1株賽鴿新城疫強毒株的致病特性及分子特征分析

李珮瑤，高晶萍，田 勇，王存連，徐明舉，利 凱，李 軍，張瑞華，蘭金蘋，徐 彤,

(1.河北北方學院 預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北 張家口 075000；2.河北北方學院 生命科學研究中心，河北 張家口 075000)

鴿新城疫是由鴿Ⅰ型副黏病毒(Pigeon paramyxovirusⅠ,PPMV-Ⅰ)引起的常流行于鴿群的高度接觸性傳染病，臨床主要表現為鴿群腸炎、下痢、扭頭轉圈等神經癥狀[1]，因發(fā)病癥狀與雞新城疫神經型相似，故將其稱為鴿新城疫，是危害鴿養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。鴿新城疫起源于20世紀70年代末的中東地區(qū)[2]，在世界各地均有發(fā)生。我國肉鴿、賽鴿以及觀賞的鴿子數量龐大，尤其因賽鴿的放飛、集訓等導致其活動范圍十分廣泛，而且據報道，目前有250余種鳥類可自然或人工感染新城疫病毒(NDV)[3]，因此，賽鴿作為自然宿主也可使其他易感動物交叉感染發(fā)生新城疫。KOMMERS 等[4]發(fā)現，鴿新城疫病毒在白羽來航雞體內傳代后毒力增強，引起2周齡雞感染后出現明顯臨床病癥并導致死亡。張淑霞等[5]發(fā)現，用LaSota油佐劑滅活疫苗免疫的肉種鴿對鴿新城疫病毒SX株人工感染的保護率僅為66.7%。由此可見，鴿在新城疫的傳播過程中扮演著不可忽視的病毒攜帶者的角色，故對鴿新城疫的防控要足夠重視。

新城疫病毒基因組按3′到5′端的順序為NP-P-M-F-HN-L 6個基因片段，其中F蛋白是重要的致病性因子，與新城疫病毒的毒力強弱密切相關，是新城疫病毒分子病毒學重點研究對象[6-7]。本試驗從河北送檢賽鴿疑似新城疫病料中分離到1株病毒，經鑒定該分離毒株為新城疫病毒，命名為HB株；隨后進行致病性試驗和毒力測定。同時對其F基因進行擴增測序，將其與GenBank中已發(fā)表的流行毒株和我國部分疫苗毒株的F基因進行遺傳進化分析和氨基酸同源性比較，旨在確定鴿群中新城疫流行病毒的分子遺傳特征及變異情況，為鴿群新城疫疫苗毒株的選擇提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料及供試動物 疑似賽鴿新城疫的病料，由河北某賽鴿養(yǎng)殖場提供；SPF級種蛋購于山東省濟南賽斯家禽科技有限公司；1日齡雛雞由本實驗室孵化；6周齡SPF雞購于北京實驗動物中心；30～40日齡、未經任何免疫試驗雛鴿購于張家口市某肉鴿養(yǎng)殖場。

1.1.2 主要試劑 新城疫標準診斷抗原和陽性血清、禽流感標準陽性血清(H5、H7和H9)和雞減蛋綜合征陽性血清購于北京中越科技有限公司；RNAiso Plus、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購于TaKaRa(大連)有限公司；DEPC、50×TAE購于北京索萊寶科技有限公司；TIANgel Midi Purification Kit購于天根生化科技有限公司；乙醇、氯仿、異丙醇等購于天津光復精細化學研究所有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離鑒定 取病鴿肝臟、脾臟、肺臟、胰腺等器官，常規(guī)處理后接種SPF雞胚，0.2 mL/胚，96 h后收獲尿囊液。連續(xù)盲傳3代后，收獲病毒作為待檢病毒。將上述待檢病毒用血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗進行初步判定。

1.2.2 分離病毒致病性試驗 取分離病毒進行鴿子人工感染試驗，將12只未經免疫的30～40日齡雛鴿隨機分為感染組和對照組，每組6只，感染組肌肉注射0.2 mL病毒液，對照組注射0.2 mL生理鹽水，觀察臨床癥狀，統計發(fā)病率和死亡率。將發(fā)病死亡的鴿子及時進行病理剖檢，取肝臟、脾臟、肺臟、胰腺、小腸等臟器組織，用10%福爾馬林固定，經常規(guī)石蠟包埋，做病理切片。

1.2.3 分離病毒毒力指標測定 分離病毒毒力測定指標主要有雞胚平均死亡時間(MDT)、1日齡雛雞腦內致病指數(ICPI)和6周齡雛雞靜脈接種致病指數(IVPI)，具體檢測方法和判斷標準參照國際獸疫局(OIE)推薦的動物疫病診斷方法和生物制劑要求手冊[8]。

1.2.4 分離病毒分子特征分析

1.2.4.1 引物設計 參考GenBank中已發(fā)表的新城疫病毒F基因序列，設計1對特異性上下游引物，預計擴增F片段大小為1 897 bp，引物由上海生工生物工程公司合成。引物信息見表1。

表1 F基因的PCR擴增引物序列Tab.1 PCR amplification primer sequences of F gene

1.2.4.2 RT-PCR 按照RNAiso Plus說明書提取病毒RNA，加入適量DEPC水溶解RNA沉淀，按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0說明書步驟

進行反轉錄。反應體系：MgCl24 μL、10×RT Buffer 3 μL、dNTP Mixture 2 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、AMV Reverse Transcriptase XL 1 μL、Oligo dT-Adaptor Primer 1 μL、RNA 10 μL，加水至 30 μL。樣品加好混勻后，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，反應結束后的產物為F基因的模板鏈，隨后進行PCR反應。PCR反應體系：5×PCR Buffer 10 μL、滅菌水27.75 μL、TaKaRa ExTaqHS 0.25 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板鏈10 μL，總體積50 μL。按如下條件進行PCR反應：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行34個循環(huán)，而后72 ℃延伸10 min。反應結束后，取5 μL PCR反應產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

按照TIANgel Midi Purification Kit說明書進行DNA回收，然后取2 μL PCR反應產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA含量。由上海生工生物工程公司進行測序鑒定。

1.2.4.3F基因序列分析 將測得的F基因序列進行BLAST比對，從GenBank獲取已發(fā)表的F基因序列(表2)，按照文獻[9]的方法取F基因47—420位的374個核苷酸對表2中所列基因進行分型，利用DNAStar和MEGA 6.06軟件將分離到的HB株與表2中的各個基因型毒株以及傳統疫苗毒株LaSota、V4、B1株比較，進行遺傳進化樹的繪制和氨基酸序列同源性的分析。

表2 試驗用新城疫毒株的相關信息Tab.2 Properties of Newcastle disease virus strains in the study

注：“—”表示GenBank中無此項信息記錄。

Notes: “—” means that there is no record of this information in GenBank.

2 結果與分析

2.1 病毒分離鑒定

SPF雞胚在72 h內全部死亡，并且死亡雞胚可見全身出血，雞胚尿囊液HA效價為7 log2，經傳代后其效價達9 log2。HI試驗結果顯示，新城疫標準陽性血清可抑制待檢病毒凝集紅細胞，而禽流感及雞綜合征標準陽性血清未能抑制待檢病毒凝集紅細胞，證明分離到的毒株為新城疫病毒，將其命名為HB株。

2.2 分離病毒致病性試驗

鴿子在感染后48 h表現出精神沉郁、采食減少，伴有黃綠色下痢，并有腫眼流淚、扭頭歪頸、轉圈等神經癥狀；感染后4 d，有1只鴿子死亡；感染后第6天，其余5只鴿子也全部死亡，死亡率為100%。

剖檢死亡鴿子可見，頸部皮下組織出血；十二指腸出血、腸壁變薄，直腸和泄殖腔黏膜有大量的出血點；胰腺腫脹、出血；心冠脂肪組織有點狀出血；肺出血、腫大；腺胃乳頭有出血點，肌胃有條狀出血；脾臟腫大，有點狀出血；氣管環(huán)有出血(圖1)。

A.胰腺出血;B.頸部皮下出血;C.肌胃出血;D.心冠脂肪組織出血;E.脾臟出血、腫大;F.氣管環(huán)出血

從圖2可看出，感染鴿子肺臟靜脈充血，炎性細胞浸潤于部分血管外圍，肺房壁上皮細胞變性，部分壞死脫落，囊腔內有紅細胞及淋巴細胞；腦組織微血管出現明顯充血和淤血變化，其小血管出現炎性細胞滲出；脾臟小梁結構不清晰，紅白髓界限模糊，組織間有大量紅細胞；心肌纖維腫脹、纖維間有大量的紅細胞；胰腺組織各級血管擴張充血，部分血管外圍有炎性細胞浸潤，間質中散在少量紅細胞及淋巴細胞；肝臟血管擴張充血，多數肝竇擴張充血，間質增寬，其內散在紅細胞和蛋白質滲出物；腎臟組織間有紅細胞，血管周圍有大量炎性細胞；小腸黏膜下出血明顯，小腸絨毛出血、壞死，大量小腸絨毛斷裂、脫落。

2.3 分離病毒毒力測定

HB株MDT為52.8 h，ICPI為1.78，IVPI為2.59，根據國際獸醫(yī)局(OIE)推薦的判定標準，HB株屬于強毒株。

2.4 分離病毒分子特征

2.4.1 RT-PCR擴增結果 根據設計的特異性引物，目的片段在1 897 bp左右，如圖3所示，擴增出的片段與目的片段大小一致，含有1個大小為1 662 bp的完整開放閱讀框，編碼553個氨基酸。

2.4.2F基因遺傳進化分析 將此次分離到的鴿新城疫強毒株HB株與GenBank中已發(fā)表的22株不同種屬的新城疫病毒F基因進行比較，根據F基因高變區(qū)(47—420位)核苷酸序列繪制遺傳進化樹，如圖4所示。結合進化樹與BLAST比對結果可知，分離到的HB株屬于Ⅵ型，HB株F基因與pigeon/Qinghai/1344/2017的序列相似性高達98.45%，與基因型為Ⅵ型的pi/CH/LGD/110208、dove/Italy/2736/00、Q-GB 506/97、ASTR/74、CH-1/95、Ostrich/SX-01/06在同一進化分支上；同時可看到HB毒株與國內傳統新城疫疫苗毒株LaSota、B1、V4、Mukteswar株遺傳距離較遠，表明分離到的HB株與目前國內疫苗毒株基因型差異明顯。

▲表示分離的HB株;●表示常用疫苗株LaSota、V4、B1、Mukteswar

2.4.3 氨基酸序列分析 將測得的HB株F基因核苷酸序列通過DNAStar軟件翻譯為氨基酸序列，結果發(fā)現，HB株F蛋白裂解位點氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，符合新城疫強毒株特點。通過DNAStar軟件中的MegAlign程序將HB株F蛋白與GenBank已發(fā)表的表2中的22株新城疫病毒F蛋白進行氨基酸序列相似性比較，結果如圖5所示，氨基酸相似性在83.8%～99.5%，其中HB株與pigeon/Qinghai/1344/2017相似性最高，達99.5%；與TW/84C氨基酸序列相似性最低，為83.8%；與傳統疫苗毒株V4、B1、LaSota、Mukteswar株的相似性在88.1%～90.2%，表明分離的HB株與國內傳統疫苗毒株有一定差異。

圖5 HB株F蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.5 Amino acid sequence homology analysis of HB strain F protein

3 結論與討論

由于賽鴿在放飛過程中與各地野鳥、水禽、野鴿等接觸機會多，導致賽鴿感染新城疫病毒的概率大大增加，而且鴿亦可作為病毒攜帶者傳播給其他禽類，譬如雞、野鳥等，給現代養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴重的危害。因此，人們對鴿新城疫的防控意識需要大大加強。

本試驗從河北地區(qū)賽鴿疑似新城疫病例中分離到1株病毒，經HA和HI試驗證實分離毒株為新城疫病毒(命名為HB株)。為了確定HB株的致病力，將分離病毒肌肉接種新城疫抗體陰性雛鴿，感染鴿子出現精神沉郁、食欲廢絕、黃綠色下痢以及神經癥狀，在感染后6 d內全部死亡，死亡率為100%，這與發(fā)病鴿的臨床表現一致，其剖檢變化也與臨床發(fā)病鴿子病理變化相吻合，即肺臟、腸道、胰腺、腺胃等明顯腫脹、出血。

為了確定HB株的毒力特征，根據OIE標準測定其MDT、ICPI和IVPI。強毒型判定標準為MDT 40～60 h、ICPI >1.6和IVPI>2.0[8]。本試驗結果顯示，HB株MDT為52.8 h、ICPI為1.78和IVPI為2.59，屬于強毒株。袁小遠等[10]從北京鴿群中分離到新城疫病毒PB9601株，測定毒力特征時發(fā)現該毒株的MDT、ICPI和IVPI分別為50.5 h、1.65和2.36，與本試驗中HB株毒力指標相似，均符合新城疫強毒株的生物學毒力指標。

王林等[11]從北京免疫鴿群分離到BJP13株，發(fā)現該毒株接種雞胚后72 h內全部死亡，其F蛋白裂解位點112—117位氨基酸序列為RRQKRF，符合強毒株的分子特征。目前認為，鴿新城疫是雞新城疫病毒跨種感染鴿群適應的結果，具有很強的宿主特異性。研究表明，雖然大多數鴿源新城疫毒株F蛋白具有強毒株氨基酸的特征，但是其在雞群中復制能力較差，甚至對雞群沒有致病力[12]。因此，F蛋白裂解位點是否可作為評價鴿新城疫病毒致病性的指標還有待進一步研究。

目前，絕大多數鴿新城疫病毒基因型屬于基因Ⅵ型[13-14]。本研究中HB株經RT-PCR后進行F基因測序及進化分析，結果顯示，該毒株F基因片段為1 897 bp，含有1個大小為1 662 bp的完整開放閱讀框，編碼553個氨基酸。其核苷酸序列通過DNAStar翻譯為氨基酸序列，F蛋白裂解位點氨基酸排列為112R-R-Q-K-R-F117，結合致病性試驗和毒力測定證實，本研究中分離的鴿新城疫病毒HB株為強毒株。遺傳進化分析結果顯示，HB株為Ⅵ型，其與pigeon/Qinghai/1344/2017的序列相似性高達98.45%。此外，與其在同一分支、親緣關系較近的毒株還有Ⅵ型的pi/CH/LGD/110208、dove/Italy/2736/00、GB 1168/84、Q-GB 506/97、ASTR/74、CH-1/95、Ostrich/SX-01/06等，這與目前報道流行的鴿新城疫病毒屬于Ⅵ型一致[15]。但是HB株與傳統新城疫疫苗毒株LaSota、B1、V4、Mukteswar株遺傳距離較遠。以上結果表明，目前在鴿群流行的新城疫病毒株與常規(guī)雞源性新城疫疫苗毒株基因型存在一定差異，這也是導致鴿群中新城疫流行的主要因素。朱杰等[16]在湖南及江蘇免疫鴿群中分離出2株新城疫病毒，將其與疫苗毒株LaSota進行交叉中和試驗，結果顯示，這2株新城疫病毒與LaSota株抗原性差異很大，這可能是鴿群使用LaSota疫苗免疫后發(fā)生新城疫病毒感染的重要原因之一[17]。因此，為了有效防控鴿新城疫的發(fā)生，研制用于預防鴿群中新城疫病毒感染的基因Ⅵ型新型疫苗成為必然選擇。