油茶根際促生菌的篩選與促生特性

摘 要：【目的】篩選油茶根際促生微生物，有助于油茶專用微生物菌肥的研制，為提高茶油品質(zhì)產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳杂筒韪H土壤為研究對象，采用PVK平板檢測法、亞歷山大平板檢測法、CAS平板檢測法、JNFB培養(yǎng)基檢測法、Salknowski比色法，對從油茶根際土中隨機挑取的20株細菌的解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體、固氮、產(chǎn)吲哚-3-乙酸（IAA）能力進行了檢測。采用鉬銻抗比色法、火焰分光光度計法對油茶根際菌YC10的解磷能力和解鉀能力分別進行了定量測定，采用16S rDNA對菌株YC10進行了分子鑒定?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明：挑取的20株細菌中具有解磷能力的有6株（占30%），具有解鉀能力的有6株（占30%），能產(chǎn)嗜鐵素的有10株（占50%），具有固氮能力的有7株（占35%），產(chǎn)IAA能力的細菌最多有18株（占90%），同時具備2種或2種以上促生特性的菌株有14株，占總分離菌株數(shù)的70%。其中菌株 YC10兼具解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA、固氮等多重促生特性，菌株YC10發(fā)酵液中有效磷的含量在第60 h時達到最大為68.09 μg/mL，解磷率最高為5.44%，菌株YC10發(fā)酵液中有效鉀的含量在第72 h達到最高為4.43 μg/mL，其解鉀率最高為31.63%。菌株YC10經(jīng)16S rDNA分子生物學鑒定為伯克氏菌Burkholderia sp.?！窘Y(jié)論】油茶根際存在較多的具有促生特性的細菌，其中菌株YC10兼具解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA、固氮等多重促生特性，具有油茶專用微生物菌肥開發(fā)的潛質(zhì)。

關(guān)鍵詞：油茶；根際促生菌；篩選；促生特性

中圖分類號：S794.4；S714.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-923X（2024）04-0028-08

基金項目：江西省教育廳科學技術(shù)研究資助項目（GJJ191162，GJJ151277），江西省科技廳技術(shù)示范類項目（20171BEF61021）

Isolation and promoting characteristics of the rhizospheric bacteria of Camellia oleifera Abel

SI Chuncan， LIN Ying， SHANG Tianyu

（School of Biological and Environmental Engineering， Jingdezhen University， Jingdezhen 333400， Jiangxi， China）

Abstract：【Objective】In order to lay the foundation for the development of specialized microbial fertilizer for Camellia oleifera Abel and improve the quality and yield of Camellia oil.【Method】Taking the rhizosphere soil of C. oleifera as test material， using PVK plate detection method， Alexander plate detection method， CAS plate detection method， JNFB culture medium detection method， and Salkowski colorimetric method to respectively to test phosphorus solubilization ability， potassium solubilization ability secreting， secreting iron ability， nitrogen fixation ability and producing IAA ability of 20 bacteria randomly selected from the rhizosphere soil of C. oleifera. The phosphorus solubilization ability and potassium solubilization ability of bacterium YC10 from C. oleifera rhizosphere were quantitatively determined using Mo-Sb Anti spectrophotometric method and flame atomic absorption spectrometry respectively. Molecular identification of strain YC10 was carried out using 16S rDNA.【Result】The results showed that among the 20 selected bacteria， 6 （30%） had the ability to dissolve phosphorus， 6 （30%） had the ability to dissolve potassium， 10 （50%） could produce ferritin， 7 （35%） had the ability to fix nitrogen， and up to 18 （90%） had the ability to produce IAA. There were 14 strains with 2 or more growth promoting properties， accounting for 70% of the total isolated bacterial strains. Among them， strain YC10 had multiple growth promoting properties such as phosphorus solubilization， potassium solubilization， iron carrier production， IAA production， and nitrogen fixation. The effective phosphorus content in the fermentation broth of strain YC10 reaches its maximum of 68.09 μg·mL？1， with a phosphorus solution rate of 5.44% at 60 hours， its fermentation liquid soluble potassium content was 4.43 μg·mL-1， with a potassium solution rate of 31.63% at 72 hours. Strain YC10 was belonged to Burkholderia sp. by 16S rDNA.【Conclusion】There are many bacteria with growth promoting properties in the rhizosphere of C. oleifera， among which strain YC10 has multiple growth promoting properties such as phosphorus and potassium solubilization， iron carrier production， IAA production， nitrogen fixation， etc. It has the potential to develop specialized microbial fertilizer for C. oleifera.

Keywords： Camellia oleifera； plant growth-promotion rhizobacteria （PGPR）； screen； promoting characteristics

油茶Camellia oleifera Abel為山茶科山茶屬植物，其種子可榨油，即茶油。茶油因其不飽和脂肪酸含量高，味香色清，且營養(yǎng)價值極高，是一種優(yōu)質(zhì)食用油。油茶與油橄欖、油棕、椰子并稱世界“四大木本油料植物”[1]。在我國南方地區(qū)，油茶是主要的木本油料樹種，由于油茶四季常青，能夠保護環(huán)境、保持水土，對農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展、生態(tài)環(huán)境改善均有重要貢獻[2]。因此油茶產(chǎn)業(yè)被列為在鄉(xiāng)村振興和脫貧攻堅以及國家戰(zhàn)略發(fā)揮重要作用的產(chǎn)業(yè)，油茶的種植和發(fā)展一直受到政府的密切關(guān)注。近幾年來，我國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，南方各地區(qū)油茶種植面積逐年增加。由于生長周期長，油茶種植過程必須維持土壤肥力才能達到持續(xù)高產(chǎn)的目的，科學合理的施肥被認為是提高茶油產(chǎn)量的保障措施[3-4]。傳統(tǒng)的依靠化學肥料補充土壤肥力容易造成土壤板結(jié)，導致土壤酸化嚴重，不利于土壤功能的改良。而微生物菌肥具有環(huán)境友好、成本低、效益高等特點，符合現(xiàn)代農(nóng)林產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的理念，被認為是化學肥料的最有效的替代品。

微生物菌肥開發(fā)和利用的前提是要有有效的菌株來源。植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）由于能產(chǎn)生有利于植物生長的代謝產(chǎn)物，促進植物對礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，有的還對病原微生物具有抑制作用，能減少植物病蟲害的發(fā)生，再加之這些微生物在植物根際具有很好的定殖能力，因此植物根際促生菌被認為是理想的微生物肥料來源[5]。多年來，研究者對水稻、辣椒、大豆等作物根際促生菌的分離、鑒定、促生特性以及菌肥的研制等方面進行了有益的探索[6-8]，但是關(guān)于油茶根際促生菌的研究鮮有報道。因此，本研究擬從油茶根際土壤中分離、篩選出具有促生性能的菌株進行研究，研究結(jié)果不僅可為油茶專用微生物菌肥的研制奠定基礎(chǔ)，而且可豐富其他植物的促生菌資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用抖根法獲取位于景德鎮(zhèn)楓樹山林場的油茶林的油茶根際土（117°10′E，29°16′N），將土樣裝入封口袋中帶回實驗室置于4 ℃冰箱保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶根際細菌的分離

稱取10 g油茶根際土壤，加入90 mL無菌水，按10倍梯度進行稀釋，制備成系列梯度土壤懸浮液。用移液槍吸取0.1 mL不同梯度的土壤懸浮液涂布于LB平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)72 h。待平板長出菌落后，根據(jù)菌落的大小、形狀、表面光澤、菌落顏色、生長速度等，隨機挑取不同的單菌落進行劃線純化，將純化后的細菌于4 ℃斜面保藏備用。

1.2.2 油茶根際細菌促生特性研究

將純化后的油茶根際細菌用液體LB培養(yǎng)基搖至對數(shù)生長期，將對數(shù)生長期的菌液濃度調(diào)至1×10⁷ CFU/mL備用。解磷能力的測定采用無機磷Ca3（PO4）2固體溶磷圈法[9]，解鉀能力的測定采用亞歷山大平板法[10]，產(chǎn)鐵載體能力的測定采用CAS平板檢測法[11]。具體操作為用移液槍吸取1 μL調(diào)好的1×10⁷ CFU/mL的菌液分別點接在PVK平板、亞歷山大平板、CAS平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)7 d后觀察水解圈或橙色暈圈的有無，并測量水解圈或橙色暈圈的直徑。固氮能力的測定采用JNFB半固體培養(yǎng)基法[12]，產(chǎn)IAA能力的測定采用Salkowski比色法[13]。

1.2.3 菌株YC10解磷能力和解鉀能力的定量檢測

將菌株YC10接種于液體LB培養(yǎng)基上，于30 ℃、200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h制成種子液，并將菌株濃度調(diào)到1×10⁷ CFU/mL備用。將濃度為1×10⁷ CFU/mL的菌株YC10以1%的接種量分別接種于250 mL含有100 mL PVK培養(yǎng)基（不含瓊脂）和亞歷山大培養(yǎng)基（不含瓊脂）的三角瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔24 h將搖瓶取出，在超凈工作臺上取其上清液對其有效磷含量、速效鉀含量和pH值進行測定。有效磷含量的測定和解磷率的計算參照李文等[14]的方法進行，速效鉀的測定和解鉀率的計算參照趙君等[15]的方法進行，pH值的測定采用精密PHS-3D型pH計。

1.2.4 菌株YC10分子生物學鑒定

將菌株YC10搖瓶培養(yǎng)后，采用菌液PCR進行16S rDNA擴增。擴增采用的引物為通用引物27f、1492r。PCR運行程序：預變性：94 ℃，10 min；變性：94 ℃，45 s；退火：56 ℃，40 s，延伸：72 ℃，40 s；共35個循環(huán)；總延伸：72 ℃，7 min。經(jīng)過電泳檢測后將PCR產(chǎn)物送至上海生工測序，測序后將所得序列與BLAST數(shù)據(jù)庫中相應序列進行比對，采用MEGA 4.0.1軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Excel 2016軟件進行初步整理，采用Originpro 2021軟件的ANOVA進行LSD多重比較，檢驗組間的差異顯著性，數(shù)據(jù)作圖采用Sigmaplot 12.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶根際細菌的分離及促生特性初步檢測

將油茶根際土壤懸浮液涂布于LB平板7 d后，在平板長出了大量菌落，經(jīng)過劃線純化后，從中挑取了20株菌落大小、形狀、顏色、表面光澤、生長速度等特征明顯不同的細菌用于促生特性的檢測，檢測結(jié)果如表1所示。由表1可知，除了YC6和這YC15這兩株細菌沒有表現(xiàn)出任何促生特性之外，其他18株細菌均表現(xiàn)出了至少一項促生特性，占到了總分離細菌數(shù)的90%。其中具有解磷能力的有6株，具有解鉀能力的有6株，產(chǎn)嗜鐵素的有10株，具有固氮能力的有7株，產(chǎn)IAA能力的細菌較多有18株，同時具備2種或2種以上促生特性的有14株，占總分離菌株數(shù)的70%。由此可見，油茶根際存在較多的具有促生特性的細菌，其中具有產(chǎn)IAA能力的細菌數(shù)量最多，占到了總分離細菌的90%，其次為產(chǎn)嗜鐵素的細菌，占到了總分離細菌數(shù)的50%。

其中YC10菌經(jīng)過各項促生功能逐一檢測后，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的解磷效果和解鉀、產(chǎn)鐵載體效果。其解磷水解圈直徑、解鉀水解圈直徑、橙色暈圈直徑與菌落直徑的比值分別達到了2.46±0.16、4.07±0.44、1.51±0.03（表2），YC10菌在解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基上的檢測效果如圖1所示。結(jié)合表1的結(jié)果可知YC10菌還具有固氮能力和產(chǎn)IAA能力，由此可見YC10菌是一株兼具有解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體、固氮和產(chǎn)IAA等5種促生特性的菌株。因此，在后續(xù)的試驗中選取了YC10作為進一步的特性研究，在本研究中主要對其解磷、解鉀、產(chǎn)IAA能力進行了進一步的定量測定。

2.2 菌株YC10解磷能力的定量測定

YC10菌對磷酸鈣的動態(tài)溶解過程如圖2所示。由圖2可知，菌株YC10在接種第24 h其有效磷的含量和解磷率分別僅為17.48 μg/mL和1.65%，隨著時間的延長，其發(fā)酵液中有效磷的含量和解磷率逐漸增加；在第96 h時其發(fā)酵液中有效磷的含量達到最大為68.09 μg/mL，解磷率最高為5.44%；在第120 h時發(fā)酵液中有效磷的含量相對于第96 h時來說略有下降，但沒有達到差異顯著。由此可見，YC10菌在第96 h時其解磷效果最佳。從pH值來看，發(fā)酵液中的pH值在第24 h就從7.21下降到了4.12，但在第48 h上升至了5.46，在第72 h、96 h、120 h都略有下降，分別為5.08、5.26、5.15（圖2）。Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，pH值與有效磷的含量（r=-0.416 3，P>0.05），以及解磷率都不存在相關(guān)性（r=-0.455 5，P>0.05）。

2.3 菌株YC10解鉀能力的定量測定

YC10菌對鉀長石的動態(tài)溶解過程如圖3所示。由圖3可知，菌株YC10在接種后0～72 h，上清液中有效鉀的含量和解鉀率隨著發(fā)酵時間的延長而顯著增長。在第72 h菌株YC10上清液中有效鉀的含量達到最高為4.43 μg/mL，其解鉀率最高為31.63%。之后上清液中有效鉀的含量和解鉀率開始有所下降，在第96 h、第120 h菌株YC10上清液中有效鉀的含量分別下降至3.81、3.07 μg/mL，但其解鉀率都超過了20%，分別為27.18%和21.91%。從pH值來看，在第24 h，YC10菌上清液pH值就從7.09降到了2.87，且在隨后的幾次檢測中pH值都在3以下，在第72 h時，上清液pH值最低為2.75。Pearson 相關(guān)性分析顯示，pH值與有效鉀的含量存在顯著負相關(guān)（r=-0.70，P<0.05），與解鉀率存在極顯著負相關(guān)（r=-0.72，P<0.01）。

2.4 菌株YC10的分子生物學鑒定

菌株YC10經(jīng)過16S rDNA PCR擴增得到1條約1 500 bp的目的條帶，將目的片段割膠回收測序后得到大小為1 348 bp的DNA序列。將測得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫Blast進行同源性比較，比對結(jié)果顯示菌株與伯克氏菌屬Burkholderia sp.具有很高的同源性，相似度都在99%以上。采用MEGA 4.0.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明該菌株與菌株Burkholderia stagnalist strain LMG 28156的親緣性最高，在同一分支上（圖4）。因而將菌株YC10歸屬為伯克氏菌Burkholderia sp.。

3 討 論

優(yōu)良菌種資源的收集與保存是發(fā)展微生物肥料的根本，盡管自然界中具有解鉀、解磷、分泌鐵載體、固氮、產(chǎn)IAA等促生特性的微生物種類和數(shù)量都眾多，但考慮到微生物肥料主要在植物根際發(fā)揮促生作用[16]，且有的促生菌對寄主具有一定的專一性[17]。因此，從相應植物的根際分離促生菌被認為是開發(fā)效果良好的專用菌肥的研究方向。前人關(guān)于油茶根際促生菌的研究較少，且這些少有的報道又僅僅集中在油茶根際解磷菌的分離與篩選上，如劉小玉等[18]從油茶植株根際土壤中分離到了17株溶磷細菌，王舒等[19]從油茶根際分離到了97株具有分解無機磷能力的菌株。而在本研究中，從油茶根際土壤微生物中挑取的20株細菌中具有解磷能力的僅有6株（占30%），具有解鉀能力的有6株（占30%），產(chǎn)嗜鐵素的有10株（占50%），具有固氮能力的有7株（占35%），產(chǎn)IAA能力的細菌最多有18株（占90%），且分離的細菌中同時具備2種或2種以上促生特性的有14株，占總分離菌株數(shù)的70%。由此可見，油茶根際存在較多的具有促生特性的細菌，其中能產(chǎn)IAA能力的細菌數(shù)量最多，其次為產(chǎn)嗜鐵素的細菌。前人的研究認為，與解磷等促生特征相比，產(chǎn)IAA 和鐵載體被認為是植物促生菌篩選的優(yōu)選特征，這主要是因為IAA能促進植物根系的形成和生長，在植物生長中起重要作用。產(chǎn)鐵載體微生物不僅能促進植物對鐵和其他金屬元素的吸收，還能通過競爭抑制病原微生物生長，從而提高植物抗病性[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)從油茶根際土壤中分離到的菌株YC10兼具解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA、固氮五種促生特性。菌株YC10的解磷水解圈直徑、解鉀水解圈直徑與菌落直徑的比值分別達到了2.46和4.07，從水解圈直徑和菌落直徑的比值來看，菌株YC10具有較強的解磷和解鉀能力。也有的研究認為，溶磷（鉀）圈的大小和溶磷（鉀）量不完全呈正相關(guān)，溶磷（鉀）圈的大小并不能完全反應溶磷（鉀）能力的高低，需要將定性試驗和定量試驗相結(jié)合[21]。本研究的解磷定量試驗發(fā)現(xiàn)菌株YC10在第96 h時，其發(fā)酵液中有效磷的含量達到最大為68.09 μg/mL，解磷率最高為5.44%。不同的報道中，解磷菌的溶磷量不同，如韓麗珍等[22]從茶樹根際分離的4株解磷菌其解磷量為79.67～99.67 μg/mL，李文等[14]發(fā)現(xiàn)不動桿菌Acinetobacter indicus JL-1以磷礦粉為磷源時，解磷量在第60 h時達到最大為4.65 μg/mL，溶磷率為2.34%。Teng等[23]從北京野鴨湖國家濕地公園的根際土中分離的各種解磷菌在以Ca3（PO4）2為磷源時，解磷量4.04～430.40 μg/mL。由此可見，不同研究中，解磷菌的解磷效果不同，分析其原因是由于解磷菌的解磷效果，除了跟菌種本身有關(guān)，還跟碳源種類、磷酸鹽種類、培養(yǎng)條件等有關(guān)。在解鉀方面，根據(jù)國家農(nóng)業(yè)部關(guān)于硅酸鹽細菌生產(chǎn)菌種標準的要求（NY882—2004），速效鉀相對增加量的百分比≥20%的菌株才能認定為硅酸鹽細菌。菌株YC10在第72 h上清液中有效鉀的含量達到最高為4.43 μg/mL，其解鉀率最高為31.63%，且在接種第96 h、第120 h，其解鉀率分別達到了27.18%和21.91%。因此，我們認為解鉀菌YC10具有較強的解鉀能力，達到了硅酸鹽細菌要求。

產(chǎn)有機酸理論被認為是解磷、解鉀中起主要作用的一個機制。該理論認為，微生物在新陳代謝代的過程中，能通過糖酵解途徑和酮糖酸途徑產(chǎn)生酒石酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等有機酸，這些有機酸能通過酸解作用、水解作用、絡(luò)合溶解作用等促進鉀和磷的釋放[24-25]。除了產(chǎn)有機酸外，微生物還可以通過酶解、釋放H+等其他機制溶解磷酸鹽和鉀礦石[26]。本研究中菌株YC10在接種第24 h就導致解磷和解鉀發(fā)酵液的pH值顯著下降，尤其是解鉀發(fā)酵液的pH值在第72 h達到了2.75，我們推測菌株YC10的解磷和解鉀發(fā)酵液中都產(chǎn)生了大量有機酸。但相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，菌株YC10發(fā)酵液的pH值與有效磷的含量、解磷率都不存在相關(guān)性，與有效鉀的含量、解鉀率卻存在負相關(guān)。這與前人的研究結(jié)果，菌株的解磷率、解鉀率與培養(yǎng)液pH值下降并不完全呈正相關(guān)關(guān)系或者缺乏相關(guān)性一致[15]。因此，我們推測菌株YC10可能存在除了產(chǎn)有機酸以外的其他機制，導致其具有解磷、解鉀特性。但菌株YC10具體產(chǎn)生了哪些有機酸，除了產(chǎn)有機酸外，菌株YC10還存在哪些機制使其具有較好的解磷和解鉀能力這些問題都還有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究從油茶根際土壤微生物中挑取的20株細菌中具有解磷能力的有6株（占30%），具有解鉀能力的有6株（占20%），能產(chǎn)嗜鐵素的有10株（占20%），具有固氮能力的有7株（占35%），產(chǎn)IAA能力的細菌最多有18株（占90%），同時具備2種或2種以上促生特性的菌株有14株，占總分離菌株數(shù)的70%。其中菌株YC10兼具解磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)IAA、固氮等多重促生特性，菌株YC10發(fā)酵液中有效磷的含量在第60 h時達到最高為68.09 μg/mL，解磷率最高為5.44%，菌株YC10發(fā)酵液中有效鉀的含量在第72 h達到最高為4.43 μg/mL，其解鉀率最高為31.63%。菌株YC10經(jīng)16S rDNA分子生物學鑒定為伯克氏菌Burkholderia sp.?？傊?，油茶根際存在較多的具有促生特性的細菌，這些菌株從理論上來說具有一定的田間應用潛力，但在將其研發(fā)成為微生物肥料生產(chǎn)菌種之前還需對其促生能力進行活體試驗研究。

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[本文編校：羅 列]