HPLC法同時檢測陜西平利絞股藍中13種酚酸含量

王珂 周瓊 李建科

摘要：為建立同時檢測陜西平利絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）中13種酚酸含量的測定方法，采用高效液相色譜法（HPLC），利用甲醇水溶液（80%）常溫渦旋，超聲波提取，色譜柱為Dimensions C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，P/N： 227-30011-07，C/N：18C03033），流動相為甲醇（100%）和磷酸水溶液（0.5%），洗脫方法為梯度洗脫，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣體積為5 μL。結(jié)果表明，13種酚酸在濃度為5～100 mg/L時線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.998；在樣本加標(biāo)回收試驗中，平均加標(biāo)回收率為61.8%～131.0%。該測定方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，適用于陜西平利絞股藍中酚酸含量的測定。

關(guān)鍵詞：陜西平利絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）；酚酸；高效液相色譜法（HPLC）；含量

中圖分類號：TS272???????? 文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0182-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.032??????????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Simultaneous detection of 13 phenolic acids in Gynostemma pentaphyllum from Pingli， Shaanxi Province by HPLC

WANG Ke， ZHOU Qiong， LI Jian-ke

（School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University， Ankang? 725000，Shaanxi，China）

Abstract： In order to establish a method for simultaneously detecting the content of 13 phenolic acids in Gynostemma pentaphyllum from Pingli， Shaanxi，high performance liquid chromatography （HPLC） was used. Methanol aqueous solution （80%） was used for room temperature vortex and ultrasonic extraction，the chromatographic column was Dimensions C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，P/N： 227-30011-07， C/N： 18C03033）， with a mobile phase of methanol （100%） and phosphoric acid aqueous solution （0.5%）. The elution method was gradient elution， with a detection wavelength of 280 nm， column temperature of 30 ℃， flow rate of 1.0 mL/min， and injection volume of 5 μL. The results showed that there was a good linear relationship among the 13 phenolic acids at concentrations of 5～100 mg/L， with a correlation coefficient （R2） ≥ 0.998； in the sample spiking recovery experiment， the average spiking recovery rate was 61.8%～131.0%. This determination method had good precision， repeatability， and stability， and was suitable for the determination of phenolic acids content in Gynostemma pentaphyllum from Pingli， Shaanxi.

Key words： Gynostemma pentaphyllum from Pingli，Shaanxi； phenolic acid； high performance liquid chromatography （HPLC）； content

收稿日期：2023-03-20

基金項目：陜西省科技廳創(chuàng)新人才推進計劃基金項目（2019TD-042；2023AYPT06）

作者簡介：王 珂（1999-），男，陜西漢中人，本科生，專業(yè)方向為果蔬貯藏與保鮮，（電話）15929597791（電子信箱）wk199955@163.com；

通信作者，周 瓊（1971-），女，貴州甕安人，教授，博士，主要從事植物資源的研發(fā)與利用研究，（電話）13992550047

（電子信箱）kanqiongtao@163.com。

王 珂，周 瓊，李建科. HPLC法同時檢測陜西平利絞股藍中13種酚酸含量［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（5）：182-186．

絞股藍（Gynostemma pentaphyllum）為葫蘆科絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物，又名七葉膽［1］。陳武等［2］認(rèn)為絞股藍性寒，其藥性應(yīng)屬平性偏微溫、味甘、微苦，歸肺、脾、心、腎經(jīng)，具備清熱解毒、清肺化痰止咳、補氣養(yǎng)陰生津、養(yǎng)心安神、固精之效用。在中國秦嶺和長江流域以南廣大地區(qū)分布較廣［3，4］。絞股藍是藥食同源類植物資源，有南方人參和第二人參的美譽。

酚酸是指結(jié)構(gòu)中帶有酚類基團的有機酸，它是植物中僅次于黃酮類化合物的第二大次生代謝物［5］。近年來，酚酸作為抵抗癌癥和心臟病的潛在保護因子，受到學(xué)者越來越多的關(guān)注，其部分原因是它們潛在的抗氧化活性、抗癌作用、對慢性疾病的保健作用以及在植物源食品中的廣泛存在性［6，7］。同時，已有研究表明，酚酸不僅具有抗氧化、抗自由基、抑制低密度脂蛋白的氧化及預(yù)防心血管疾病的作用，而且還具有抗癌、抗炎癥和抗血小板凝聚等功能［8］。關(guān)于酚酸檢測有較多報道，胡華等［9］建立了利用高效液相色譜法同時測定醬油中8種酚酸的方法；黃小蘭等［10］建立了同時測定地筍中丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和迷迭香酸7種酚酸的高效液相色譜-二極管陣列檢測法（HPLC-PDA）并對不同產(chǎn)地地筍中酚酸成分進行分析評價；陳少洲等［11］、翁芳華等［12］也分別針對向日葵籽和藍莓酒建立了測定其酚酸含量的方法。綜上，針對陜西平利絞股藍，探究其酚酸類化合物的測定方法及其含量的測定，優(yōu)化其提取分離工藝，探究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為其進一步地開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

本研究通過對色譜條件（流動相、檢測波長、梯度洗脫條件等）進行優(yōu)化，以期建立同時測定陜西平利絞股藍中13種酚酸（鞣花酸、水楊酸、肉桂酸等）的一種簡單快速準(zhǔn)確的分析方法，為陜西平利絞股藍中酚酸的檢測提供技術(shù)依據(jù)，同時也為絞股藍功能性成分的研究和絞股藍資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

絞股藍為陜西省平利縣的陜西平利絞股藍，中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品；品種為平利1#、平利2#、平利3#、平利4#。

沒食子酸、新綠原酸、綠原酸等對照品均購于成都曼思特生物科技有限公司，對照品信息如表1所示。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2040C PLUS型高效液相色譜儀（日本株式會社島津制作所）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；H1650R型離心機［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；超聲波清洗器（昆山力波超聲波設(shè)備有限公司）；CP224C型萬分之一天平（天津瑞澤分析儀器有限公司）；全新氣流式超微粉機（上海一恒科技有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)分樣篩（40目0.45 mm，上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

1.3 色譜條件

色譜柱Dimensions C18（4.6 mm×150 mm，5 μm，P/N： 227-30011-07， C/N： 18C03033）；流動相A為100%甲醇，流動相B為0.5%磷酸水溶液。采用低壓梯度洗脫的分離方法，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣體積為5 μL。具體洗脫程序如表2所示。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理 使用萬分之一天平準(zhǔn)確稱量5 g樣品，移入50 mL離心管中，加入甲醇水溶液（80%）40 mL，渦旋振蕩器渦旋1 min，超聲波處理60 min，使樣品中酚酸充分溶出，5 000 r/min 離心5 min，將上清液移入10 mL比色管，加入甲醇水溶液（80%）定容至10 mL，過0.22 μm膜，上機檢測［13-15］。

1.4.2 對照品儲備溶液和混合對照品使用液的配制 使用萬分之一天平分別精確稱取13種酚酸對照品10.00 mg，用甲醇（100%）溶解并定容至10 mL。此時，每個對照品儲備溶液的濃度為1 000 mg/L，為了得到不同濃度的對照品儲備溶液，進一步用甲醇（100%）稀釋。分別準(zhǔn)確吸取1 mL 1 000 mg/L的?? 13種對照品儲備溶液，分別用甲醇（100%）定容至10 mL得到濃度為100 mg/L的對照品儲備溶液。分別移取0.5 mL 100 mg/L的各對照品儲備溶液，充分混勻，得到濃度為100 mg/L的混合對照品使用液。溶液置于4 ℃冰箱中避光保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長 將13種100 mg/L的對照品儲備溶液稀釋后上機測定，檢測波長分別為280 nm和320 nm。通過比較2種波長下的色譜圖及出峰情況，發(fā)現(xiàn)13種酚酸在檢測波長為280 nm時有更好的吸收。

2.1.2 流動相 甲醇水溶液、乙腈水溶液可以作為流動相分離酚酸［16］，但羥基在水溶液中容易發(fā)生電離，極性增強，在固定相表面形成雙重保留，色譜峰拖尾嚴(yán)重。通過加入少量酸性調(diào)節(jié)劑可以改善此類情況。酸性調(diào)節(jié)劑有多種選擇，如甲酸、乙酸、磷酸等［9］，在預(yù)試驗中，選擇甲醇-0.5%乙酸水溶液作為流動相，將13種100 mg/L的對照品儲備溶液上機檢測，得到13種對照品儲備溶液的出峰時間。由表3的出峰時間可以判斷，以甲醇-0.5%乙酸水溶液作為流動相并不理想。同時，甲醇和乙腈均具有較好分離效果，但乙腈的毒性較大，因此選擇甲醇作為有機流動相。綜上，本試驗以甲醇（100%）作為有機流動相（流動相A），以磷酸（0.5%）作為酸性調(diào)節(jié)劑（流動相B）。

2.1.3 梯度洗脫 采用等度洗脫的模式，流動相A（100%甲醇）與流動相B（0.5%磷酸水溶液）以1∶1的比例進行洗脫，總時長為1 h，流速為0.3 mL/min，在此模式下，分離度較差，達不到本試驗的預(yù)期目的。因此將等度洗脫改為梯度洗脫，流速為1 mL/min，通過對13種酚酸色譜（280 nm）（圖1）進行分析可知，梯度洗脫程序能很好地將13種酚酸分離，得到較好的色譜圖。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了準(zhǔn)確計算陜西平利絞股藍樣品中酚酸含量，分別取100 mg/L混合對照品使用液適量，用甲醇配制成5個不同濃度的混合對照品使用液，分別為100、50、25、10、5 mg/L，在280 nm波長和梯度洗脫條件下進樣檢測，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表4可知，13種酚酸在濃度為5～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.998。

2.3 精密度試驗

取平利3#樣品，按照“1.4.1”方法對樣品進行前處理，得到上機檢測樣品溶液，重復(fù)進樣5次［17］，記錄峰面積，同時根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中酚酸含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），如表5所示。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取平利3#樣品，按照“1.4.1”方法對樣品進行前處理，分別在0、4、8、12、16、24 h進樣［13］。計算峰面積、酚酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6），如表6所示。結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一平利3#樣品，按照“1.4.1”方法對樣品進行前處理，平行5份［18，19］，在波長280 nm和梯度洗脫條件下檢測，記錄峰面積以及計算酚酸含量，從而計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5），如表7所示。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收試驗

根據(jù)本試驗方法，分別精密稱取5份平利3#粉末5 g，按“1.4.1”方法對樣品進行前處理，精密加入0.5 mL 100 mg/L的混合對照品使用液，混勻后在280 nm波長和梯度洗脫條件下進行測定，重復(fù)進樣5次，計算平均加標(biāo)回收率［20，21］，如表8所示。9種酚酸的平均加標(biāo)回收率為61.8%～131.0%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于絞股藍中酚酸含量的測定。

2.7 樣品測定

由表9可知，平利1#葉樣品檢出8種酚酸，分別為新綠原酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、鞣花酸，總含量為13.440 mg/g，平均含量為1.680 mg/g。平利1#莖樣品檢出9種酚酸，總含量為13.093 mg/g，平均含量為1.455 mg/g。平利2#葉樣品檢出6種酚酸，總含量為1.330 mg/g，平均含量為0.222 mg/g。平利2#莖樣品檢出7種酚酸，總含量11.939為 mg/g，平均含量為1.706 mg/g。平利3#號樣品檢出9種酚酸，總含量為18.203 mg/g，平均含量為2.023 mg/g。平利4#樣品檢出7種酚酸，總含量為13.300 mg/g，平均含量為1.900 mg/g。

3 小結(jié)

不同品種、不同采集部位的陜西平利絞股藍中13種酚酸含量存在較大差異，如平利1#葉中鞣花酸含量高達10.56 mg/g，而平利2#葉、平利2#莖、平利3#、平利4#中未檢出鞣花酸。本研究建立同時檢測陜西平利絞股藍中13種酚酸含量的高效液相色譜法，以甲醇（100%）和磷酸水溶液（0.5%）作為流動相，該測定方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，適用于陜西平利絞股藍中酚酸含量的測定，可以為絞股藍的進一步開發(fā)與利用提供參考。

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