塔形栓皮櫟體胚增殖與成熟的影響因素

摘 要：【目的】探究各因素在塔形栓皮櫟體細(xì)胞胚的發(fā)育與成熟過程中的影響作用強(qiáng)弱，進(jìn)一步完善塔形栓皮櫟的體胚發(fā)生體系?！痉椒ā恳运嗡ㄆ岛献优哒T導(dǎo)得到的胚性愈傷組織為材料，對影響塔形栓皮櫟體胚增殖、成熟的主要因素進(jìn)行探索：利用單因素試驗(yàn)篩選適合塔形栓皮櫟體胚增殖的光照條件（強(qiáng)光、弱光、無光）、激素的種類（萘乙酸（NAA）、細(xì)胞分裂素6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、生長素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）；對影響體胚增殖的激素濃度及配比分別進(jìn)行雙因素試驗(yàn)分析；對影響體胚成熟的蔗糖濃度、活性炭濃度、ABA濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析；最后對影響體胚成熟的激素濃度及配比進(jìn)行雙因素試驗(yàn)分析?！窘Y(jié)果】1）三種不同光照強(qiáng)度中，強(qiáng)光環(huán)境下體胚增殖誘導(dǎo)率最高；2）不同植物激素配比對體胚增殖現(xiàn)象存在顯著差異，0.10 mg/L 2，4-D與0.80 mg/L 6-BA增殖率最高為83.33%；3）蔗糖濃度為5.00%時(shí)，體胚的成熟率最高為77.80%；ABA濃度0.50 mg/L 時(shí)，成熟率可達(dá)到最高為50.00%；活性炭濃度為1.00 g/L時(shí)，長勢良好，成熟率達(dá)到57.10%；4）NAA與6-BA濃度同時(shí)為0.25 mg/L時(shí)，體胚的成熟率最高可達(dá)90.50%?！窘Y(jié)論】1）塔形栓皮櫟體胚在強(qiáng)光環(huán)境下增殖效果較好；2）最佳增殖培養(yǎng)基為：MS+（6.0 g/L）瓊脂+（3.00%）蔗糖+2，4-D（0.10 mg/L）+6-BA（0.80 mg/L）；3）最佳成熟培養(yǎng)基為：MS+（7.0 g/L）瓊脂+（5.00%）蔗糖+NAA（0.25 mg/L）+6-BA（0.50 mg/L）+ ABA（0.50 mg/L）+活性炭（1.50 g/L）。

關(guān)鍵詞：塔形栓皮櫟；增殖；成熟；激素濃度；蔗糖濃度

中圖分類號(hào)：S792.18 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2024）04-0058-08

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0600602-03）；中央級公益性科研項(xiàng)目（CAFYBB2018ZB001-11）。

Embryo proliferation and maturation culture of Quercus variabilis Blume var. pyramidalis

ZHANG Wan1，2， REN Yue1，2， ZHU Jingle1，2， LIU Xueming3， XIAO Xiangwei3， KE Shuyin3， HOU Xiaoya1，2

（1. Henan Agricultural University， Zhengzhou 450003， Henan， China； 2. Research Institute of Non-timber Forestry， Chinese Academy of Forestry， Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Innovation and Utilization， State Forestry and grassland administration， Zhengzhou 450003， Henan， China； 3. State-owned Tian Mu Mountain Forest Farm， Ping Qiao District， Xinyang 46400， Henan， China）

Abstract：【Objective】In order to explore the influence of various factors on the development and maturation of Quercus variabilis Blume var. pyramidalis embryo， and further improve the embryogenesis system of Q. variabilis Blume var. pyramidalis.【Method】The main factors affecting the proliferation and maturation of Q. variabilis Blume var. pyramidalis embryo were explored by using the embryonic callus induced by Q. variabilis Blume var. pyramidalis embryo as materials： single-factor experiments were used to screen the types of light conditions （strong light， weak light， no light） and hormones （naphthaleneacetic acid （NAA）， cytokinin 6-benzylaminopurine（6-BA）， auxin 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D）） suitable for the proliferation of Q. variabilis Blume var. pyramidalis embryo. The concentration and ratio of hormones affecting embryonic proliferation were analyzed by two-factor tests. Univariate experimental analysis was carried out on sucrose concentration， activated carbon concentration and ABA concentration affecting embryo maturation. Finally， a two-factor test was carried out on the concentration and ratio of hormones affecting embryonic proliferation.【Result】1） Among three different light intensities， the induction rate of embryonic proliferation was the highest in the strong light environment； 2） There were significant differences in the proliferation of embryos by different plant hormone ratios， with the highest proliferation rate of 83.33% with 0.10 mg/L2，4-D and 0.80 mg/L 6-BA； 3） When the sucrose concentration was 5.00%， the maturity rate of the embryo was the highest which was 77.80%； When the ABA concentration was 0.50 mg/L， the maturity rate reached up to 50.00%； When the concentration of activated carbon was 1.00g/L， the growth was good， and the maturity rate reached 57.10%； 4） When the concentration of NAA and 6-BA was 0.25 mg/L at the same time， the maturity rate of embryo reached up to 90.50%.【Conclusion】1） The body embryo of Q. variabilis Blume var. pyramidalis has a good proliferation effect in a strong light environment； 2） The optimal proliferation medium is： MS + （6.0 g/L） agar + （3.00%） sucrose + 2，4-D （0.10 mg/L） + 6-BA （0.80 mg/L）； 3） The optimal maturation medium is： MS+（7.0 g/L） agar + （5.00%） sucrose + NAA （0.25 mg/L） + 6-BA （0.50 mg/L） + ABA （0.50 mg/L） + activated carbon （1.50 g/L）.

Keywords： Quercus variabilis Blume var. pyramidalis； proliferation； maturation； hormone concentration； sucrose concentration

栓皮櫟Quercus variabilis L.，屬殼斗科Fagaceae櫟屬Q(mào)uercus L.植物，是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種和水土保持樹種，具有根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)、固沙固土能力較好等特點(diǎn)，多用于闊葉林造林[1]，同時(shí)也因其可重復(fù)栓皮而作為重要的用材樹種[2]。塔形栓皮櫟Quercus variabilis Blume var. pyramidalis，產(chǎn)于河南南召[3]，是栓皮櫟一個(gè)變種，該變種與原種不同之處在于，其樹冠呈塔形，枝葉濃密，樹體主干與側(cè)枝展開的角度約20°～25°，可用于營造防風(fēng)林、水源涵養(yǎng)林及防護(hù)林[4]。但因其種子產(chǎn)量低且不耐貯藏，扦插難以生根，組織培養(yǎng)存在污染率高、褐化嚴(yán)重、增殖芽伸長困難等問題，苗木繁育效率較低，優(yōu)良基因型難以通過常規(guī)方法進(jìn)行繁育[5]。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是在離體培養(yǎng)條件下，植物離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官可以產(chǎn)生類似于胚的結(jié)構(gòu)，其形成過程也經(jīng)歷一個(gè)類似于胚胎發(fā)生和發(fā)育的過程[6]。繼1982 年 Q.leban 體胚發(fā)生報(bào)道之后，以未成熟合子胚、葉片等為外植體進(jìn)行櫟屬植物體胚發(fā)生和植株再生的研究逐年增加[7]。目前國內(nèi)外已有包括紅櫟Q. rubra L.[8]、夏櫟[9]、歐洲栓皮櫟[10]、麻櫟Q. acutissima Carruth.[11]、冬青櫟[12]、栓皮櫟[13]、遼東櫟Q. wutaishansea Mary[14]、川滇高山櫟Q. aquifolioides[15]、蒙古櫟Q. mongolica Fisch. ex Ledeb.[16]等在內(nèi)的多種櫟屬植物成功誘導(dǎo)體胚。按照體胚發(fā)生的階段不同，可將體胚分為誘導(dǎo)、增殖、成熟、萌發(fā)四個(gè)階段。體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)作為植物無性繁殖技術(shù)的一個(gè)新進(jìn)展，它可以從未成熟胚、成熟胚、子葉中獲得胚性愈傷組織，進(jìn)而分化發(fā)育成大量無性繁殖體，類似于種子胚發(fā)育成植株的過程[17]。因具有相對的遺傳穩(wěn)定性、可重復(fù)性和高效性等優(yōu)點(diǎn)，是解決繁殖困難且周期長的木本植物快速繁殖的重要途徑。不同物種不同外植體培養(yǎng)條件不同[18–20]，研究以塔形栓皮櫟合子胚誘導(dǎo)得到的胚性愈傷組織為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，探究激素濃度組合、光照對增殖誘導(dǎo)影響；蔗糖、激素濃度配比、ABA 濃度、活性炭對成熟培養(yǎng)的影響，確定體胚增殖及成熟的適宜培養(yǎng)條件，進(jìn)一步完善塔形栓皮櫟體胚發(fā)生體系，探究體細(xì)胞胚的發(fā)育與成熟過程中的影響因素，為塔形栓皮櫟優(yōu)良種質(zhì)資源的長期保存和規(guī)?；庇於ɑA(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

于河南南召采集得到的塔形栓皮櫟未成熟合子胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+1.00 mg·L-1 6-BA+ 0.50 mg·L-1 2，4-D+1.50 g·L-1 PVP+30 g·L-1蔗糖+6.00 g·L-1瓊脂黑暗培養(yǎng)，選取生長健壯，顏色為淡黃色、乳白色半透明或透明，生長一致的胚性愈傷組織用于增殖培養(yǎng)。

1.1.2 基本培養(yǎng)基配置

試驗(yàn)過程中所用培養(yǎng)基均在高溫高壓滅菌前將pH值調(diào)節(jié)至5.8（滅菌溫度為121 ℃、時(shí)間為20 min），ABA為培養(yǎng)基滅菌后冷卻至約50 ℃，用0.22微摩爾孔隙的濾器過濾滅菌加入。接種后培養(yǎng)物均放于培養(yǎng)室中24±1 ℃培養(yǎng)。

1.2 胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)方法

1.2.1 激素種類、濃度及配比設(shè)置

以生長一致的胚性愈傷組織為材料，因素1為6-BA濃度（0.10、0.25、0.50 mg·L-1三個(gè)水平）因素2為2，4-D濃度（0.10、0.50 mg·L-1兩個(gè)水平），進(jìn)行全因素試驗(yàn)（圖1），分別接種于添加表1激素組合的培養(yǎng)基中。共8個(gè)處理，每個(gè)處理3盤培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿30個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次，4周后統(tǒng)計(jì)體胚增殖系數(shù)。

1.2.2 光照條件設(shè)置

以MS+蔗糖（3.00%）+瓊脂（6.00 g·L-1）+6-BA（0.50 mg·L-1）+NAA（0.50 mg·L-1）為基本培養(yǎng)基，分別放入強(qiáng)光（1 200 lx）、弱光（500 lx）、無光3種不同光照環(huán)境下進(jìn)行單因素增殖誘導(dǎo)試驗(yàn)，共3個(gè)處理，每個(gè)處理3盤培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿30個(gè)外植體，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每周觀察一次體胚變化，30 d后觀察體胚增殖情況。

1.3 體胚成熟培養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1 蔗糖濃度設(shè)置

以MS+瓊脂（6.00 g·L-1）+PVP（0.50 mg·L-1）為基本培養(yǎng)基，設(shè)置4個(gè)水平的蔗糖濃度（3.00%、4.00%、5.00%、6.00%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。選取長勢一致且良好的子葉期胚，接種于以上4種培養(yǎng)基，每個(gè)處理2盤培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)接5個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次，每周觀察一次胚體變化，30 d后統(tǒng)計(jì)體胚成熟、再生率和畸形率。

1.3.2 激素濃度及配比設(shè)置

以MS+瓊脂（6.00 g·L-1）+PVP（0.50 mg·L-1）+蔗糖（5.00%）為培養(yǎng)基，因素1為NAA濃度（0.25、0.50 mg·L-1兩個(gè)水平），因素2為6-BA濃度（0.10、0.25、0.50 mg·L-1三個(gè)水平）進(jìn)行全因素試驗(yàn)，共6個(gè)處理如表2，每個(gè)處理2盤培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)接5個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次，每周觀察一次胚體變化，30 d后統(tǒng)計(jì)體胚成熟、再生率和畸形率。

1.3.3 不同ABA濃度設(shè)置

以MS+瓊脂（6.00 g·L-1）+PVP（0.50 mg·L-1）+蔗糖（5.00%）+6-BA（0.50 mg·L-1）為培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)水平的ABA濃度（0.50、10、1.50 mg/L）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，共3個(gè)處理，每個(gè)處理2盤培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)接5個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3次，每周觀察一次胚體變化，30 d后統(tǒng)計(jì)體胚成熟、再生率和畸形率。

1.3.4 不同活性炭濃度設(shè)置

以MS+瓊脂（6.00 g·L-1）+PVP（0.50 mg·L-1）+蔗糖（5.00%）為培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)水平的活性炭濃度（0.00、1.00、2.00 g·L-1）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，共3個(gè)處理，每個(gè)處理2盤培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)接5個(gè)外植體，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每周觀察一次胚體變化，30 d后統(tǒng)計(jì)體胚成熟率、再生率和畸形率。

1.4 培養(yǎng)條件及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

體胚增殖、體胚成熟等階段以90 mm一次性培養(yǎng)皿為培養(yǎng)器材。所有處理沒有備注培養(yǎng)環(huán)境情況下，均在25±2 ℃，16 h光照下進(jìn)行培養(yǎng)。采用Excel 2003軟件記錄統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，百分比數(shù)據(jù)處理前首先進(jìn)行反正弦變換。采用SPSS24軟件統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，采用Origin2021軟件進(jìn)行圖表繪制。主要計(jì)算公式如下：

體胚增殖率=體胚增殖數(shù)/供體胚增殖試驗(yàn)總數(shù)×100%；

體胚成熟率=成熟體胚數(shù)/供成熟試驗(yàn)體胚總數(shù)×100%；

體胚畸形胚率=成熟體胚中的畸形體胚總數(shù)/供成熟試驗(yàn)體胚總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 塔形栓皮櫟胚性愈傷組織增殖結(jié)果

2.1.1 不同激素配比對塔形栓皮櫟胚性愈傷組織增殖的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度組合對塔形栓皮櫟增殖的影響結(jié)果見表3，激素的配比對體胚增殖現(xiàn)象存在顯著差異（P<0.05）。當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著2，4-D濃度升高，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，但體胚的褐化數(shù)量逐漸增加，2，4-D濃度為0.10 mg·L-1其增殖效果較好。添加不同濃度的6-BA，絕大多數(shù)體胚發(fā)生增殖，30 d時(shí)部分體胚進(jìn)入心形胚期和子葉胚期，但隨著6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)2，4-D濃度為 0.10 mg·L-1，6-BA濃度為0.80 mg·L-1時(shí)，體胚增殖系數(shù)最高為83.33%，且褐化率最低為30.67%，此時(shí)體胚形態(tài)良好。因此將0.10 mg·L-1 2，4-D、0.80 mg·L-1 6-BA作為愈傷組織增殖的培養(yǎng)基，既能保證愈傷組織的較大增殖率，又能保持胚性愈傷組織的新鮮活力。

2.1.2 光照條件對體胚增殖的影響

光照對塔形栓皮櫟增殖的影響結(jié)果見圖2，不同光環(huán)境對體胚增殖存在顯著差異（P<0.05）。相同處理下，塔形栓皮櫟在強(qiáng)光（1 200 lx）環(huán)境下，其體細(xì)胞胚團(tuán)多為呈淡黃色的堅(jiān)硬易碎圓球形顆粒（圖1A），此時(shí)體胚增殖誘導(dǎo)率最高（圖2），愈傷組織在不斷的形成新的胚性愈傷組織；其次為弱光（500 lx）條件，愈傷增殖小且少，其體細(xì)胞胚團(tuán)多呈淡黃色或乳白色團(tuán)狀（圖1B），而在無光條件下，體胚呈白色透明的柔軟水乳狀，增殖效果差（圖1C）。因此，塔形栓皮櫟在強(qiáng)光條件下增殖效果更佳。

2.2 體胚成熟

2.2.1 蔗糖濃度的影響

蔗糖濃度對塔形栓皮櫟增殖的影響結(jié)果見表4，發(fā)現(xiàn)不同蔗糖濃度對體胚的成熟有顯著影響（P<0.05）。隨著蔗糖濃度的升高，再生胚率逐漸降低，畸形胚率逐漸升高，體胚的成熟率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，其中當(dāng)蔗糖濃度為5.00%時(shí)，成熟率最高為77.80%，此時(shí)體胚的個(gè)體和顏色變化較大，體胚子葉多呈乳白色或淡綠色，含水液態(tài)胚較少，但此時(shí)的畸形胚率較高為38.9%，獲得的正常胚數(shù)較少。在實(shí)際的體胚成熟過程中，應(yīng)根據(jù)需要獲得的胚性無性系，來選擇不同的蔗糖濃度。

2.2.2 不同ABA濃度的影響

在光照環(huán)境下研究發(fā)現(xiàn)，添加ABA的MS培養(yǎng)基中體胚的再生率和畸形率明顯降低。當(dāng)培養(yǎng)基中加入0.50 mg·L-1ABA時(shí)，成熟率最高可達(dá)到50.00%（表5），之后隨著ABA濃度的增加，成熟率下降，同時(shí)體胚再生率和畸形胚率也逐漸降低，但胚的褐化情況也逐漸加重；當(dāng)ABA濃度達(dá)到1.50 mg·L-1時(shí)，胚體下胚軸幾乎褐化，體胚發(fā)育效果差。

2.2.3 不同激素配比對體胚成熟培養(yǎng)的影響

添加不同濃度的NAA和6-BA的組合，對體胚成熟有顯著影響（P<0.05）。隨著6-BA濃度增加，體胚的成熟率呈先增加后下降的趨勢，但體胚再生率和畸形率也隨之增高（表6），其中添加0.25 mg·L-1的6-BA時(shí)體胚的成熟率最高可達(dá)90.50%。而NAA濃度處于較高水平時(shí)，其再生胚率及畸形胚率都顯著高于低濃度NAA，正常胚獲得的數(shù)量更少，因此，綜合考慮不同濃度激素組合對體胚成熟及正常胚獲得的誘導(dǎo)情況，添加0.25 mg·L-1NAA及0.25 mg·L-16-BA效果更佳。

2.2.4 不同濃度活性炭的影響

添加活性炭對體胚的成熟有顯著影響（P<0.05），隨著活性炭濃度增加，體胚的成熟率明顯增高，胚的再生率明顯下降，畸形率逐漸升高。當(dāng)活性炭濃度為2.00 g·L-1時(shí)，體胚的成熟率最高可達(dá)到60.00%（表7），但是這些培養(yǎng)基中的體胚子葉均出現(xiàn)異常肥大，顏色深綠色，其中部分長出的主根呈淡綠色，有早萌的現(xiàn)象，畸形胚逐漸增多，正常胚數(shù)量較少。當(dāng)活性炭濃度為1.00 g·L-1時(shí)，正常胚數(shù)量較多，成熟率為57.10%與添加2.00 g·L-1活性炭差異較小，但出現(xiàn)畸形胚數(shù)量卻顯著少于添加2.00 g·L-1活性炭，且體胚的整體生長情況較好。因此，活性炭濃度在1.00 g·L-1時(shí)對塔形栓皮櫟體胚的成熟培養(yǎng)效果更好。

3 討 論

3.1 探究影響體胚增殖的因素

胚性愈傷組織的增殖作為體胚發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一，受多種因素的影響，如培養(yǎng)基的外源激素種類、其濃度配比及培養(yǎng)條件等[21]。常用激素有NAA、2，4-D和6-BA等，其中2，4-D和6-BA 的配合使用不僅可以通過調(diào)控細(xì)胞周期的長短進(jìn)行細(xì)胞分裂，從而影響胚性胚柄團(tuán)的鮮質(zhì)量的多少[22]，還可以調(diào)控體細(xì)胞胚內(nèi)蛋白質(zhì)的儲(chǔ)藏積累及氮代謝等方面，從而影響胚性細(xì)胞團(tuán)的體胚發(fā)生能力[23–25]。張煥玲等[26]發(fā)現(xiàn)最適宜栓皮櫟Quercus varibilis的增殖培養(yǎng)激素組合是0.10 mg·L-1 NAA+ 0.l0 mg·L-1 6-BA，其增殖體系可長期保存，而在0.50 mg·L-1 2，4D+0. 50 mg·L-16-BA中的愈傷組織屬結(jié)構(gòu)疏松的白色顆粒狀，喪失生長發(fā)育能力。在本研究中隨著6-BA濃度的升高，其增殖系數(shù)呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)2，4-D濃度為0.10 mg·L-1，6-BA濃度為0.80 mg·L-1時(shí)，體胚增殖系數(shù)最高，體胚形態(tài)良好。

體胚增殖對光照要求較為嚴(yán)格。麻櫟的體胚光照16 h其增殖率最高能達(dá)到70%[27]，而’香玲’核桃Juglans regia L.體細(xì)胞胚在暗環(huán)境誘導(dǎo)下增殖率最高可達(dá)315.60%[28]。不同樹種體胚對光照的敏感程度不同，光照對體胚增殖影響較大。對于塔形栓皮櫟而言，在強(qiáng)光環(huán)境下其體胚發(fā)育效果最好，體胚增殖系數(shù)大，胚體緊湊。

3.2 探究影響體胚成熟的因素

3.2.1 ABA對體胚成熟的影響

成熟培養(yǎng)指在促進(jìn)體胚進(jìn)一步發(fā)育，減少異常體胚，增強(qiáng)體胚萌發(fā)能力[29]，研究從蔗糖濃度、激素配比、ABA濃度、活性炭濃度等胚性愈傷組織成熟的主要影響因素進(jìn)行較為全面的研究。與日本落葉松相似，添加ABA可顯著影響細(xì)胞胚發(fā)生能力[25]，低濃度的 ABA 能有效促進(jìn)塔形栓皮櫟體胚萌發(fā)和降低體胚畸形率。研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)ABA濃度升高，抑制畸形胚出現(xiàn)的能力越差，這與張煥玲等[26]的結(jié)果一致，因此在添加ABA時(shí)需選擇適合濃度，但處理時(shí)間不宜過長，否則會(huì)出現(xiàn)下胚軸褐變，導(dǎo)致整個(gè)體胚死亡。這可能是因?yàn)锳BA 能參與了碳水化合物的代謝，降低培養(yǎng)基中腐胺的水平，有利于體胚的萌發(fā)及植株轉(zhuǎn)化[30]。而在本研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)ABA濃度大于1.00 mg·L-1時(shí)，體胚存在產(chǎn)生次生胚的現(xiàn)象，這可能與ABA能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)淀粉、脂類和蛋白質(zhì)等貯存物質(zhì)的積累，從而促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟有關(guān)。

3.2.2 活性炭對體胚成熟的影響

活性炭具有較強(qiáng)的吸附性，不僅能吸附培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，還具有一定的防褐化效果，在鵝掌楸體胚中發(fā)現(xiàn)，活性炭通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值和降低滲透壓，促進(jìn)體胚的成熟[31]。研究發(fā)現(xiàn)在抗性黑松體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基中添加2.00 g·L-1活性炭時(shí)，胚性細(xì)胞形成體細(xì)胞胚數(shù)量較多，且結(jié)構(gòu)完整，發(fā)育正常[32]。而在本研究中，當(dāng)活性炭濃度達(dá)到2.00 mg·L-1時(shí)，塔形栓皮櫟體胚成熟率最高，但是畸形胚數(shù)量增多，這可能跟添加的防褐化劑PVP有關(guān)。PVP具有抑制體胚早萌的特點(diǎn)，但當(dāng)活性炭濃度太高，下胚軸根部提前發(fā)育，體胚易出現(xiàn)早萌現(xiàn)象，因此在添加高濃度活性炭時(shí)，還需控制好PVP的濃度、及時(shí)觀察體胚的發(fā)育動(dòng)態(tài)，以免出現(xiàn)體胚異?，F(xiàn)象。

3.2.3 蔗糖對體胚成熟的影響

蔗糖濃度影響培養(yǎng)基滲透壓，適當(dāng)?shù)恼崽菨舛葹榧?xì)胞膨大提供滲透推動(dòng)力[33]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度對體胚的成熟有著顯著影響。但蔗糖濃度過高，其褐化程度加重，嚴(yán)重的可使體胚褐化致死。這與對花櫚木的研究結(jié)果一致，高濃度的蔗糖雖然促進(jìn)了花櫚木胚性愈傷組織糖分的積累，但是一定程度上抑制了體胚誘導(dǎo)[34]。這表明適當(dāng)?shù)恼崽菨舛瓤梢院芎玫嘏囵B(yǎng)體胚的成熟，甚至有的體胚成熟后直接開始萌發(fā)。

3.2.4 激素配比對體胚成熟的影響

研究發(fā)現(xiàn)不同激素組合對荔枝體胚成熟影響較大，不同濃度激素對次生胚及畸形胚的形成有一定影響，且不同品種荔枝體胚成熟所需激素濃度組合存在一定差異，這說明不同激素濃度對不同物種乃至不同品種體胚的成熟敏感度都不同[35]。本研究通過不同濃度的NAA和6-BA激素進(jìn)行成熟培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低濃度的激素組合比高濃度的激素組合培養(yǎng)效果好。當(dāng)激素濃度越高，體胚的再生胚和畸形胚隨之增加，雖然培養(yǎng)基中加入PVP，但濃度越高，體胚褐化程度越重，這一原因可能是體胚在進(jìn)行成熟誘導(dǎo)時(shí)，對激素的要求不宜太高，低濃度的激素組合更有利于體胚的正常發(fā)育。

4 結(jié) 論

體胚增殖試驗(yàn)表明，不同濃度激素配比對塔形栓皮櫟體胚增殖有顯著影響，當(dāng)2，4-D濃度為0.10 mg·L-1，6-BA濃度為0.80 mg·L-1時(shí)，體胚增殖系數(shù)最高為83.33%，褐化率最低為30.67%，體胚形態(tài)良好。塔形栓皮櫟在強(qiáng)光環(huán)境下增殖效果較好，在無光條件下增殖效果差。

體胚成熟試驗(yàn)表明，當(dāng)蔗糖濃度為5.00%時(shí)，成熟率最高為77.80%；ABA濃度為0.50 mg·L-1時(shí)，成熟率可達(dá)到最高為50.00%；添加0.25 mg·L-1 NAA與0.25 mg·L-1的6-BA時(shí)，體胚的成熟率最高可達(dá)90.50%；當(dāng)活性炭濃度為2.00 g·L-1時(shí)，體胚的成熟率最高可達(dá)到60.00%。

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[本文編校：羅 列]