基于種實表型性狀和SSR標(biāo)記的杉木2代種子園遺傳多樣性分析

摘 要：【目的】從表型和分子2個角度評估江西信豐縣國家杉木良種基地杉木2代種子園的遺傳多樣性，明確種子園的遺傳背景，為后期種子園的改良（去劣疏伐）、重建（親本選擇與配置）等提供依據(jù)，同時為開展雜交育種提供遺傳信息?！痉椒ā恳越餍咆S杉木2代種子園內(nèi)51個建園無性系為研究對象，通過分析8個種實表型性狀掌握種子園不同無性系間種實性狀的差異，同時利用SSR標(biāo)記從DNA水平進(jìn)行遺傳多樣性評估?！窘Y(jié)果】供試51個無性系在種實表型性狀和DNA水平上均存在明顯的變異和較豐富的遺傳多樣性。8個表型性狀變異系數(shù)為10.53%～37.04%，其中球果和種子的平均變異系數(shù)分別為18.99%和14.01%，種子的變異系數(shù)較小，表明種子的穩(wěn)定性要比球果的高；種實性狀的Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)平均為2.060，表明種實性狀的多樣性較豐富。在DNA水平，14個SSR標(biāo)記在51個無性系中共擴(kuò)增出68個等位位點(diǎn)，平均Shannon’s信息指數(shù)、平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、平均觀測雜合度和平均期望雜合度分別為0.925、0.506、0.486和0.511，表明信豐杉木2代種子園遺傳多樣性較豐富?；诜N實表型性狀和SSR標(biāo)記均可將51個無性系分為兩大類群，但兩者的具體聚類結(jié)果存在較大差異，Mantel檢驗顯示種實性狀與SSR標(biāo)記之間不存在相關(guān)性（r=0.064，P=0.870>0.05）?！窘Y(jié)論】信豐杉木2代種子園遺傳多樣性較豐富，具有再選擇空間和改良潛力。

關(guān)鍵詞：杉木；種子園；種實性狀；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號：S791.27 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）04-0159-10

基金項目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2022YFD2200201-04）、江西省重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（20223BBF61005）、江西省林業(yè)科技創(chuàng)新項目（202111，202112）。

Genetic diversity analysis of 2-generation seed orchard of Cunninghamia lanceolata based on phenotypic cone and seed traits and SSR marker

LENG Chunhui1， LOU Yongfeng1， XIE Sanxiu2， ZHU Kefan2， SONG Xiaochen1， XIAO Fuming1

（1. Jiangxi Academy of Forestry， Nanchang 330013， Jiangxi， China； 2. Xinfeng County Seed Farm， Xinfeng 341602， Jiangxi， China）

Abstract：【Objective】To evaluate the level of genetic diversity and genetic background of 2-generation seed orchard of Cunninghamia lanceolata based on phenotypic cone and seed traits and SSR marker， and provide a basis for the improvement， reestablishment of seed orchard， meanwhile provide the genetic information for crossbreeding.【Method】The 2-generation seed orchard of C. lanceolata at Xinfeng forest farm were used to analyze their difference in the cone and seed by phenotypic traits， and to analyze their genetic diversity by SSR markers.【Result】There were high levels of genetic diversity existed in 2-generation seed orchard. The coefficients of variation of the 8 phenotypic traits ranged from 10.53% to 37.04%， the variation coefficients of cone and seed phenotypic traits were 18.99% and 14.01%， respectively. The stability of cone was lower than that of seed. The mean Shannon-Wiener index of phenotypic cone and seed traits was 2.060， indicating that the diversity of cone and seed traits was abundant. A total of 68 alleles were detected in 51 clones using 14 SSR markers， the means of Shannon’s information index， Nei’s genetic diversity index， observed heterozygosity， and expected heterozygosity were 0.925， 0.506， 0.486， and 0.511， respectively. It indicated that the genetic diversity of 2-generation seed orchard of C. lanceolata at Xinfeng forest farm was high. Both phenotypic trait analysis and the SSR marker analysis classified the 51 clones into two groups， however， there was no correlation between them by mantel test （r=-0.064， P=0.870>0.05）， which mean the results obtained by the two methods were different.【Conclusion】There were abundant genetic diversity with re-selected spaces and potential of genetic improvement in 2-generation seed orchard in Xinfeng.

Keywords： Chinese fir； seed orchard； cone and seed traits； SSR marker； genetic diversity

杉木是我國重要的鄉(xiāng)土針葉商品材樹種，主要分布于我國長江流域、秦嶺以南地區(qū)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和生態(tài)價值[1]。作為全國杉木主要產(chǎn)區(qū)，江西現(xiàn)有杉木人工林面積258.67萬hm2，是江西森林資源的重要組成部分。20世紀(jì)70年代起，江西省林業(yè)科學(xué)院開始江西杉木的遺傳改良工作，為杉木人工林的質(zhì)量提升提供物質(zhì)基礎(chǔ)。種子園是林木遺傳改良研究的階段性成果，營建種子園的首要目的是獲得有較高遺傳增益的種子（子代），而種子園遺傳多樣性是其種子（子代）獲得較高遺傳增益的保障，同時種子園遺傳多樣性可以保證其所生產(chǎn)的子代具有寬廣遺傳基礎(chǔ)和一定的遺傳多樣性，以便子代具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力[2-4]。因此，種子園遺傳多樣性的豐富程度一直是林木育種者所關(guān)注的問題。

表型性狀和分子標(biāo)記是現(xiàn)階段研究林木遺傳多樣性的兩種常用方法[5-6]。植物表型性狀是了解遺傳變異的重要線索，具有操作簡單、直觀、便于觀察等優(yōu)點(diǎn)[7]。其中，相對于植物葉片等營養(yǎng)器官表型性狀，種實等生殖器官表型性狀受環(huán)境影響較小，表型變異的穩(wěn)定性相對較高[7-8]。目前種實表型性狀已被廣泛應(yīng)用于楓香Liquidambar formosana[8]、無患子Sapindus mukurossi Gaertn.[9]、香椿Toona sinensis[10]、樟樹Cinnamomum camphora[11]、梓葉槭Acer catalpifolium[12]、杜仲Eucommia ulmoides[13]等林木遺傳多樣性研究。分子標(biāo)記表現(xiàn)的是DNA水平的遺傳多樣性，相對于表型性狀不受環(huán)境因素的影響、更加準(zhǔn)確。其中，SSR標(biāo)記因具有共顯性遺傳、多態(tài)性豐富、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，在杉木[14-16]、胡桃楸Juglans mandshurica[17]、楓香[18]、檫木Sassafras tzumu[19]等林木遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用。

目前，雖然表型性狀和分子標(biāo)記已被用于杉木種子園遺傳多樣性的研究中，但報道不多。陳仕昌等[20]、程琳等[21]通過種實性狀分別對廣西融水貝江河林場1.5代和2代杉木種子園遺傳多樣性進(jìn)行了研究。方月等[22]利用SSR標(biāo)記對四川洪雅國家杉木良種基地2代及2.5代杉木種子園遺傳多樣性進(jìn)行了評估。婁永峰等[23]通過SSR標(biāo)記分析江西地方特色杉木種子園-陳山紅心杉種子園遺傳多樣性。此外，目前關(guān)于杉木遺傳多樣性研究多采用單一的分子標(biāo)記或表型性狀，鮮見兩者聯(lián)合采用[20-23]。鑒于此，本研究以江西信豐縣國家杉木良種基地杉木2代種子園為對象，對其進(jìn)行種實表型性狀的觀測分析，并結(jié)合SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析，旨在全面準(zhǔn)確地評估種子園遺傳基礎(chǔ)，為后期育種策略的制定和遺傳改良的可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

本研究選用江西信豐縣國家杉木良種基地杉木2代種子園51個建園無性系作為研究材料。51個無性系來源（表1）：SY01、SY12等10個無性系由贛州市森源科技種苗場選育而來；XF01、XF02等13個無性系由信豐縣林木良種場在信豐1代種子園的子代林進(jìn)行優(yōu)樹選擇而來；AF18、BTF09等28個無性系由江西省種苗站組織在江西的1代種子園子代林、優(yōu)良林分進(jìn)行優(yōu)樹選擇而來。取當(dāng)年生枝條頂端幼嫩部分，放入自封袋中，用冰盒帶回實驗室，置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

1.2 方 法

1.2.1 杉木種實表型性狀測定

于2022年10—11月杉木球果成熟時期，在江西信豐縣國家杉木良種基地杉木2代種子園（簡稱信豐杉木2代種子園）進(jìn)行不同無性系球果的分號采摘。球果采摘時，每個無性系采摘植株一般不少于5株。采摘后，將同一無性系的不同單株球果充分混勻，按四分法隨機(jī)選取40顆球果，做好標(biāo)記，裝袋保鮮，帶回進(jìn)行球果表型性狀測定。

對球果進(jìn)行烘干脫粒處理并獲取種子，置于陰涼通風(fēng)處，待自然風(fēng)干后，每個無性系按四分法隨機(jī)選擇40粒種子進(jìn)行種子表型性狀測定。

球果表型性狀測定：在種鱗未開裂前，使用游標(biāo)卡尺測量球果的果長（Cone vertical diameter，CVD）和果寬（Cone horizontal diameter，CHD），并計算果形指數(shù)（Fruit shape index，F(xiàn)SI）=果長/果寬；采摘當(dāng)天，使用電子天平測定單個球果重量（Cone weight，CW）。

種子表型性狀測定：用游標(biāo)卡尺測量種子的長度（Seed length，SL）和寬度（Seed width，SW），并計算種形指數(shù)（Seed shape index，SSI）=種長/種寬；千粒重（Thousand-grain weight，TGW）采用電子天平稱量1 000粒干燥種子，重復(fù)4次。

1.2.2 提取DNA與SSR分析

采用CTAB法提取杉木基因組DNA。提取的杉木基因組DNA，用BioSpectrometer basic完成DNA的質(zhì)量和濃度的檢測，定量至約20～30.0 ng·μL-1，于-20 ℃冰箱保存、備用。

參照婁永峰等[23]的研究結(jié)果，篩選14對SSR引物進(jìn)行分析。SSR-PCR擴(kuò)增體系（20.0 μL）：DNA模板2.0 μL，正向游引物和反向引物各0.5 μL，2×Taq plus PCR Master Mix 10.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保存。熒光引物擴(kuò)增產(chǎn)物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行微衛(wèi)星分型分析。

1.2.3 表型性狀數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件對表型性狀進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，并計算各無性系間的歐式遺傳距離進(jìn)行聚類分析。

1.2.4 SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 種實表型性狀

2.1.1 表型性狀的基本統(tǒng)計和變異分析

對信豐杉木2代種子園51個建園無性系8個種實表型性狀，包括6個直接數(shù)量性狀（果長、果寬、球果重量、種長、種寬和千粒重）和2個轉(zhuǎn)換數(shù)量性狀（果形指數(shù)和種型指數(shù)）進(jìn)行統(tǒng)計分析。由表2可知，8個種實表型性狀的變異系數(shù)為10.53%～37.04%，平均值為16.50%；8個表型性狀中，球果重量變異系數(shù)最大，為37.04%；其次是種子的千粒重，為18.23%；果形指數(shù)的變異系數(shù)最小，為10.53%；同時球果表型性狀的變異系數(shù)（18.99%）大于種子的（14.01%）。以上表型性狀數(shù)據(jù)表明，信豐杉木2代種子園球果和種子具有廣泛的變異，且與種子相比，球果的變異范圍更大，變異程度更高，即種子的穩(wěn)定性比球果的高。

2.1.2 表型性狀的多樣性分析

Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)一般用于估算群落多樣性高低，數(shù)值越大表示多樣性越豐富。由表2可知，8個種實表型性狀的Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)在2.004～2.088之間，平均值為2.060；以球果果長的最高，為2.088；種子種形指數(shù)的最低，為2.004。與種子相比，球果的平均Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)較高（2.059 vs 2.052），這說明球果的遺傳多樣性比種子更豐富。

2.1.3 相關(guān)性分析

8個種實表型性狀的Pearson相關(guān)分析結(jié)果如表3所示，6個直接數(shù)量性狀（球果果長、果寬、球果重量和種子種長、種寬和千粒重）相互間存在極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r在0.113～0.785之間；轉(zhuǎn)換數(shù)量性狀果形指數(shù)與球果果長、球果重量間存在極顯著正相關(guān)（r分別為0.519、0.149），與果寬間存在極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.182），與種子種長、種寬、千粒重間不存在相關(guān)性；轉(zhuǎn)換數(shù)量性狀種形指數(shù)與種長間存在極顯著正相關(guān)（r=0.407），與種寬間存在極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.630），與球果果長、果寬、球果重量間不存在相關(guān)性。以上結(jié)果表明，8個種實表型性狀間具有一定的相關(guān)性。

2.1.4 表型性狀聚類分析

由圖1可知，在歐式遺傳距離閾值9.0時，8個種實表型性狀將信豐杉木2代種子園51個無性系分成2個類群：I和II。其中，類群I的主要類群，包含SY01、SY21、SM67等43個無性系，占84.3%。類群II包含SY12、XF02、YB11等8個無性系。在歐式遺傳距離閾值5.5時，對于類群I可進(jìn)一步分成2個亞群：I-1和I-2。亞群I-1主要由SY01、SY21、SM67等20個無性系構(gòu)成；亞群I-2主要由SY18、XF04、GB107等23個無性系構(gòu)成。結(jié)合種實表型性狀大小及排名（圖1），發(fā)現(xiàn)類群II主要是小果型無性系，即球果果長、果寬和球果重量均較小，排名較低；而類群I的I-1亞群主要是大型無性系，即球果果長、果寬和球果重量均較大，排名較高。

2.2 SSR標(biāo)記

2.2.1 SSR引物的多態(tài)性及51個無性系的遺傳多樣性分析

采用選擇的14對引物對信豐杉木2代種子園 51個無性系的遺傳多樣性進(jìn)行分析，由表4可知，14對引物均具有多態(tài)性，共檢測到68個等位位點(diǎn)，每個引物檢測到3～11個，平均為4.86個。其中引物CLSSR38和H008檢測到的等位位點(diǎn)最少，均為3個；而CLSSR09檢測到的等位位點(diǎn)最多，為11個。各引物的有效等位基因數(shù)變化范圍為1.501～3.326，平均有效等位基因數(shù)為2.105，有效等位基因比例為63.29%。各引物的多態(tài)性信息含量變化范圍在0.308～0.652之間，平均值為0.446，其中，PIC值最高的引物為H097（0.652），PIC值最低的引物為CLSSR20（0.308），且14對引物的PIC值均高于0.25，為中度或高度多態(tài)性信息引物。供試信豐杉木2代種子園51個無性系的Shannon′s信息指數(shù)為0.650～1.409，平均值為0.925；Nei′s遺傳多樣性指數(shù)為0.334～0.699，平均值為0.506；觀測雜合度為0.235～0.706，平均值為0.486；期望雜合度為0.337～0.706，平均值為0.511；平均觀測雜合度低于平均期望雜合度。以上信息表明信豐杉木2代種子園遺傳多樣性較豐富。

2.2.2 遺傳相似性分析

對信豐杉木2代種子園51個無性系的Nei′s遺傳距離和相似性系數(shù)進(jìn)行分析（圖2）。51個無性系遺傳相似性系數(shù)分布在0.333～0.954之間，平均遺傳相似性系數(shù)為0.646。SY21和TZ18間的遺傳相似性系數(shù)最大（0.954），說明它們遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近，而SY34與BTF14及YB11間的遺傳相似系數(shù)最小（0.333），說明它們遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.2.3 SSR標(biāo)記聚類分析

基于SSR標(biāo)記的Nei′s遺傳距離遺傳進(jìn)行UPGMA聚類分析。由圖3可知，在遺傳距離0.65時，51個無性系可分為2個類群：I和II。其中類群I是最大的類群，包含SY01、BTF09、DBZ40等47個無性系，其可進(jìn)一步分為4個亞群：I-1、 I-2、I-3和I-4；亞群I-1有SY01、BTF09等10個無性系；亞群I-2有SY12、SY18等24個無性系；亞群I-3有SY27、CM05等12個無性系；亞群I-4只有1個無性系：XF09。類群III包含SY28、SY34、QX200和QX194等4個無性系。

結(jié)合地理種源，發(fā)現(xiàn)信豐杉木2代種子園中部分相同地理種源的無性系未優(yōu)先地聚在一起或未聚到同一類。如QX23、QX194、QX200、QZ12、QZ21、QZ30和QZ39均屬于江西全南縣種源，其中QX系列是20世紀(jì)70年代從全南縣小葉崠林場選育的優(yōu)樹，而QZ系列則是全南縣兆坑林場選育，但其未聚在同一類，表明這些相同地理種源的無性系在分子標(biāo)記水平上的遺傳差異較大。

2.3 兩種聚類方法的比較

基于表型性狀和SSR標(biāo)記均可將51個無性系分為2類，但從具體聚類結(jié)果分析來看，兩者存在較大差異，如在分子標(biāo)記水平上SY21和TZ18間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近，緊密地聚在一起，但在表型性狀水平中兩者卻并不緊密，未聚在一起；SY27與DBZ35及DBZ40在表型性狀水平上聚在一起，具有相似的表型性狀，但在分子標(biāo)記水平上并未聚在一起。

為了進(jìn)一步探討表型性狀聚類與SSR標(biāo)記聚類結(jié)果的關(guān)系，對SSR標(biāo)記的Nei′s遺傳距離矩陣和表型性狀的歐氏距離矩陣進(jìn)行Mantel檢驗分析，兩者之間不存在相關(guān)性（r=0.064，P=0.870>0.05），這也表明表型性狀聚類和SSR標(biāo)記聚類結(jié)果的吻合度不高。

3 討 論

種子園遺傳多樣性研究是林木育種工作的重要環(huán)節(jié)，明確種子園的遺傳背景，不但有利于種子園后續(xù)的改良（去劣疏伐）或重建（親本選配），同時也利于開展雜交育種和新種質(zhì)創(chuàng)制[4，24-25]。本研究觀測了信豐杉木2代種子園51個建園無性系8個種實表型性狀，并結(jié)合表型和SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析。結(jié)果8個種實表型性狀的變異系數(shù)為10.53%～37.04%，平均為16.50%，說明信豐杉木2代種子園建園無性系的種實性狀遺傳變異較豐富，具有較好的遺傳改良潛力；Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)在2.004～2.088，平均為2.060；說明其遺傳多樣性較豐富。8個種實表型性狀中差異最大的是球果重量，單個球果重量變異系數(shù)高達(dá)37.04%；差異最小的是果形指數(shù)，這與李永祥等[26]研究的無患子優(yōu)樹種實性狀變異結(jié)論相似，也與白曉倩等[6]的板栗Castanea mollissima Bl. 堅果單粒重量變異系數(shù)較大，果形指數(shù)變異系數(shù)最小的研究結(jié)果一致。

目前杉木種子園親本選擇主要是選擇生長健壯、遺傳品質(zhì)好的建園無性系，目標(biāo)性狀主要是生長性狀，忽視了結(jié)實量和種實性狀等。然而，有研究表明杉木種子園不同無性系間的結(jié)實量和種實性狀也存在顯著差異，且結(jié)實量和種實性狀在優(yōu)樹間也存在變異，建園無性系的選擇除需要考慮生長性狀外，還需考慮結(jié)實量和種實性狀[20-21，27]。本研究中信豐杉木2代種子園建園無性系的種實性狀變異系數(shù)均大于10%，遺傳多樣性豐富，具有一定的選擇空間。杉木種子園“大小年”現(xiàn)象比較明顯，且其種實表型性狀在“大小年”間存在較大的差異。本研究尚未對種子園的種實表型性狀進(jìn)行多年分析比較，表型性狀遺傳多樣性結(jié)果僅能作為參考，需要長期連續(xù)觀測。

基于表型性狀容易受外部環(huán)境影響，在某些情況下并不能反映遺傳變異的真實狀況[5]。本研究同時利用SSR標(biāo)記從DNA角度進(jìn)行遺傳多樣性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，信豐杉木2代種子園的Shannon′s信息指數(shù)為0.925，Nei′s遺傳多樣性指數(shù)為0.506；陳仕昌等[28]對廣西融水縣貝江河林場1.5代杉木種子園30個無性系進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，顯示其Shannon′s信息指數(shù)為0.832 4，Nei′s遺傳多樣性指數(shù)0.475 5，均低于本研究結(jié)果。方月等[22]對四川洪雅國家杉木良種基地2代及2.5代杉木種子園遺傳多樣性評估，結(jié)果顯示2代及2.5代種子園的Shannon′s信息指數(shù)分別為1.213和1.164，高于本研究結(jié)果。因此，信豐杉木2代種子園具有較豐富的遺傳多樣性。

通過聚類分析，基于表型性狀和SSR標(biāo)記均可將51個無性系分為2大類，但從具體聚類結(jié)果分析來看，兩者的分類存在較大差異。在油橄欖Olea europaea[29]、黃心樹Machilus gamblei[30]、東北杏Armeniaca mandshurica[31]等植物的研究中也存在表型性狀聚類和分子標(biāo)記聚類結(jié)果不一致的情況。這可能是由于表型性狀同時受基因和環(huán)境的影響，控制表型性狀的等位基因引起的表型性狀差異和潛在的遺傳差異并不一致[29-32]，或者本試驗中選擇的種實表型性狀與SSR引物的多態(tài)位點(diǎn)不存在關(guān)系。在今后的研究中將通過選取與種實表型性狀相對應(yīng)的SSR引物并進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，為分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過種實表型性狀變異和SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)信豐杉木2代種子園51個無性系存在較豐富的遺傳多樣性。種實性狀遺傳變異較豐富，說明信豐杉木2代種子園建園無性系具有較高的再選擇空間，在種實性狀方面具有較好的遺傳改良潛力。同時SSR標(biāo)記分析有助于為今后種子園內(nèi)進(jìn)行的雜交親本選配工作。

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[本文編校：羅 列]