基于斑馬魚模型和代謝組學技術(shù)篩選天麻中潛在抗癲癇活性成分

陳善軍 王歡 胡凱慶 畢文杰 程貴東 王松松 韓利文 王曉靜

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20230089

收稿日期：2023-05-27

基金項目：山東省自然科學基金（ZR2019MH037）；山東第一醫(yī)科大學學術(shù)提升計劃（2019LJ003）；山東省中醫(yī)藥高層次人才培育項目

作者簡介：陳善軍（1997—），男，碩士研究生，研究方向為中藥復(fù)雜藥效物質(zhì)解析。E-mail： 13562918151@163.com

*通信作者，王曉靜（1966—），女，研究員，研究方向為天然藥物化學。E-mail： xj68cn@163.com

韓利文（1980—），男，副研究員，研究方向為中藥質(zhì)量控制。E-mail： hanliwen08@126.com

摘要：從確有療效的中藥天麻中挖掘潛在的抗癲癇活性成分對于癲癇的防治意義重大。使用斑馬魚幼魚癲癇模型評價兩個產(chǎn)地天麻樣本的抗癲癇活性；利用基于LC-MS/QE plus（液相色譜-質(zhì)譜）的代謝組學技術(shù)檢測天麻成分，結(jié)合模式判別分析方法尋找重要差異代謝物；通過一級質(zhì)譜與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)及文獻進行代謝物鑒定，并利用斑馬魚癲癇模型進一步對代謝物的抗癲癇活性進行確認。結(jié)果顯示9個天麻提取物能夠顯著減少斑馬魚的渦旋數(shù)量，并且兩產(chǎn)地天麻在抗癲癇活性上有著顯著差異（P<0.05）。代謝組學檢測以及模式判別分析篩選并鑒定出了6個重要差異代謝物（巴利森苷E、天麻素、巴利森苷C、巴利森苷D、N6-對羥基芐基腺苷、4， 4′-二羥基二芐基醚）。活性驗證發(fā)現(xiàn)巴利森苷E、天麻素、N6-對羥基芐基腺苷能夠顯著抑制斑馬魚癲癇樣行為。該研究運用斑馬魚模型與代謝組學找出并確定了天麻中多個具有抗癲癇活性的成分，其中巴利森苷E以及N6-對羥基芐基腺苷首次被發(fā)現(xiàn)具有抗癲癇活性，為天麻抗癲癇作用的研究提供了參考價值。

關(guān)鍵詞：天麻；癲癇；代謝組學；斑馬魚；活性成分

中圖分類號：R917??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1002-4026（2024）03-0001-09

開放科學（資源服務(wù)）標志碼（OSID）：

Screening of potential antiepileptic active ingredients in Rhizoma Gastrodiae

based on zebrafish model and metabolomics technology

CHEN Shanjun， WANG Huan， HU Kaiqing， BI Wenjie， CHENG Guidong， WANG Songsong， HAN Liwen*， WANG Xiaojing*

（National Key Laboratory of Advanced Drug Delivery System， School of Pharmaceutical Sciences &Institute of Materia Medica， Shandong First Medical University &Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250117， China）

Abstract∶Identifying potential antiepileptic active ingredients in Rhizoma Gastrodiae is of immense significance for the prevention and treatment of epilepsy. In this study， we used a larval zebrafish epilepsy model to evaluate the antiepileptic activity of Rhizoma Gastrodiae from two different regions. In addition， we employed metabolomics technology based on liquid chromatography tandem mass spectrometry/QE plus to detect the ingredients in Rhizoma Gastrodiae and performed pattern analysis to identify key differential metabolites. The metabolites were further identified using primary and secondary mass spectrometry data and literature references. This step was followed by the confirmation of their antiepileptic activity using the zebrafish epilepsy model. The results showed that nine extracts of Rhizoma Gastrodiae significantly reduced the number of whirls in zebrafish， and significant differences in antiepileptic activity were observed between the Rhizoma Gastrodiae samples from the two regions （P<0.05）. Metabolomics and pattern analysis identified six important differential metabolites （Parishin E， Gastrodin， Parishin C， Parishin D， N6-p-hydroxybenzyl adenosine， and 4，4′-dihydroxydibenzyl ether）. Activity verification results showed that Parishin E， Gastrodin， and N6-p-hydroxybenzyl adenosine significantly inhibited zebrafish epilepsy-like behavior. This study utilized the zebrafish model and metabolomics to identify and determine several active antiepileptic ingredients in Rhizoma Gastrodiae. Of these， Parishin E and N6- p-hydroxybenzyl adenosine were reported for the first time to exhibit antiepileptic activity， thereby serving as a valuable reference for further research on the antiepileptic effects of Rhizoma Gastrodiae.

Key words∶Rhizoma Gastrodiae; epilepsy; metabolomics; zebrafish; active ingredients

癲癇（epilepsy）是一種由神經(jīng)元異常放電引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響著全球7 000多萬人，具有突發(fā)性和不可預(yù)測的特征［1-2］。癲癇發(fā)作能夠引起大腦的形態(tài)和功能變化，主要表現(xiàn)為認知和神經(jīng)心理障礙，若沒有得到及時控制與治療，可能會導致永久性認知功能障礙［3］。抗癲癇藥物（AEDs）主要通過平衡興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)水平從而達到抑制癲癇發(fā)作的目的，但仍然有約三分之一的患者對抗癲癇藥物有著不同程度的耐藥［4］。天然產(chǎn)物具有毒副作用小、骨架結(jié)構(gòu)多樣、生物活性廣泛等特點［5］，因此從傳統(tǒng)中藥中篩選潛在的活性物質(zhì)能夠為抗癲癇藥物研發(fā)提供科學依據(jù)。

天麻又叫“赤箭”“定風草”，是植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖。作為我國的傳統(tǒng)“止痙”中藥，天麻在治療驚癇抽搐上具有確切的療效?！吨袊幍洹分杏涊d天麻具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡(luò)的效果，常用于小兒驚風、癲癇抽搐等。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)天麻中的天麻素、香草醇等成分具有明顯的抗癲癇活性［6-7］。但天麻中以對羥基苯甲醇為母核的衍生物成分超過40種，還有許多成分的抗癲癇活性并不明確［8］，因此有必要對天麻中潛在抗癲癇成分進行進一步篩選。

本實驗擬采用斑馬魚模型對天麻進行抗癲癇活性評價，利用代謝組學與模式判別辨識天麻中潛在的抗癲癇活性物質(zhì)，并使用斑馬魚模型評價潛在活性成分的抗癲癇作用，從而確定抗癲癇活性成分，以便為天麻抗癲癇作用的研究提供參考價值。

1? 實驗材料

1.1? 試劑與儀器

戊四唑（PTZ）購自Sigma-Aldrich公司；二甲基亞砜（DMSO，批號：C15210581，純度：大于99.8%）、丙戊酸鈉（VPA，批號：C11370830，純度：98%）均購自上海麥克林生化科技有限公司；天麻素（GAS，批號：T10M9F55562，純度：HPLC ≥ 98%）、巴利森苷E（PE，批號：M20HB178561，純度：HPLC ≥ 98%）、巴利森苷C（PC，批號：D06N11S130122，純度：HPLC ≥ 98%）、N6-對羥基芐基腺苷（NHBA，批號：C12073575，純度：98%），以上試劑購自上海源葉生物有限公司；天麻藥材購自濟南鼎國生物科技有限公司（2022年8月），由山東第一醫(yī)科大學韓利文副研究員鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖，共分為13批次，命名為P1～P13，其中P1～P6產(chǎn)自云南昭通，P7～P13產(chǎn)自吉林長白山；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20221213，AR），甲醇（賽默飛世爾科技，批號：A452-4，fisher），乙腈（賽默飛世爾科技，批號：A998-4，fisher），甲酸（賽默飛世爾科技，批號：A117-50，fisher），純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

索尼攝像機（DSC-RX100M7，日本索尼公司），中藥粉碎機（BJ-150，拜杰多功能粉碎機），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-200A，鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司），全自動樣品快速研磨儀（Wonbio-E，上海萬柏生物科技有限公司），臺式高速冷凍離心機（TGL-16MS，上海盧湘儀離心機儀器有限公司），高分辨質(zhì)譜儀（QE plus，賽默飛世爾科技公司），高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I-Class plus，Waters），色譜柱（ACQUITY UPLC HSS T3，100 mm×2.1 mm， 1.8 μm， Waters）。

1.2? 實驗動物

AB系斑馬魚（Danio rerio）由山東第一醫(yī)科大學斑馬魚研究中心提供，斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)購自上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司。AB系成年斑馬魚在（28±0.5）℃的恒溫養(yǎng)殖系統(tǒng)下養(yǎng)殖，整個系統(tǒng)為自動水循環(huán)系統(tǒng)，并進行14 h/10 h（上午8：30光照，晚上22：30黑暗）的光照/黑暗循環(huán)。健康成年雄性和雌性斑馬魚以2：2的比例光刺激產(chǎn)卵，在產(chǎn)卵2 h后收集的魚卵使用專用養(yǎng)魚水沖洗3次。將干凈的胚胎轉(zhuǎn)移到含有養(yǎng)魚水的90 mm培養(yǎng)皿中，加入適量的亞甲基藍抑制細菌生長，并去除未受精以及發(fā)育不良的魚卵，健康魚卵在 28.5 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中孵育用于后續(xù)實驗。實驗之前需要經(jīng)常觀察魚卵的發(fā)育狀況，并及時去除發(fā)育過程中魚卵褪下的卵膜以及死去的魚卵。

2? 實驗方法

2.1? 天麻樣品的提取制備

天麻粉碎過4號篩（65目），稱取各批天麻粉末約15 g，精密稱定，置于500 mL圓底燒瓶中，按照料液比1：20加入70%的乙醇回流2.5 h，過濾，取濾液進行55 ℃旋蒸，直至旋至無醇味，冷凍干燥24 h，得到各批次中藥天麻的提取物樣品。

2.2? 利用斑馬魚癲癇模型對不同產(chǎn)地天麻進行抗癲癇活性評價

使用本實驗室建立的斑馬魚抗癲癇活性評價方法，即ZebVortrack行為分析系統(tǒng)對天麻提取物的抗癲癇活性進行評價［9］。斑馬魚癲癇發(fā)作時會產(chǎn)生癲癇樣渦旋游泳行為，ZebVortrack行為分析系統(tǒng)可以根據(jù)斑馬魚渦旋游泳時的向量夾角以及渦旋游泳持續(xù)時間進行分析，量化斑馬魚幼魚在癲癇發(fā)作過程中產(chǎn)生的渦旋數(shù)量Number（N）。

精密稱各批次天麻提取物粉末，加入純凈水溶解定容，得到400 μg/mL的溶液。精密稱取戊四唑（PTZ）與丙戊酸鈉（VPA），加入純凈水溶解，分別配制得到2.90 mmol/L PTZ水溶液以及600 μmol/L VPA 水溶液，并分別作為造模藥物以及陽性對照藥物。

將受精后4天（4 days post fertilization， 4 dpf）的AB品系斑馬魚置于6孔板中，加入400 μg/mL天麻提取物溶液或600 μmol/L VPA預(yù)處理幼魚24 h，之后轉(zhuǎn)移至12孔板中，每孔1條，除去水分并分別加入2.90 mmol/L PTZ溶液誘導幼魚癲癇發(fā)作30 min。PTZ處理過程中同時使用相機拍攝，拍攝結(jié)束后將視頻導入ZebVortrack系統(tǒng)進行分析，輸出斑馬魚癲癇發(fā)作時的渦旋數(shù)量N。

對兩個產(chǎn)地天麻的抗癲癇活性進行分析，檢驗兩地天麻對斑馬魚幼魚的抗癲癇活性差異。

2.3? 天麻樣品的LC-MS代謝組學檢測

稱取各天麻樣本60 mg，放入1.5 mL的離心管，加入甲醇水溶液超聲溶解30 min，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC（液相色譜）進樣小瓶進行LC-MS（液相色譜-質(zhì)譜）分析。質(zhì)控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成。

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm）， 柱溫為45 ℃；流動相A為水（含0.1%甲酸），B為乙腈（含0.1%甲酸）；流速為0.35 mL/min；進樣體積2 μL。梯度程序：0～2 min，5% B；2～4 min，5%→30% B；4～8 min，30%→50% B；8～10 min，50%→80% B；10～14 min，80%→100% B；14～15 min，100% B；15～15.1 min，100%→5% B；15.1～16 min，5% B。離子源：ESI；樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。

2.4? 數(shù)據(jù)預(yù)處理與多元統(tǒng)計分析

使用質(zhì)譜檢測天麻樣本后，原始數(shù)據(jù)采用Progenesis QI v3.0 軟件 （Nonlinear Dynamics， Newcastle， UK） 進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化；刪除組內(nèi)缺失值（0值）> 50%的離子峰；最后將正負離子數(shù)據(jù)合并成一個數(shù)據(jù)矩陣表用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

主成分分析（PCA）是一種非監(jiān)督分析，可以反映數(shù)據(jù)的原始情況，能夠觀察樣本間的總體分布趨勢［10-11］。采用主成分分析對天麻樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，以判斷樣本的離散情況。如果兩組天麻樣本的成分之間有顯著性差異，那么兩組的樣本點在PCA得分圖上相距較遠，若是兩組天麻樣本成分之間差異并不顯著，那么兩組樣本點在PCA得分圖上就會相距較近。

進一步采用有監(jiān)督分析方法正交-偏最小二乘法（OPLS-DA）尋找兩組天麻樣本的差異代謝物［12-13］。同時采用7次循環(huán)交互驗證（7-fold cross validation）實驗和200次響應(yīng)排序檢驗（response permutation testing， RPT）驗證模型是否過擬合。利用OPLS-DA分析的變量權(quán)重值（variable important in projection， VIP）、P值以及S-plot中的相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient）絕對值|p（corr）|綜合衡量各代謝物的重要性，幫助挖掘差異代謝物。

2.5? 差異代謝物鑒定

差異代謝物主要通過文獻查閱以及一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行鑒定。利用賽默飛Xcalibur軟件對差異代謝物進行一級質(zhì)譜比對鑒定，鑒定標準為該化合物一級質(zhì)譜質(zhì)荷比的測量值與理論值的誤差，誤差的計算方法如式（1）。

Δ= ［（理論值－測量值）/理論值］×106， （1）

式（1）中Δ表示誤差，數(shù)值大小范圍為（-10， 10）。與文獻中查找的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行比對，從而確定代謝物成分，即潛在抗癲癇活性成分。

2.6? 潛在抗癲癇活性成分的活性驗證

使用斑馬魚行為分析系統(tǒng)對組學篩選出的差異代謝物進行活性驗證。稱取篩選出的代謝物標準品適量，配制成合適濃度。使用以上溶液對4 dpf 斑馬魚進行預(yù)處理24 h，處理結(jié)束后將斑馬魚置于12孔板，每孔1條，加入2.90 mmol/L PTZ溶液處理30 min，并使用攝像機拍攝斑馬魚幼魚的游動狀態(tài)，拍攝結(jié)束后將視頻導入ZebVortrack系統(tǒng)進行行為分析，輸出斑馬魚癲癇樣渦旋游泳數(shù)量N。

2.7? 統(tǒng)計學分析

活性評價使用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計，統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用（平均值±標準誤差）的方式表示，統(tǒng)計學差異通過單因素方差分析，P<0.05表示有顯著統(tǒng)計學差異，P<0.01表示有極顯著統(tǒng)計學差異。

3? 結(jié)果

3.1? 不同產(chǎn)地天麻提取物對斑馬魚癲癇的影響

天麻提取物活性評價結(jié)果如圖1所示。使用2.90 mmol/L的PTZ處理后的斑馬魚幼魚癲癇樣渦旋次數(shù)顯著增多；使用VPA進行了幼魚24 h的預(yù)處理以后進行了PTZ誘導癲癇發(fā)作，從圖中可以看到斑馬魚幼魚的渦旋次數(shù)顯著減少，表明了斑馬魚癲癇模型在此次實驗中構(gòu)建成功。天麻提取物抗癲癇實驗結(jié)果顯示P2、P3、P6～P12能夠顯著減少斑馬魚的渦旋數(shù)量，但P1、P5、P13批次并未顯著減少斑馬魚的渦旋次數(shù)，P4提取物在相等劑量處理斑馬魚的過程中造成斑馬魚死亡。通過進一步檢驗發(fā)現(xiàn)兩個產(chǎn)地天麻之間對于PTZ誘導的斑馬魚幼魚渦旋次數(shù)的影響有著顯著差異（P<0.05）。

3.2? 不同產(chǎn)地天麻樣品的組學檢測分析結(jié)果

實驗采用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測了天麻樣品并進行了3次質(zhì)量控制檢查，圖2為在負離子與正離子模式下檢測的總離子流圖（TIC）。如圖3的PCA得分圖顯示， QC點分布在一起并處在原點附近，表明實驗過程中儀器穩(wěn)定性較好。

實驗采用PCA主成分分析觀察天麻樣本的總體分布，使用OPLS-DA尋找組間的差異代謝物。如圖4（a）所示，橢圓區(qū)域代表95%的置信區(qū)間，PCA能夠?qū)傻靥炻槌晒^(qū)分，其中第一主成分為41.2%，第二主成分為13%，表明兩地天麻成分含量有著顯著差異；OPLS-DA結(jié)果也顯示兩地天麻的成分含量具有顯著差異，其中變量擬合指數(shù)R2x為0.726，R2y 為0.998，預(yù)測指數(shù)Q2為0.975，表明了OPLS-DA模型具有良好的可測量性和適用性（圖4（b））；S-plot圖的左下角離子與右上角離子為重要離子（圖4（c））；響應(yīng)排序檢驗結(jié)果顯示R2 為 0.858，Q2為-0.466，并且R2與Q2左邊的點均低于最右邊的點，同時 Q2點的綠色回歸線與縱軸（左側(cè)）截距小于零，表明了OPLS-DA模型沒有過度擬合（圖4（d））。

3.3? 重要差異代謝物的鑒定結(jié)果

對代謝組學檢測到的天麻成分進行判別分析，設(shè)定VIP值>3， P<0.05， |p（corr）|>0.58篩選后，得到183個差異特征離子，比對一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及文獻查閱鑒定辨識了6種成分，分別為巴利森苷E、天麻素、巴利森苷C、巴利森苷D、N6-對羥基芐基腺苷、4， 4′-二羥基二芐基醚，即潛在活性成分，詳情見表1。

天麻素（C13H18O7， m/z 286.104 7），負離子模式能量撞擊得到碎片離子峰為：m/z 123.045 3，具體裂解方式如圖5（a）所示。巴利森苷D （C20H20O9， m/z 404.110 1），正離子模式下能量撞擊得到碎片離子峰為：m/z 107.049 7。具體裂解方式如圖5（b）所示。

3.4? 潛在活性成分的抗癲癇作用驗證

使用斑馬魚癲癇模型驗證了4種潛在活性成分在不同濃度下的抗癲癇活性，具體為GAS（699、1 398、2 796 μmol/L）、PE（16.3、32.6、65.2 μmol/L）、PC（54.9、109.8、164.7 μmol/L）以及NHBA（26.8、53.6、80.4 μmol/L）。結(jié)果如圖6所示，GAS在中、高劑量下能夠顯著減少斑馬魚的渦旋次數(shù)，NHBA在低、中、高劑量下都能夠顯著減少斑馬魚渦旋次數(shù)，PE在低、高劑量下能夠顯著減少斑馬魚渦旋次數(shù)，PC在3個劑量下均未顯著減少斑馬魚幼魚的渦旋次數(shù)。

4? 討論

斑馬魚作為新型模式生物，與人類基因高度同源［14-15］，并且斑馬魚胚胎透明，生長周期短，體積小，適合高通量實驗。斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似，4 dpf斑馬魚中就可以檢測到膠質(zhì)細胞亞型（少突膠質(zhì)細胞、雪旺細胞和星形膠質(zhì)細胞），同時神經(jīng)系統(tǒng)還表達出一系列的信號分子［16］。此外，促驚厥劑還可以導致斑馬魚行為障礙，如游泳速度加快、姿勢喪失等［17］。這些行為表型結(jié)合強大的視頻跟蹤分析工具使斑馬魚成為藥物開發(fā)研究中高通量篩選分析的優(yōu)良脊椎動物。然而，當斑馬魚暴露于其他外部刺激（如毒素）時，游泳速度與距離也會增加［18-19］。為此，本研究基于斑馬魚癲癇發(fā)作時產(chǎn)生的典型渦旋游泳行為，使用實驗室構(gòu)建的行為分析系統(tǒng)ZebVortrack對斑馬魚癲癇發(fā)作的渦旋行為進行量化，以便更加準確地評估天麻的抗癲癇活性。

中藥代謝組學的快速發(fā)展推動了中藥研究，為中藥現(xiàn)代化發(fā)展注入了新的動力。中藥代謝組學主要通過現(xiàn)代分析儀器對中藥或方劑中的成分進行檢測，具有系統(tǒng)性、高靈敏度、特異性的特點，結(jié)合多元計量分析如主成分分析、偏最小二乘法或正交-偏最小二乘法尋找出中藥中的重要化合物，繼而對化合物進一步分析，在中藥藥效物質(zhì)辨識研究以及質(zhì)量控制上發(fā)揮了巨大的作用［20-21］。本研究通過代謝組學檢測了不同產(chǎn)地天麻的成分，結(jié)合模式判別找出了6種重要差異代謝物，即潛在抗癲癇活性成分，其結(jié)構(gòu)多為對羥基苯甲醇衍生物，此外還有腺苷類似物N6-對羥基芐基腺苷。對羥基苯甲醇［22］、腺苷［23］、天麻素［24-25］是天麻中已知的具有抗癲癇作用的成分。在本研究篩選出的6種潛在抗癲癇活性成分中，除天麻素是已知具有抗癲癇作用的成分外，其余5種均未被報道有抗癲癇作用。為了進一步驗證所篩選成分的抗癲癇活性，利用構(gòu)建的斑馬魚癲癇模型評價了天麻素、N6-對羥基芐基腺苷、巴利森苷E以及巴利森苷C的抗癲癇活性。結(jié)果顯示天麻素、N6-對羥基芐基腺苷以及巴利森苷E能夠顯著抑制斑馬魚的癲癇發(fā)作，巴利森苷C并未顯著抑制斑馬魚的癲癇發(fā)作，其中N6-對羥基芐基腺苷以及巴利森苷E首次被發(fā)現(xiàn)具有抗癲癇作用。

綜上所述，通過斑馬魚模型結(jié)合代謝組學技術(shù)找出了6種潛在的抗癲癇活性成分，并利用斑馬魚癲癇模型進一步確定了天麻素、N6-對羥基芐基腺苷以及巴利森苷E的抗癲癇活性。其中N6-對羥基芐基腺苷以及巴利森苷E首次被發(fā)現(xiàn)具有抗癲癇活性，為天麻抗癲癇的復(fù)雜作用提供了理論依據(jù)。

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