xiàn)為細胞折光性增加、變圓、粘連、破碎，甚至脫落[25]。而MTT法也可較為直觀地反映細胞活力及狀態(tài)，其能夠用于檢測細胞的存活與增殖，可以較為精確地反映活細胞數(shù)量。本試驗采用MTT法來評價中藥提取物對細胞的毒性。這6種中藥水提物對細胞的毒性作用各不相同，抑制率為0時，表明該質(zhì)量濃度下的中藥水提物對Marc-145細胞無毒性，得到中藥水提物的最大安全質(zhì)量濃度。荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖對Marc-145細胞的最大安全質(zhì)量濃度分別為0.25 mg/mL、1.25 mg/mL、0.63 mg/mL、0.31 mg/mL、1.56 mg/mL和0.47 mg/mL。冼瓊珍等[26]研究了16種中藥提取物抗PRRSV的作用，大部分提取物安全質(zhì)量濃度都在1.56～6.25 mg/mL，本試驗中6種中藥水提物安全質(zhì)量濃度的測定結(jié)果與其相似，表明本試驗所得的中藥水提物的安全質(zhì)量濃度結(jié)果真實、可信。

熒光定量PCR是目前檢測核酸含量以及分析基因表達水平相對變化的主要技術(shù)[27]，其準確性高、特異性強、靈敏度高、操作簡便，廣泛應用于臨床醫(yī)學和生命科學等多個學科領(lǐng)域[28-29]。本研究采用熒光定量PCR方法檢測PRRSV病毒液的病毒載量，根據(jù)已知病毒滴度的病毒液，更為快速、準確地得到擴增后PRRSV病毒液的病毒滴度。

體外細胞培養(yǎng)法是進行藥物抗病毒體外篩選的主要方法，即在細胞感染病毒后，檢測藥物對病毒的抑制作用。常用的檢測方法有染料攝入法、MTT法、空斑法、細胞病變效應法等[30]。本試驗結(jié)合MTT法和細胞病變觀察法，評價中藥提取物抗PRRSV的作用效果。大部分細胞在感染病毒后，細胞發(fā)生圓縮、團聚、脫落，甚至損傷、死亡等現(xiàn)象，可在顯微鏡下觀察，這些細胞特性的改變稱之為細胞病變效應，該法有助于對抗病毒藥物的初步鑒定。同時結(jié)合MTT法，可較為準確地找出抗病毒效果強的中藥提取物。

綜合3種作用方式，荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖這6種中藥對PRRSV都有不同程度的抗病毒作用，其中委陵菜和虎杖對PRRSV的抗病毒效果顯著，這2種中藥的3種作用方式最高抑制率都達到90%以上，且細胞未出現(xiàn)明顯病變，說明無論是對病毒的阻斷、抑制，還是殺滅作用，這2種藥物均具有很好的療效，能夠較好地起到保護細胞的作用。百部和荊芥對PRRSV的抗病毒作用也較強。啤酒花對PRRSV不能起到很好的抑制作用，翻白草對PRRSV的阻斷作用較弱，但這2種藥物的其他2種作用方式都能夠?qū)毎鸬搅己玫谋Ｗo作用，說明其具有一定的抗病毒活性。從中藥提取物對PRRSV的抑制率看，部分中藥提取物對病毒的最大抑制率達到了100%以上，表明在此質(zhì)量濃度下的中藥提取物對細胞是無毒的，也說明一定質(zhì)量濃度的中藥提取物能促進細胞的生長，這與胡元亮等[31]、布瑋瑋[32]測定結(jié)果相符，可能與中藥自身所含的多糖類、生物堿類、黃酮類或揮發(fā)油類以及生長調(diào)節(jié)因子促進細胞生長密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，荊芥、委陵菜、啤酒花、翻白草、百部和虎杖這6種中藥均具有體外抗PRRSV病毒活性，其中委陵菜和虎杖體外抗PRRSV的作用最佳，其次是荊芥和百部，啤酒花和翻白草也具有一定的抗PRRSV作用，可以用于PRRSV的臨床治療，但這6種中藥的抗病毒機制還有待進一步研究。