高效液相色譜法檢測豬肝中泰樂菌素殘留

【摘要】該研究旨在開發(fā)一種用于檢測豬肝中泰樂菌素殘留量的高效液相色譜（HPLC）檢測方法。通過離心分離、濃縮等前處理方法處理樣品，用高效液相色譜法提取樣品中的泰樂菌素殘留量。添加樣在60μg/kg、100μg/kg、200μg/kg三個濃度下的泰樂菌素，回收率為71.15%～108.09%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%（n=6）。通過實驗可以得出，此方法能快速、準(zhǔn)確地測定出豬肝中泰樂菌素殘留量。

【關(guān)鍵詞】豬肝；高效液相色譜法；泰樂菌素

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.03.003

Analysis of Tylosin Residue in Pig Liver Using High Performance Liquid Chromatography Method

JI Yuan

（Liaoning Inspection， Examination & Certification Centre， Shenyang 110036， China）

Abstract： This study aimed to establish an HPLC analysis protocol for detecting tylosin residues in pig liver. Methods：The samples were extracted by dichloromethane， purified by centrifugation and stratification， determined by high performance liquid chromatography and quantified by external standard method. Results：The recoveries were ranged from 71.15% to 108.09% for tylosin residues with 3 spiked levels of 60， 100 and 200μg/kg.The RSDs were below 10%（n=6）. Conclusion：The proposed method is fast， accurate， which is suitable for detecting tylosin residues in pig liver.

Keywords： pig liver； high performance liquid chromatography； tylosin

酒石酸泰樂菌素，化學(xué)式為C46H77NO17·C4H6O6，CAS號1405-54-5，其為白色至淡黃色粉末，易溶于水。由于它易于吸收且在體內(nèi)擴散快，可以迅速提高血液中的藥物濃度。酒石酸泰樂菌素具有廣泛的抗菌譜，其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且生物活性高，能顯著促進(jìn)生長，因此被廣泛用于畜禽疫病的預(yù)防和治療。制定此方法旨在確保生豬在飼養(yǎng)過程中泰樂菌素的使用不超過安全限量。肝臟作為代謝器官易殘留藥物，檢測豬肝中的泰樂菌素殘留可以更好地確保在屠宰、銷售等環(huán)節(jié)中，泰樂菌素殘留在限定范圍內(nèi)。這有助于減少細(xì)菌耐藥性，規(guī)范泰樂菌素的添加和使用。

1儀器與試劑

1.1主要儀器

Waters高效液相色譜儀、分析天平、離心機、氮吹儀、振蕩器、渦旋儀。

1.2試劑與試樣

標(biāo)準(zhǔn)品：酒石酸泰樂菌素（純度98.0%），相對分子質(zhì)量為1066.19。

試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、二氯甲烷（分析純）、鹽酸（分析純）、高氯酸鈉（分析純）等。

試樣：豬肝空白樣。

2方法

2.1標(biāo)準(zhǔn)品和流動相

標(biāo)準(zhǔn)品儲備液配制：準(zhǔn)確稱取泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品23.3 mg（相當(dāng)于泰樂菌素A20.0 mg），用甲醇定容，配制成濃度為200μg/mL的儲備液，2～8℃冷藏，有效期30天。

工作液配制：取儲備液5.0 mL，用甲醇定容，配制成濃度為10.0μg/mL的工作液，2～8℃冷藏，有效期7天。

高氯酸鈉溶液配制：取高氯酸鈉200 g，加入800 mL水，完全溶解后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，再定容至1000 mL。

流動相配制：乙腈與高氯酸鈉溶液按2∶3體積比混合，過0.45μm濾膜。

復(fù)溶液配制：乙腈與水按1∶1體積比混合后，超聲脫氣。

2.2前處理

兩次提?。喝∝i肝樣約（5±0.05）g至離心管A中，加入15 mL二氯甲烷，旋渦1 min，再將離心管A放入振蕩器中，振蕩提取5～10 min，離心10 min（轉(zhuǎn)速為5000 r/min），吸取上清液至離心管B，靜置；用10 mL二氯甲烷再次對離心管A中樣品進(jìn)行提取，振蕩5～10 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速為10000 r/min），提取上清液至離心管C，靜置。

凈化：用一次性吸管吸取離心管B和C上層雜質(zhì)，棄掉。將下層（二氯甲烷層）澄清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容。將定容后的溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管D中，離心5 min（轉(zhuǎn)速為10000 r/min），移取離心管D中澄清液10.0 mL，氮吹儀（50℃以下）吹干。取1.0 mL 50%乙腈溶液溶解殘留物，渦旋1 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速為10000 r/min），移取澄清液，過膜（0.45μm）備用。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取適量工作液，用流動相稀釋，配制成50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L標(biāo)液。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得出回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

2.4液相條件

3結(jié)果與分析

3.1色譜條件的選擇

3.1.1原子吸收分光光度法

試驗發(fā)現(xiàn)，高氯酸鈉會影響泰樂菌素的峰形、峰寬以及基線噪音。在流動相中增加一定比例的高氯酸鈉含量會使峰形尖銳且峰寬變小，但是噪音也隨之變大。另外，提高乙腈比例能夠使泰樂菌素出峰時間縮短。通過調(diào)整乙腈和高氯酸鈉的體積比發(fā)現(xiàn)，在體積比為2∶3時，出峰時間可控制在5～10 min內(nèi)，且峰形良好。

3.1.2檢測波長選擇

波長掃描試驗發(fā)現(xiàn)，在280～290 nm處，雜質(zhì)干擾較小，響應(yīng)值大，見圖1。

3.2前處理條件優(yōu)化

本方法前期進(jìn)行了固相萃取小柱凈化試驗，分別用實驗室現(xiàn)有的C18小柱、MCX小柱、HLB小柱、MAX小柱、SCX小柱對樣品進(jìn)行過濾提取處理，并計算回收率。C18小柱的平均回收率為73%，HLB小柱的平均回收率為71%，其他凈化柱回收率均小于60%。同時，在過濾過程中，清除脂溶性雜質(zhì)的效果不理想，等待時長較長。相比較而言，離心、氮吹處理方式更優(yōu)。

3.3線性范圍

移取標(biāo)準(zhǔn)品工作液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于50 mL容量瓶中，稀釋至200μg/L、400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L，每個濃度重復(fù)進(jìn)樣2次，以峰面積為對應(yīng)濃度，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為C=0.0321A-0.0489，相關(guān)系數(shù)r= 0.9996，試驗結(jié)果見表1。

3.4檢出限和定量限

按照3倍基線噪音為檢出限、10倍基線噪音為定量限的要求，依據(jù)GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留量限量》規(guī)定，豬肝中泰樂菌素的最高殘留限量為100μg/kg，得出本標(biāo)準(zhǔn)中泰樂菌素的檢出限為30μg/kg。

3.5回收率和精密度

在空白豬肝樣品中加入60μg/kg、100μg/kg、200μg/kg泰樂菌素溶液做回收實驗，精密度均小于10%。回收率在71.15%～108.09%之間，符合相關(guān)要求，詳見表2。

3.6樣品測定

在遼寧省內(nèi)隨機購買15批次豬肝樣品，均未檢測出泰樂菌素。

3.7泰樂菌素色譜圖

泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖、空白樣品色譜圖、添加樣品色譜圖分別見圖2、圖3、圖4。

4結(jié)束語

此方法通過優(yōu)化提取液比例，縮短了出峰時間，提高了殘留的回收率并保證了色譜分離效果；比較了不同凈化提取方式，最終得到了損失最小的前處理方式。通過實驗數(shù)據(jù)可以看出，該方法線性良好，相關(guān)系數(shù)、定量限、回收率均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，且能夠準(zhǔn)確、快速、便捷地測定出豬肝中泰樂菌素的殘留，具有很高的可操作性。

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【作者簡介】

紀(jì)源，女，1988年出生，畜牧師，學(xué)士，研究方向為畜牧飼料、進(jìn)口寵物飼料、酶制劑活性等畜牧領(lǐng)域理化指標(biāo)檢測。

（編輯：李鈺雙）