低鹽條件下副溶血弧菌侵染對(duì)菲律賓蛤仔存活、消化腺組織及免疫基因表達(dá)的影響

陳俊影 王宇航 李雙 李云志 劉莉君 李東東 張賀 霍忠明 閆喜武

摘要：為探究低鹽條件下副溶血弧菌脅迫對(duì)蛤仔存活、消化腺組織及基因表達(dá)的影響，開展了不同鹽度和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）雙因素互作脅迫對(duì)菲律賓蛤仔的影響研究。結(jié)果表明，在鹽度和副溶血弧菌濃度分別為16‰-108 CFU/mL、16‰-107 CFU/mL和16‰-106 CFU/mL條件下處理蛤仔48 h的死亡率為100%。對(duì)蛤仔消化腺組織的切片觀察發(fā)現(xiàn)，低鹽條件下，相對(duì)于對(duì)照組（0 h），弧菌感染組中消化腺組織隨時(shí)間的增加內(nèi)腺管結(jié)構(gòu)開始逐漸排列松散，大量的腺管出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落，管腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞，炎癥細(xì)胞浸潤面積逐漸增多。利用熒光定量PCR檢測蛤仔消化腺中免疫基因時(shí)序表達(dá)發(fā)現(xiàn)基因在低鹽和弧菌雙重脅迫下Rho GTP、CD-MPR、Big Defensin、CfC1qDC、RpLysBp和PGRPs基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，表明低鹽條件下這些免疫基因響應(yīng)了副溶血弧菌的侵染。

關(guān)鍵詞：菲律賓蛤仔；副溶血弧菌；鹽度；消化腺組織切片；免疫基因

中圖分類號(hào)：S966.2 Q178.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金聯(lián)合基金“博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目”（2023-BSBA-013）

作者簡介：陳俊影（1999—），女，碩士研究生，主要從事貝類遺傳育種與繁殖研究。E-mail：2298631811@qq.com

通訊作者：李東東（1994—），男，博士，講師，主要從事灘涂貝類先天免疫與病害防控研究。E-mail：lidongdong@dlou.edu.cn

弧菌屬（Vibrio）隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）［1］，研究表明常見的弧菌屬會(huì)引起水產(chǎn)動(dòng)物疾病的發(fā)生［2］。水體環(huán)境因子的變化對(duì)貝類的健康養(yǎng)殖具有重要意義［3］，作為條件致病菌，環(huán)境因子的變化會(huì)直接成為弧菌病害爆發(fā)的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究表明，水體中的鹽度變化也可直接對(duì)貝類的生長發(fā)育、生理代謝、滲透調(diào)節(jié)和免疫防御等產(chǎn)生影響，進(jìn)而對(duì)貝類的存活率造成影響［4］。菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum），在我國海水養(yǎng)殖貝類中占據(jù)重要地位，其健康狀態(tài)及免疫能力與環(huán)境因子之間存在密切關(guān)聯(lián)［5］。

本文探究了不同鹽度及弧菌脅迫雙因素互作下對(duì)蛤仔存活的影響，通過消化腺組織切片觀察低鹽弧菌下對(duì)該組織的影響，進(jìn)而探討蛤仔消化腺組織的免疫基因，對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在為蛤仔養(yǎng)殖中預(yù)防弧菌病害發(fā)生及其健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

在大連市金州市七頂山海購買到實(shí)驗(yàn)用野生菲律賓蛤仔（下稱蛤仔），平均殼長3.87±0.2 cm，平均總重10.20±0.5 g。實(shí)驗(yàn)開始前，將蛤仔暫養(yǎng)于水溫22 ℃，鹽度30的實(shí)驗(yàn)室水槽中七天，連續(xù)充氣，每日更換沙濾海水，投喂小球藻一次。每日挑出死亡蛤仔，待蛤仔穩(wěn)定后，開始實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)所用的副溶血弧菌（V.parahaemolyticus），來自大連海洋大學(xué)病害實(shí)驗(yàn)室。菌種置于冰上解凍，用無菌接種環(huán)蘸取上層菌液，在TCBS固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 ℃控溫培養(yǎng)24 h，直至單個(gè)菌落清晰可見，重復(fù)劃線培養(yǎng)一次。在清晰觀察到單個(gè)菌落的重復(fù)培養(yǎng)后，挑取單一菌落然后在200 mL的2216E液體培養(yǎng)基進(jìn)行28 ℃下孵育并在以180 r/min的轉(zhuǎn)速的搖床上連續(xù)培養(yǎng)24 h，于無菌海水中進(jìn)行重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)重復(fù)3次并取平均值，每個(gè)瓶子中的細(xì)菌密度約為2.8×109 CFU/mL，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 感染實(shí)驗(yàn)

采用正交實(shí)驗(yàn)法，設(shè)計(jì)雙因素雙水平脅迫實(shí)驗(yàn)，因素水平：鹽度（30‰、23‰、16‰）和副溶血弧菌濃度（106 CFU/mL、107 CFU/mL、108 CFU/mL），見表1。加熱棒控制實(shí)驗(yàn)溫度為22 ℃，利用曝氣淡水進(jìn)行不同鹽度梯度設(shè)置。采用浸泡法對(duì)蛤仔進(jìn)行副溶血弧菌感染。將蛤仔分為9組，飼養(yǎng)在5 L水體的長方形水槽中，每組50只蛤仔，各組設(shè)置三個(gè)平行，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在各組中加入不同劑量的副溶血弧菌，使水體中的弧菌達(dá)到對(duì)應(yīng)的濃度。實(shí)驗(yàn)開始后0 h、24 h、48 h、72 h和96 h統(tǒng)計(jì)各平行組死亡個(gè)數(shù)，累計(jì)死亡率用各平行組平均死亡率表示。采用SPSS 25.0單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示具有顯著差異，使用Excel處理數(shù)據(jù)并繪圖。

1.2.2 組織切片觀察

實(shí)驗(yàn)組蛤仔在溫度22 ℃、鹽度23‰、水體弧菌濃度為108 CFU/mL條件下進(jìn)行低鹽副溶血弧菌攻毒實(shí)驗(yàn)，并取0 h對(duì)照組與24 h、48 h、72 h下實(shí)驗(yàn)組的蛤仔的消化腺組織，制作成石蠟切片后進(jìn)行HE染色，觀察感染后蛤仔消化腺組織器官的病理變化情況。

1.2.3 免疫基因表達(dá)分析

設(shè)置同1.2.2相同實(shí)驗(yàn)條件的低鹽弧菌脅迫感染實(shí)驗(yàn)，每組放入70個(gè)蛤仔，并設(shè)3個(gè)平行。分別在0 h對(duì)照組與24 h、48 h和72 h下實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)挑取3只蛤仔。使用Trizol法提取蛤仔消化腺總RNA。質(zhì)量檢測合格后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TianGen）合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7 ℃15 min，85 ℃5 s，反應(yīng)體系見表2。根據(jù)相關(guān)研究對(duì)蛤仔消化腺組織內(nèi)免疫相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，并在NCBI網(wǎng)站上設(shè)計(jì)特異性引物（表4），以β-actin作為內(nèi)部參考基因。利用羅氏熒光定量PCR儀（Roche）進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系見表3。熒光定量反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)，重復(fù)三次。qRT-PCR定量驗(yàn)證結(jié)果使用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 25.0處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛤仔低鹽條件下副溶血弧菌脅迫后死亡率分析

通過表型性狀觀察發(fā)現(xiàn)，未受脅迫的蛤仔解剖后各組織完整、鰓組織結(jié)構(gòu)清晰可見，整體軟體部組織新鮮，并對(duì)外部刺激反應(yīng)敏感。而受脅迫感染的死亡個(gè)體的外套膜無光澤發(fā)生萎縮易剝離，鰓組織發(fā)生萎縮，鰓絲出現(xiàn)嚴(yán)重糜爛，水管、足和閉殼肌軟弱無力。在對(duì)不同處理組蛤仔96 h內(nèi)累計(jì)死亡率統(tǒng)計(jì)（圖1）中發(fā)現(xiàn)，16‰-106 CFU/mL、16‰-107 CFU/mL、16‰-108 CFU/mL處理組在48 h死亡率達(dá)到100%，與30‰-106 CFU/mL、23‰-108 CFU/mL、30‰-108 CFU/mL和23‰-106 CFU/mL處理組相比差異顯著（P＜0.05）。通過對(duì)不同條件下蛤仔死亡率進(jìn)行方差分析的結(jié)果可以看出，鹽度對(duì)蛤仔死亡率的影響具有顯著意義（P＜0.05）。

2.2 蛤仔在副溶血弧菌脅迫后消化腺組織病理分析

如圖2所示，0 h為健康蛤仔消化腺組織，可見消化腺基本結(jié)構(gòu)清楚，排列整齊，消化腺為復(fù)管狀腺，腺管上皮細(xì)胞多呈柱狀，細(xì)胞核大，核仁明顯，間質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織未見明顯的增生。然而，低鹽條件下，副溶血弧菌感染組中的蛤仔消化腺組織隨感染時(shí)間的增加可觀察到內(nèi)腺管結(jié)構(gòu)開始逐漸排列松散，大量的腺管出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落，管腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞（紅色箭頭），間質(zhì)內(nèi)可見結(jié)締組織輕度增生，可見炎性細(xì)胞浸潤（紅色*表示）。

2.3 低鹽條件下副溶血弧菌處理后蛤仔免疫相關(guān)基因表達(dá)分析

通過qRT-PCR對(duì)低鹽條件下副溶血弧菌處理后的蛤仔消化腺內(nèi)免疫相關(guān)基因表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低鹽條件下，副溶血弧菌侵染后蛤仔消化腺內(nèi)Rho GTP基因表達(dá)與0 h相比在48 h時(shí)表現(xiàn)出顯著上調(diào)，甚至表達(dá)量達(dá)到峰值（P＜0.05），在72 h時(shí)出現(xiàn)下降（圖3 A）；CD-MPR基因在副溶血弧菌脅迫下表達(dá)呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢，在24 h表達(dá)量顯著升高并達(dá)到最大值（P＜0.05）（圖3 B）；此外，與0 h相比Big Defensin基因表達(dá)量在12 h升高后在24 h時(shí)出現(xiàn)下降，48 h再次出現(xiàn)升高并達(dá)到最大值，隨后達(dá)到72 h再次出現(xiàn)下降，但整個(gè)過程中除24 h外其他時(shí)間點(diǎn)與0 h均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）（圖3 C）；圖3 D所示，CfC1qDC基因表達(dá)量總體呈上升趨勢，并與0 h均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），表達(dá)水平在48 h達(dá)到最大值，但在72 h出現(xiàn)明顯下降。圖3 E所示，與0 h相比在12 h時(shí)RpLysBp基因表現(xiàn)出下調(diào)趨勢，在48 h時(shí)表達(dá)量最高（P＜0.05）。PGLYRPs基因表達(dá)量與0 h相比在脅迫24 h后表達(dá)量開始升高，并在72 h達(dá)到最高（P＜0.05）（圖3 F）。

3 討論

采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同鹽度和不同濃度副溶血弧菌脅迫證實(shí)鹽度對(duì)蛤仔的死亡率產(chǎn)生顯著影響，發(fā)現(xiàn)在鹽度16‰的條件下脅迫48 h時(shí)蛤仔死亡率達(dá)到100%。表明鹽度的改變與致病性弧菌會(huì)對(duì)貝類養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重的危害［6］。通過組織學(xué)切片觀察23‰-108 CFU/mL條件下蛤仔的消化腺組織病變程度隨時(shí)間增加而不斷加深。其實(shí)此前Joshy等［7］研究表明，根據(jù)對(duì)貝類的消化腺和鰓組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及損傷程度的評(píng)分，進(jìn)而可以對(duì)水體環(huán)境質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。在研究發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間的推移，蛤仔消化腺在感染72 h后可明顯觀察到消化腺組織的結(jié)構(gòu)排列極為松散，同時(shí)伴有大量的腺管上皮細(xì)胞脫落，以及出現(xiàn)多處炎性細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象。

蛤仔在低鹽條件下受副溶血弧菌感染時(shí)，機(jī)體大部分能量會(huì)被用于體內(nèi)滲透壓的調(diào)節(jié)，使免疫力下降更容易被弧菌所感染。本試驗(yàn)中通過對(duì)消化腺中的免疫相關(guān)基因的驗(yàn)證，表明6種與免疫相關(guān)的基因在蛤仔免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了一定的作用。Rho族蛋白是重要的分子開關(guān)，Yin等［8］人在進(jìn)行鰻弧菌（Vibrio anguillarum）脅迫蛤仔實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，作為免疫因子的Rho GTP基因出現(xiàn)顯著表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)中蛤仔受到副溶血弧菌脅迫下的顯著表達(dá)結(jié)果一致。陽離子依賴性甘露糖6-磷酸受體（CD-MPR）在貝類先天免疫過程中，可以介導(dǎo)吞噬作用，抵御病原菌的感染，將細(xì)菌引導(dǎo)到溶酶體進(jìn)行降解［9］，本研究發(fā)現(xiàn)蛤仔在應(yīng)對(duì)副溶血弧菌侵染時(shí)，CD-MPR是蛤仔識(shí)別副溶血弧菌入侵細(xì)胞的受體。同樣，在本研究驗(yàn)證了大防御素基因（Big Defensin）在蛤仔消化腺中的表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長逐漸達(dá)到峰值。Big Defensin可以響應(yīng)貝類免疫因子的儲(chǔ)存以及應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，使機(jī)體在受到病原菌的感染時(shí)，可以使免疫系統(tǒng)能及時(shí)發(fā)揮作用，抵制病原體的侵害［10］。Big Defensin在多數(shù)雙殼綱貝類中均被發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量均會(huì)隨著病原菌刺激時(shí)間的推進(jìn)而逐漸增加［11-13］。肽聚糖識(shí)別蛋白（PGRPs）作為一種模式識(shí)別受體，在機(jī)體先天免疫系統(tǒng)中占據(jù)重要地位［14］。Su等［15］通過對(duì)櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的CfPGRP-S1基因的研究發(fā)現(xiàn)，在鰻弧菌（V.anguillarum）刺激24 h時(shí)其表達(dá)水平顯著增加，與本研究PGRPs基因的表達(dá)水平在低鹽條件下副溶血弧菌刺激后的24 h到48 h顯著升高的結(jié)果相似。本研究中C1q相關(guān)的CfC1qDC基因表達(dá)上調(diào)，總體趨勢與隋立軍等對(duì)文蛤（Meretrix meretrix）受鰻弧菌侵染研究中發(fā)現(xiàn)C1q的表達(dá)水平顯著上調(diào)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似［16］。差異之處是由于隨著副溶血弧菌在體內(nèi)侵害時(shí)間的延長，其體內(nèi)營養(yǎng)代謝，有機(jī)質(zhì)的利用受阻，免疫活性開始受到抑制，導(dǎo)致其表達(dá)水平降低。溶菌酶（Lysozyme，LSZ）廣泛存在于軟體動(dòng)物的許多組織器官中，溶酶體酶是軟體動(dòng)物中研究最多的，在本研究中，與LSZ相關(guān)的RpLysBp基因在48 h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到峰值，與王銳等［17］的研究表明PGN處理組在3 h時(shí)蛤仔RpLysBp基因表達(dá)量達(dá)到最高存在差異，這可能是由于脅迫方式的不同所導(dǎo)致。

參考文獻(xiàn)

［1］張曉華，林禾雨，孫浩.弧菌科分類學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，48（8）：43-56.

［2］李夢(mèng)飛，明紅霞，樊景鳳，等.近岸及河口環(huán)境中副溶血弧菌的生態(tài)適應(yīng)性及其主要毒力基因分布特征［J］.生命科學(xué)，2019，31（2）：209-215.

［3］Han J E，Mohney L L，Tang K F J，et al.Plasmid mediated tetracycline resistance of Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease（AHPND）in shrimps［J］.Aquaculture Reports，2015，2：17-21.

［4］單筱涵，馮延凱，李雪，等.山東養(yǎng)馬島貝類養(yǎng)殖海域細(xì)菌及相關(guān)因素的研究［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2021，42（2）：24-29+36.

［5］王鳳青，孫玉增，任利華，等.海水養(yǎng)殖中水產(chǎn)動(dòng)物主要致病弧菌研究進(jìn)展［J］.中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2018，8（2）：49-56.

［6］桑士田，閆喜武，楊鵬，等.菲律賓蛤仔稚貝最適生長環(huán)境條件的響應(yīng)面法分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36（9）：1410-1417.

［7］Joshy A，Sharma S R K，Mini K G，et al.Histopathological evaluation of bivalves from the southwest coast of India as an indicator of environmental quality［J］.Aquatic Toxicology，2022，243：106076.

［8］Yin Z，Nie H，Jiang K，et al.Molecular mechanisms underlying Vibrio tolerance in Ruditapes philippinarum revealed by comparative transcriptome profiling［J］.Frontiers in Immunology，2022，13：879337.

［9］李園園，謝敏，劉先勝.甘露糖受體生物學(xué)功能的新進(jìn)展［J］.國際呼吸雜志，2011，31（8）：616-619.

［10］Oyanedel D，Gonzalez R，F(xiàn)lores-Herrera P，et al.Molecular characterization of an inhibitor of NF-κB in the scallop Argopecten purpuratus：first insights into its role on antimicrobial peptide regulation in a mollusk［J］.Fish & Shellfish Immunology，2016，52：85-93.

［11］Li Y，Sun J，Zhang Y，et al.CgRel involved in antibacterial immunity by regulating the production of CgIL17s and CgBigDef1 in the Pacific oyster Crassostrea gigas［J］.Fish & Shellfish Immunology，2020，97：474-482.

［12］趙建民.扇貝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆與重組表達(dá)［D］.青島：中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所），2006.

［13］González R，Brokordt K，Cárcamo C B，et al.Molecular characterization and protein localization of the antimicrobial peptide big defensin from the scallop Argopecten purpuratus after Vibrio splendidus challenge［J］.Fish & Shellfish Immunology，2017，68：173-179.

［14］楊子彥.三角帆蚌肽聚糖識(shí)別蛋白和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的基因克隆和功能分析［D］.武漢：華中科技大學(xué)，2013.

［15］Su J，Ni D，Song L，et al.Molecular cloning and characterization of a short type peptidoglycan recognition protein（CfPGRP-S1）cDNA from Zhikong scallop Chlamys farreri［J］.Fish & Shellfish Immunology，2007，23（3）：646-656.

［16］隋立軍，劉衛(wèi)東，李云峰，等.文蛤C1q基因的克隆與表達(dá)及其重組蛋白活性的研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2012，31（6）：321-328.

［17］王銳.蛤仔（Ruditapes philippinarum）噬菌體型溶菌酶基因的克隆及表達(dá)分析［D］.大連：大連海洋大學(xué)，2014.