肝損傷對大鼠體內(nèi)硫胺素及其代謝物水平的影響

葉倩利 張佳怡 劉李

摘要：文章為研究肝損傷對大鼠體內(nèi)硫胺素及其代謝物水平的影響，通過14天膽管結(jié)扎和硫胺素限制飲食分別構(gòu)建肝損傷和硫胺素缺乏大鼠模型，造模成功后，測定血漿和腦皮層中硫胺素及其代謝物濃度，并進一步分析了腦皮層中焦磷酸硫胺素依賴酶的活性和蛋白表達水平。結(jié)果表明：14天膽管結(jié)扎誘導的肝損傷大鼠與硫胺素缺乏大鼠的血漿和腦皮層中硫胺素濃度顯著降低，但其代謝物焦磷酸硫胺素的濃度未發(fā)生改變，腦皮層中焦磷酸硫胺素依賴酶活性和蛋白表達也未發(fā)生改變。14天膽管結(jié)扎誘導的肝損傷和硫胺素限制飲食均會顯著降低大鼠血漿和腦硫胺素水平，但不影響其代謝物焦磷酸硫胺素濃度及其依賴酶的活性和表達。

關(guān)鍵詞：膽管結(jié)扎；肝損傷；硫胺素；焦磷酸硫胺素

中圖分類號：R9? 文獻標志碼：A

0 引言

硫胺素也稱為維生素B1，是一種水溶性的維生素，同時也是影響腦能量代謝的關(guān)鍵物質(zhì)［1］。大腦主要通過有機陽離子轉(zhuǎn)運體（Organic Cation Transporters， OCTs）和硫胺素轉(zhuǎn)運體（Thiamine Transporters， THTRs）從體循環(huán)中獲取硫胺素［2］。硫胺素的代謝物焦磷酸硫胺素（Thiamine Pyrophosphate，TPP）是丙酮酸脫氫酶（Pyruvate Dehydrogenase， PDH）、α-酮戊二酸脫氫酶（Alpha-Ketoglutarate Dehydrogenase， KGDH）和轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase， TK）在催化各自底物進行生化反應(yīng)時的輔因子［3］。TK能夠?qū)⒍紗挝粡牧姿嵬寝D(zhuǎn)移到磷酸醛糖上，促進磷酸戊糖生成途徑中糖類的相互轉(zhuǎn)換［4］。PDH可以催化丙酮酸生成乙酰輔酶A，從而將糖酵解、脂肪酸代謝與三羧酸循環(huán)聯(lián)系起來［5］。KGDH主要催化三羧酸循環(huán)中的限速步驟，使α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A［6］。這些TPP依賴酶在能量代謝中都發(fā)揮著重要的作用，因此硫胺素缺乏會影響TPP依賴酶的活性并阻礙腦內(nèi)的能量代謝過程，使高度依賴葡萄糖氧化產(chǎn)生ATP作為能源的神經(jīng)細胞受到干擾，引發(fā)大腦乳酸堆積和酸中毒，并導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如認知功能下降等［7］。

長期缺乏硫胺素或長期過量飲酒（影響硫胺素吸收）會引起Wernickes腦?。?］，病人往往表現(xiàn)為精神和意識障礙、小腦共濟失調(diào)和眼球運動障礙等，嚴重者出現(xiàn)昏迷，甚至死亡。Wernickes腦病與硫胺素缺乏密切相關(guān)［2］。肝性腦病人也呈現(xiàn)硫胺素缺乏（Wernickes腦病）相同的腦病理生理性改變，如腦內(nèi)α-酮戊二酸脫氫酶活性降低、線粒體氧化作用缺失（ATP和磷酸肌酸降低）、腦乳酸蓄積、氧化/硝化應(yīng)激、細胞能量代謝損傷和促炎細胞因子釋放等［3，9］。臨床報道顯示，24例爆發(fā)性肝衰竭病人中有9例出現(xiàn)硫胺素缺乏［10］。有研究顯示，在急性肝損傷病人中，血中硫胺素水平（55.2±6.7 nmol/L）顯著低于正常人（81.8±10.2 nmol/L），伴隨腦乳頭狀體變小等［11］。類似地，在阿爾茨海默病患者血漿中TPP濃度降低與腦內(nèi)葡萄糖代謝受損程度正相關(guān)。在硫胺素缺乏小鼠腦內(nèi)TPP濃度降低也與腦內(nèi)葡萄糖代謝受損程度正相關(guān)［12］。在硫代乙酰胺（Thioacetamide， TAA）誘導的肝損傷大鼠腦內(nèi)ATP的水平也顯著低于對照鼠［13］。在吡啶硫胺素誘導的硫胺素缺乏大鼠中，腦內(nèi)ATP和磷酸肌酸等高能磷酸化合物水平顯著降低［14］。上述結(jié)果顯示，硫胺素及其代謝物TPP是維持腦正常能量代謝所必需的，肝損傷引起血和腦硫胺素缺乏，可能損傷腦能量代謝，進而影響正常的神經(jīng)功能。

本研究的主要目的：一是研究14天膽管結(jié)扎（Bile Duct Ligation， BDL）誘導的肝損傷是否會影響大鼠血漿和腦皮層中硫胺素及其代謝物水平；二是研究肝損傷狀態(tài)下腦皮層中TPP依賴酶活性和蛋白表達是否發(fā)生改變。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

硫胺素（貨號T283819）、TPP（貨號T111202）、肝素（貨號H104201）、二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，DTT）（貨號D265376）、輔酶A水合物（貨號C130754）、草酸鈉（貨號S112356）、魚藤酮（貨號R105076）、D-核糖-5-磷酸二鈉鹽（貨號R141013）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；單磷酸硫胺素（貨號929557）（Thiamine Monophosphate， TMP）、甘油磷酸異構(gòu)酶（貨號G2267）、磷酸丙糖異構(gòu)酶（貨號T2391）購自美國 Sigma 公司；總膽紅素（貨號C019-1-1）、直接膽紅素（貨號C019-2-1）、血氨（貨號A086-1-1）、總膽汁酸（貨號E003-2-1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Amino Transferase， ALT）（貨號C009-2-1）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate Amino Transferase， AST）（貨號C010-2-1）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase， ALP）（貨號A059-2-2）測定試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所；色譜級甲醇（貨號439193）購自德國Merck公司；β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide， NADH）（貨號N814671）、碘硝基四唑紫（Iodine-nitro-tetrazolium Violet， INT）（貨號I6069）、硫辛酰胺脫氫酶（貨號D796312）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide， NAD）（貨號N916067）、α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid， α-KG）（貨號K812223）、3-（N-嗎啉代）丙磺酸（3- （N-Morpholine） Propyl Sulfonic Acid，MOPS）（貨號M812719）購自上海麥克林生化科技有限公司；5 × loading buffer 上樣緩沖液（貨號P0286）、RIPA裂解液（貨號P0013B）、一抗二抗清除液（貨號P0025）、pH 6.8（貨號ST768）、pH 8.8（貨號ST788）和 pH 7.5（貨號ST775）的 Tris-HCl 緩沖液、N，N，N，N-四甲基乙二胺（N， N， N′， N′-Tetramethylethylenediamine， TEMED）（貨號ST728）、過硫酸銨（Ammonium Persulfate， APS）（貨號ST005）、30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（貨號ST1751）和BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0009）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；苯甲基磺酰氯（Phenylmethylsulfonyl Fluoride Phenylmethylsulphonyl， PMSF）（貨號3239503）購自北京百靈威科技有限公司；十二烷基磺酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate， SDS）（貨號S0002-250）和甘氨酸（貨號G0011-500）購自南京生興生物技術(shù)有限公司；Marker（貨號MP102-01/02）和 ECL 高敏化學發(fā)光液（貨號E423-01/02）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；兔抗 MAP2 多克隆抗體（貨號ab183830）和兔抗突觸素單克隆抗體（貨號ab32127）購自英國 Abacm 公司；小鼠抗 β-actin 單克隆抗體（貨號66009-1-Ig）購自美國Proteintech 公司；羊抗小鼠（貨號91196）和羊抗兔（貨號15295）二抗購自美國 Cell Signaling Technology 公司；PDH（貨號A1895）和KGDH（貨號A22163）單克隆抗體購自ABclonal 公司。實驗用水為超純水，其他試劑均為市售分析純。

高效液相色譜儀：HPLC-RF系統(tǒng)（日本Shimadzu公司），包括CBM-20Alite控制系統(tǒng)、DGU-20A3R脫氣機、SIL-20A自動進樣器、LC-20AT送液泵、CTO-10Avp柱溫箱、RF-10AXL熒光檢測器及Shimadzu Labsolutions色譜工作站。Millipore-Advantage A10 超純水器（美國 Millipore公司）；十萬分之一精密天平、萬分之一精密天平（德國 Sartotius BAS124S-CW）；Thermo Sorvall Stratos臺式高速冷凍離心機、HERAFREEZE BASIC超低溫冰箱（美國 Thermo Scientific 公司）；VORTEX-GENIE 2 渦旋混勻裝置（美國 Scientific Industries 公司）；xw-80A 旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；T25 高速手持電動組織勻漿器（德國 JANKE&KUNKEL， IKA Labortechnik）；Beckman 超高速冷凍離心機（美國 Beckman 公司）；85-2 型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）；Versa max 酶標儀（美國 MDC 公司）；HH-ZK2 恒溫水?。柫x市予華儀器有限公司）；BCD-321WDVI冰箱（青島海爾集團）；Hera Freeze Basic超低溫冰箱（美國 Thermo Scientific 公司）；T25 高速手持電動組織勻漿器（德國 JANKE&KUNKEL， IKA Labortechnik 公司）；Tanon-5200 Multi 全自動化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（中國天能科技公司）；電泳裝置、濕轉(zhuǎn)裝置（美國 Bio-rad 公司）；FE28 pH 計（德國梅特勒-托利多儀器公司）；高架十字迷宮裝置（上海吉量軟件科技有限公司）。

1.2 建立BDL誘導的肝損傷大鼠模型

健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物合格證編號為20180006037994。所有動物實驗均經(jīng)過中國藥科大學動物倫理委員會批準（No.2022-06-002），動物給予自由飲水和標準飼料，在恒溫（24±2 ℃）恒濕（55%±10%）的自然晝夜環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

10只雄性Sprague-Dawley大鼠進行7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)，當體質(zhì)量達到250g以上時，即可進行膽管結(jié)扎手術(shù)。大鼠手術(shù)前禁食不禁水12 h，隨機分為膽管游離不結(jié)扎的假手術(shù)組（Sham Operation， SHAM）和BDL組。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉后，腹部朝上固定頭部和四肢，從劍突下一指位置消毒并脫毛。在劍突下一指處沿著腹白線向下開腹約1 cm，隨后找到并游離肝臟到十二指腸段的膽總管，BDL組用尼龍線扎緊三處，SHAM組游離后不結(jié)扎，將十二指腸放回原位。向腹腔內(nèi)滴入250 mg/mL的氨芐霉素后，縫合肌肉層和皮膚層。手術(shù)過程中所用的手術(shù)器械都經(jīng)過消毒處理，縫合和結(jié)扎所用的針線都需要浸泡250 mg/mL的氨芐霉素。大鼠在術(shù)后飼養(yǎng)14 d，再進行后續(xù)實驗。所有大鼠禁食不禁水12 h，用戊巴比妥鈉（60 mg/kg ）麻醉后以股動脈放血的方式采血，將血液靜置0.5 h 以上，用離心機 8000 r/min離心5 min 后取上清，得到血清（不含肝素鈉）和血漿（含肝素鈉）。取出大鼠腦組織，在冰上分離大腦皮層，并用于后續(xù)大腦皮層內(nèi)物質(zhì)的濃度測定。

1.3 建立硫胺素限制性飲食誘導的硫胺素缺乏大鼠模型

實驗大鼠的來源、合格證編號和倫理批準號見“1.2建立BDL誘導的肝損傷大鼠模型”。10只雄性Sprague-Dawley大鼠進行7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機分為飲食對照（Control， CON）組和硫胺素缺乏（Thiamine Deficiency， TD）組，并分別飼喂標準純化飼料（硫胺素含量為5 mg/L）和硫胺素限制飼料（硫胺素含量≤0.01 mg/L）（江蘇省特洛菲動物飼料高科技有限公司）。CON組的食物攝入量受到嚴格控制以匹配TD組的食物攝入量［15］。在喂養(yǎng)大鼠14 d后，再進行后續(xù)實驗。所有大鼠禁食不禁水12 h，用戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉后以股動脈放血的方式采血，分別用含和不含肝素鈉的15mL EP管收集血液，將血液靜置0.5 h以上，用離心機8000 r/min離心5 min后取上清，得到血漿（含肝素鈉）和血清（不含肝素鈉）。取出大鼠腦組織，在冰上分離大腦皮層，并用于后續(xù)大腦皮層內(nèi)物質(zhì)的濃度測定。

1.4 測定大鼠血漿和腦皮層中硫胺素及其代謝物濃度

精密稱取硫胺素、TMP和TPP標準品5 mg，加0.1 mol/L HCl溶解并用容量瓶定容至5 mL，得到1.0 mg/mL儲備液。臨用前用0.1 mol/L HCl 稀釋為系列標準工作液。硫胺素的標準曲線工作液質(zhì)量濃度為：4.9、9.8、19.5、39、78、156、312、625 ng/mL。TMP的標準曲線工作液質(zhì)量濃度為：7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500、1000 ng/mL。TPP的標準曲線工作液質(zhì)量濃度為：19.5、39、78、156、312、625、1250、2500 ng/mL。上述所有的儲備液和工作液都于4 ℃條件下避光保存。

血漿和腦樣品的制備方法參考文獻［16］，稱取約100 mg大腦皮層組織樣品于 2mL EP管中，加入250 μL超純水，用手持電動組織勻漿器在冰水浴中進行勻漿，制得腦勻漿液。對硫胺素、TMP和TPP進行衍生化。衍生化試劑由7.7 mol/L NaOH 和 24.28 mmol/L 鐵氰化鉀按體積比1∶1混合制得，現(xiàn)用現(xiàn)配。取100 μL 血漿或100 μL 腦勻漿于1.5 mL EP管中，加入20 μL甲醇和50 μL衍生化試劑后混勻，再加入10 μL H3PO4調(diào)節(jié)樣品pH為 7.0;振蕩 10 min 后，以16000 r/min 在 4℃ 下離心 10 min，吸取120 μL 上清液到新的EP管中;再以16000 r/min 在 4℃ 下離心10 min，取100 μL 上清到進樣瓶中進樣。樣品處理過程全程避光操作。

儀器：HPLC-RF系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；色譜柱為Kromasil 100-5C18（250×4.6 mm）E64682；流動相A相（水相）為含20 mmol/L CH3COONa的超純水溶液，B相（有機相）為甲醇，有機相比例為33%，等度洗脫；流速為0.8 mL/min，樣品檢測時長為10 min；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL；檢測器為RF-10AXL熒光檢測器；檢測波長為激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長435 nm；洗針液為50%甲醇-水溶液。

1.5 測定TPP依賴酶（PDH、KGDH和TK）活性

通過INT在500 nm 處的還原量來測定PDH的活性［17］。將大腦組織懸浮于pH 7.8 的 “樣品緩沖液”（大腦組織 9 mL/g），其成分包含50 mmol/L K3PO4，1 mmol/L 2-巰基乙醇，1 mmol/L EDTA和0.1%（質(zhì)量體積比）Triton X-100。用手持電動勻漿器將混合物均質(zhì)化，獲得大腦勻漿。最終的反應(yīng)混合物總體積為200 μL，含有以下組分：50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L EDTA，0.2%（質(zhì)量體積比）Triton X-100（pH 7.8），2.5 mmol/L NAD+，0.1 mmol/L輔酶A，1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L草酸，1 mg/mL牛血清白蛋白，0.6 mmol/L INT，5～7單位的硫辛酰胺脫氫酶，5 mmol/L丙酮酸，在陽性對照組中另加0.2 mmol/L TPP。在對照組和實驗組中各加入10 μL 大腦勻漿（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為3.6 g/L）啟動反應(yīng)，在37 ℃ 下反應(yīng) 5 min 后測定500 nm 處的光學密度（Optical Density， OD），使用INT的還原量來表示PDH活性，每個組中的酶活性重復測定3次，取平均值。

通過在 340 nm 處NADH的生成量來表征KGDH的活性［15］。將大腦組織懸浮于pH為 7.8 的冰冷緩沖液中，緩沖液含有 50 mmol/L K3PO4和 0.2 mmol/L DTT。用手持電動勻漿器將混合物均質(zhì)化，最終的反應(yīng)混合物總體積為 200 μL，含有以下組分：50 mmol/L MOPS，50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L CaCl2，50 μmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，1 mmol/L α-KG，1 mmol/L NAD+，0.15 mmol/L 輔酶A，40 μmol/L 魚藤酮，0.1%（質(zhì)量體積比）Triton X-100，在陽性對照組中另加0.15 mmol/L TPP。最后，加入 10 μL 大腦勻漿（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5 g/L），使該體系在 30 ℃ 下反應(yīng) 5 min，通過α-KG依賴的NADH生成量來表示KGDH的活性。酶標儀讀取3次 340 nm 處OD值，取平均值。

TK活性的測定是按照Zhao等［18］的描述進行的。稱取50 mg腦皮層于2 mL EP管中，加入250 μL 胞漿蛋白提取液，用手持電動勻漿器勻漿，以13000 r/min 4 ℃離心15 min 后，取上清液?？偡磻?yīng)體系為200 μL，含有14.4 mmol/L核糖-5-磷酸，190 μmol/L NADH，380 μmol/L TPP，甘油磷酸脫氫酶>250 U/L，磷酸丙糖異構(gòu)酶>6500 U/L，最后加入50 μL腦勻漿上清液啟動反應(yīng)，在340 nm處測量OD值，每隔5 min 測定1次，持續(xù)1 h。TK酶活性由15 min和45 min吸光度的差異值表示。每組酶活性測定重復3次，取平均值。

1.6 測定腦皮層中TPP依賴酶的蛋白表達

蛋白樣本采用含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液從大腦皮層中提取。蛋白經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，被轉(zhuǎn)移到偏二氟乙烯膜上。在含有0.1% Tween 20、5%脫脂牛奶的Tris緩沖液中室溫孵育2 h，隨后與相應(yīng)的一抗抗體4 ℃ 孵育過夜，接著在室溫下用二抗孵育2 h。免疫反應(yīng)帶浸泡在ECL發(fā)光液中進行可視化，并通過化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)由Gradpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，繪制統(tǒng)計圖。利用單因素方差分析進行組間比較，以P＜0.05 表示結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 14天BDL誘導的大鼠肝損傷模型的建立

造模14天后處死BDL和SHAM大鼠，測定肝質(zhì)量、脾質(zhì)量和體質(zhì)量，并利用相關(guān)試劑盒檢測大鼠血清中肝功能相關(guān)的生理生化指標，來驗證肝損傷模型是否建立成功。如表1所示，BDL大鼠在造模 14 天后與SHAM大鼠相比，體質(zhì)量明顯下降，并且肝質(zhì)量體質(zhì)量比和脾質(zhì)量體質(zhì)量比明顯升高。BDL大鼠血清中AST、ALT、ALP活性比SHAM組顯著升高。同時BDL大鼠血清中總膽紅素、直接膽紅素、總膽汁酸和血氨水平也顯著升高。以上結(jié)果表明，14天BDL誘導的肝損傷大鼠模型建立成功。

2.2 BDL和TD大鼠血漿和腦皮層中硫胺素及其代謝物濃度

大鼠造模14天后處死，采集血漿和大腦皮層，進行硫胺素、TMP和TPP的濃度測定，結(jié)果如圖1所示。與SHAM大鼠相比，BDL大鼠血漿中硫胺素和TMP水平出現(xiàn)了顯著下降，而TPP水平無顯著差異。在大腦皮層中，BDL大鼠的硫胺素水平顯著降低，TMP和TPP水平相較SHAM大鼠無顯著差異。

與CON大鼠相比，TD大鼠血漿中硫胺素和TMP水平出現(xiàn)了顯著下降，而TPP水平無顯著差異。在大腦皮層中，TD大鼠的硫胺素水平顯著降低，TMP和TPP水平相比CON大鼠無顯著差異。TD大鼠血漿硫胺素水平降低說明硫胺素缺乏大鼠模型建立成功。

A.BDL和SHAM大鼠血漿中硫胺素及其代謝物質(zhì)量濃度；B.BDL和SHAM大鼠腦皮層中的硫胺素及其代謝物質(zhì)量分數(shù)；C.TD和CON大鼠血漿中硫胺素及其代謝物質(zhì)量濃度；D.TD和CON大鼠腦皮層中的硫胺素及其代謝物質(zhì)量分數(shù)；注：TMP為單磷酸硫胺素；TPP為二磷酸硫胺素；CON為正常飲食組；TD為硫胺素限制飲食組；*為P<0.05，**為P<0.01。

2.3 BDL和TD大鼠腦皮層中TPP依賴酶的活性

大鼠造模14天后處死，取腦皮層樣本，進行TPP依賴酶活性測定。結(jié)果如圖2所示，與SHAM大鼠相比，BDL大鼠腦皮層中PDH、KGDH和TK活性均無顯著變化。

與CON大鼠相比，在TD大鼠腦皮層中3種TPP依賴酶PDH、KGDH和TK的活性也沒有顯著改變。

2.4 BDL和TD大鼠腦皮層中TPP依賴酶的蛋白表達

大鼠造模14天后處死，取腦皮層樣本，提取蛋白進行Western Blot實驗。結(jié)果如圖3所示，與SHAM大鼠相比，BDL大鼠腦皮層中PDH和KGDH的蛋白相對表達量無明顯差異。

A.BDL和SHAM大鼠腦皮層PDH活性；B.BDL和SHAM大鼠腦皮層KGDH活性；C.BDL和SHAM大鼠腦皮層TK活性；D.TD和CON大鼠腦皮層PDH活性；E.TD和CON大鼠腦皮層KGDH活性；F.TD和CON大鼠腦皮層TK活性；注：PDH為丙酮酸脫氫酶；KGDH為α-酮戊二酸脫氫酶；TK為轉(zhuǎn)酮醇酶。

與CON大鼠相比，TD大鼠腦皮層中PDH和KGDH的蛋白相對表達量也無明顯差異。

3 結(jié)論

本文旨在研究14天BDL誘導的肝損傷對大鼠硫胺素及其代謝物水平的影響。采用國際上常用的BDL誘導的肝損傷模型［19］，通過相關(guān)試劑盒測定發(fā)現(xiàn)BDL大鼠血清中的氨、總膽紅素、直接膽紅素、總膽汁酸的水平升高，且ALT、AST、ALP的活性升高，同時BDL大鼠的肝質(zhì)量體質(zhì)量比和脾質(zhì)量體質(zhì)量比也升高，實驗過程中肉眼可見肝脾腫大，這些結(jié)果表明BDL誘導的肝損傷大鼠模型構(gòu)建成功。

硫胺素的吸收和轉(zhuǎn)運主要通過OCTs和THTRs等轉(zhuǎn)運體介導［20］。OCT2和OCT3的抑制劑皮質(zhì)醇可以顯著降低硫胺素的腸吸收，使硫胺素的腸通透系數(shù)（Effective Permeability，Peff）降低至對照組的30%左右，說明OCTs參與硫胺素的腸吸收［21］。OCT1主要表達在肝細胞竇側(cè)膜上，將硫胺素從血液側(cè)轉(zhuǎn)運至肝內(nèi)，而OCT2主要表達在腎小管細胞基底側(cè)膜，將硫胺素從血液側(cè)轉(zhuǎn)運至腎小管細胞，隨即由刷狀緣膜上的MATEs外排至尿液［20，22］。Denk等［23］發(fā)現(xiàn)BDL大鼠肝臟中OCT1 的mRNA和蛋白表達水平降低，并伴隨著OCT1介導的攝取功能降低。Hong等［21］發(fā)現(xiàn)14天BDL誘導的肝損傷會導致大鼠各腸段中OCT2蛋白表達水平降低，腎臟OCT2的mRNA和蛋白表達水平升高，與此相對應(yīng)的是，硫胺素的腸吸收減少和尿排泄增加，血硫胺素的濃度顯著降低。因此，14天BDL誘導的肝損傷會導致外周器官中硫胺素轉(zhuǎn)運體的蛋白表達水平降低，使大鼠的血硫胺素水平降低，而血硫胺素水平下降可能是肝損傷大鼠腦皮層中硫胺素水平降低的主要原因之一。

基于以上結(jié)果，原先推測BDL誘導的肝損傷也會降低腦內(nèi)硫胺素代謝物TPP水平，導致TPP依賴酶活性下降，阻礙正常的糖代謝途徑［24］。然而，BDL大鼠腦皮層中TPP濃度及其依賴酶PDH、KGDH和??A.BDL和SHAM大鼠腦皮層中PDH的蛋白相對表達量；B. BDL和SHAM大鼠腦皮層中KGDH的蛋白相對表達量；C.TD和CON大鼠腦皮層中PDH的蛋白相對表達量；D. TD和CON大鼠腦皮層中KGDH的蛋白相對表達量。

TK的活性并沒有發(fā)生顯著變化，PDH和KGDH蛋白的相對表達量也沒有改變，這些發(fā)現(xiàn)并不符合先前的推測，表明14天BDL誘導的肝損傷僅降低大鼠血漿和腦皮層中硫胺素水平，但不影響其代謝物TPP濃度及其依賴酶活性與表達。這可能與造模時間有較大關(guān)系，文獻報道28天BDL誘導的肝損傷大鼠皮層和海馬中ATP與ADP 比值、糖攝取和CO2生成等能量代謝指標顯著低于對照鼠［25］，提示在28天BDL大鼠皮層和海馬中硫胺素及其代謝物TPP濃度以及TPP依賴酶的活性均是降低的，進而影響腦能量代謝。

以硫胺素限制飲食構(gòu)建的TD大鼠模型進行對比研究。在TD大鼠造模后期，觀察到硫胺素缺乏造成的厭食［26］、煩躁［27］和翻正反射消失［15］等癥狀。造模結(jié)束后檢測TD大鼠的血漿和腦皮層樣品，發(fā)現(xiàn)硫胺素水平降低，說明硫胺素缺乏大鼠模型構(gòu)建成功。在硫胺素缺乏大鼠中同樣觀察到血漿和腦皮層中硫胺素水平顯著降低，但TPP濃度及其依賴酶活性與表達均未發(fā)生顯著改變。這同樣與造模時間有較大關(guān)系，文獻報道，在硫胺素限制飲食缺乏28天后大鼠腦內(nèi)TPP的濃度降低約30%［28］，而14天的硫胺素限制飲食并不影響大鼠腦內(nèi)TPP的濃度及其依賴酶的活性與表達。

此外還有文獻報道，硫胺素在神經(jīng)系統(tǒng)中起著酶促和非酶促的作用［29］。盡管TPP依賴酶的活性降低被認為是造成硫胺素缺乏癥狀的主要原因，但硫胺素本身也同時發(fā)揮著非酶促作用，作為軸質(zhì)、線粒體和突觸體膜的活性成分參與神經(jīng)元的突觸形成、軸突生長和髓鞘生成［30］。因此，硫胺素缺乏同樣可能阻礙上述過程，影響神經(jīng)元的正常功能，并導致認知缺陷等中樞神經(jīng)功能障礙。此外，硫胺素缺乏對各腦區(qū)的影響具有選擇性［6］。Butterworth等［15］發(fā)現(xiàn)，硫胺素缺乏會導致KGDH的活性在中腦、腦干和下橄欖核中的活性明顯降低，TK在下丘腦中的活性顯著降低［31］，而PDH的活性在所有腦區(qū)中均無顯著改變［15］。值得注意的是，在大腦皮層中并沒有發(fā)現(xiàn)PDH、KGDH和TK活性降低，這與在TD大鼠中觀察到的現(xiàn)象一致，表明以大腦皮層作為研究對象具有局限性。上述研究均提示，在硫胺素缺乏狀態(tài)下，腦皮層中PDH、KGDH和TK酶活性的降低不是影響神經(jīng)系統(tǒng)的唯一途徑，硫胺素的非酶促作用以及其他腦區(qū)受到的影響也需要納入考慮。

綜上所述，14天膽管結(jié)扎誘導的肝損傷和硫胺素限制飲食均會顯著降低大鼠血漿和腦硫胺素水平，但不影響其代謝物TPP濃度及其依賴酶的活性和表達。

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（編輯 李春燕）

Effect of liver injury on the levels of thiamine and its metabolites in rats

YE? Qianli1， ZHANG? Jiayi2， LIU? Li1*

（1.School of Pharmacy， China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China;

2.Department of Basic Medicine and Forensic Medicine， Baotou Medical College， Baotou 014000， China）

Abstract：? To investigate the effects of liver injury on the levels of thiamine and its metabolites in rats，14-day bile duct ligation and thiamine-restricted diet were used to construct liver injury and thiamine-deficient rat models， respectively. After successful modeling， the concentrations of thiamine and its metabolites in plasma and cerebral cortex were measured， and the activity of thiamine pyrophosphate-dependent enzymes and protein expression levels in cerebral cortex were further analyzed. 14-day bile duct ligation induced liver injury in rats and thiamine-deficient rats resulted in a significant decrease in the concentration of thiamine in the plasma and cerebral cortex， but the concentration of its metabolite， thiamine pyrophosphate， remained unchanged. The activity of thiamine pyrophosphate-dependent enzymes and protein expression in the cerebral cortex also did not change. 14-day bile duct ligation induced liver injury and thiamine-restricted diet significantly reduced plasma and brain thiamine levels in rats， but did not affect the concentration of its metabolite thiamine pyrophosphate as well as its dependent enzyme activity and expression.

Key words： bile duct ligation; liver injury; thiamine; thiamine pyrophosphate

基金項目：國家自然科學基金；項目編號：82173844。

作者簡介：葉倩利（1999—），女，碩士研究生；研究方向：藥物代謝動力學。

*通信作者：劉李（1981— ），男，教授，博士；研究方向：藥物代謝動力學。