36株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐藥表型和基因型特征分析

易雪麗 陳曉穎 滕元姬 羅斌

【摘要】目的分析廣西百色市某三級甲等醫(yī)院2020—2022年分離自臨床的36株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（CRKP）的耐藥性及耐藥機制，為醫(yī)院感染防控和指導臨床治療提供依據(jù)。

方法使用微量肉湯稀釋法及紙片擴散法檢測分離的36株CRKP對臨床常用抗生素及頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥性，同時使用聚合酶鏈式反應檢測常見耐藥基因攜帶情況，并使用碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測菌株攜帶的碳青霉烯酶種類。

結果36株CRKP對除頭孢他啶/阿維巴坦之外的所有β內(nèi)酰胺類藥物和氟喹諾酮類藥物耐藥率均超過90%，對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥率為33.3%，對阿米卡星的耐藥率為63.9%，對磺胺類藥物復方新諾明耐藥率為61.1%。blaKPC攜帶率為63.89%，blaNDM攜帶率為19.44%，blaTEM攜帶率為75.00%，blaCTX-m攜帶率為16.67%，blaSHV攜帶率為91.67%，blaAmpc攜帶率為5.56%，未檢出攜帶blaOXA-48的菌株。表型檢測顯示有34株菌產(chǎn)碳青霉烯酶，其中23株單產(chǎn)A類酶，10株單產(chǎn)B類酶，1株同時產(chǎn)A類酶和B類酶。

結論通過對常見CRKP耐藥性及基因表型進行調(diào)查可以為臨床抗生素的合理應用和感染的防控提供科學依據(jù)。

【關鍵詞】肺炎克雷伯菌；耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；頭孢他啶/阿維巴坦

中圖分類號：R378.99+6文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.05.004

Analysisondrugresistancephenotypeandgenotypecharacteristicsof36carbapenemresistantKlebsiellapneumoniaestrains

YIXueli，CHENXiaoying，TENGYuanji，LUOBin

（CenterforMedicalLaboratoryScience，theAffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities，Baise533000，Guangxi，China）

【Abstract】ObjectiveToanalyzethedrugresistanceanddrugresistancemechanismof36strainsofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae（CRKP）isolatedinanationalcomprehensivethreeA-levelhospitalfrom2020to2022inBaise，Guangxi，soastoprovidebasisforhospitalinfectionpreventionandcontrolandtheguidanceofclinicaltreatment.

MethodsTheresistanceof36strainsofCRKPtocommonclinicalantibioticsandceftazidime/avertamwasdetectedbybrothmicrodilutionmethodandKirby-Bauermethod.Atthesametime，polymerasechainreactionwasusedtodetectthecarryingofcommondrugresistancegenes.Carbapenemenzymeinhibitorenhancementtestwasusedtodetectthetypesofcarbapenemenzymescarriedbythestrains.

Results36CRKPshowedover90%resistancetoallβlactaamsandfluoroquinolonesexceptceftazidime/avibactam，33.3%resistancetoceftazidime/avibactam，63.9%resistancetoamikacin，and61.1%resistancetosulfacotrimoxazole.ThecarryingrateofblaKPC，blaNDM，blaTEM，blaCTX-m，blaSHV，andblaAmpcwas63.89%，19.44%，75.00%，16.67%，91.67%，and5.56%，respectively.NostraincarryingblaOXA-48wasdetected.Phenotypicdetectionshowedthat34strainsproducedcarbapenem，ofwhich23strainsproducedclassAenzymes，10strainsproducedclassBenzymes，and1strainproducedbothclassAandBenzymes.

ConclusionInvestigationofcommonCRKPresistanceandgenephenotypescanprovideascientificbasisfortherationalapplicationofclinicalantibioticsandthepreventionandcontrolofinfection.

【Keywords】Klebsiellapneumoniae;carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae（CRKP）;carbapenem;ceftazidime/avibactam

肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae，KP）是腸桿菌目革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界及人體內(nèi)，通常屬于條件致病菌，可引起呼吸道感染、泌尿道感染、肝膿腫和血流感染等多種機會感染。全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)和中國CHINET監(jiān)測網(wǎng)的統(tǒng)計結果顯示，KP在臨床分離的革蘭陰性桿菌中排第二位，同時隨著碳青霉烯類藥物在臨床的廣泛應用，KP對該類藥物的耐藥性逐年上升［1-2］。2005至2021年，中國CHINET監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP）的檢出率從3%上升至23%以上［3］。而全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)也顯示2019年CRKP的檢出率已經(jīng)上升至10.9%［4］。CRKP除了對碳青霉烯類藥物耐藥之外，還常常同時攜帶多種耐藥基因，對大部分臨床常用抗生素都顯示為耐藥，致使臨床常常面臨著無藥可用的困境。特別是由CRKP引起的醫(yī)院感染暴發(fā)時，更是給臨床治療帶來了極大的困難。因此，本研究擬對本院分離的CRKP菌株的耐藥性和基因型特征進行分析，探討CRKP對臨床常用抗生素的耐藥性以及常見耐藥機制，以求為臨床抗感染治療和醫(yī)院感染防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

收集2020年4月—2022年8月右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院患者臨床分離的CRKP菌株，剔除同一患者分離自相同部位的重復菌株。菌株入選標準：①菌株鑒定結果為KP；②藥敏結果符合美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI）M100-S31中的判定標準，即對亞胺培南、美羅培南或厄他培南其中一種碳青霉烯類藥物耐藥的CRKP菌株。

1.1.2儀器與試劑

細菌鑒定使用法國梅里埃VITEKMS質(zhì)譜儀及其配套的VITEKMS-CHCA基質(zhì)，微量肉湯稀釋法使用法國梅里埃VITEK2-COMPACT全自動微生物分析儀及其配套的AST-GN334藥敏卡片，紙片擴散法（Kirby-Bauer，K-B）使用的藥敏紙片及M-H培養(yǎng)基購自英國OXOID生物公司，PCR儀、電泳儀及凝膠成像設備購自美國伯樂公司，PCR擴增試劑購自寶生物工程（大連）有限公司，碳青霉烯酶緩沖液購自珠海迪爾生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細菌分離鑒定及常規(guī)藥敏試驗

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程（第4版）》要求進行細菌分離培養(yǎng)；使用法國梅里埃VITEKMS對分離菌株進行鑒定；使用法國梅里埃VITEK2-COMPACT及AST-GN334藥敏卡片進行常規(guī)藥敏試驗，頭孢他啶/阿維巴坦使用紙片擴散法進行藥敏試驗，藥敏結果判斷參照CLSIM100-S31進行判讀。對儀器檢測出來的CRKP菌株使用英國OXOID的厄他培南、亞胺培南和美羅培南藥敏紙片進行復核，復核后置于-80℃超低溫冰箱保存。使用大腸埃希菌ATCC8739、銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株，菌株為本實驗室保存質(zhì)控菌株。

1.2.2常見耐藥基因檢測

菌株從冰箱復蘇到血平板后，置于35℃大氣環(huán)境培養(yǎng)16～18h后，挑取單個菌落使用煮沸法提取細菌DNA。參考文獻合成blaKPC、blaNDM、blaOXA-48、blaAmpc、blaCTX-m、blaTEM和blaSHV引物，引物相關序列及退火溫度見表1［5-9］。使用寶生物工程（大連）有限公司的PCR擴增試劑進行擴增，采用50μL的反應體系，擴增條件：98℃變性10s，退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后每個基因取一個陽性擴增產(chǎn)物送至廣州艾基生物有限公司測序，測序結果在GenBank中經(jīng)BLAST比對分析，確定為目的基因后作為陽性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像后與陽性對照進行比對，所出現(xiàn)條帶與陽性對照大小相同者為陽性結果。

1.2.3碳青霉烯酶表型檢測

參照《腸桿菌目細菌碳青霉烯酶的實驗室檢測和臨床報告規(guī)范專家共識（第二版）》，進行A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β內(nèi)酰胺酶檢測［10］。

2結果

2.1細菌分離鑒定及常規(guī)藥敏試驗

2020年4月—2022年8月從右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院患者臨床樣本中共分離出36株非重復的CRKP菌株，使用法國梅里埃VITEKMS質(zhì)譜儀進行鑒定，結果顯示所有菌株均為肺炎克雷伯菌，鑒定符合率均在95%以上。36株CRKP對阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢西丁和厄他培南耐藥率均為100%，對其他β內(nèi)酰胺類藥物哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南和美羅培南耐藥率也均在90%以上，對阿米卡星的耐藥率為63.9%，對左旋氧氟沙星耐藥率為97.2%，對復方新諾明耐藥率為61.1%，對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥率為33.3%。見表2。

2.2常見耐藥基因攜帶情況

36株CRKP中，常見碳青霉烯酶基因檢測顯示以攜帶blaKPC為主，共有23株，攜帶率為63.89%；有7株攜帶blaNDM，攜帶率為19.44%；未檢出攜帶blaOXA-48的菌株。常見超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因檢測顯示有27株攜帶blaTEM基因，攜帶率為75.00%；有6株攜帶blaCTX-m，攜帶率為16.67%，有33株攜帶blaSHV，攜帶率為91.67%。此外有2株攜帶blaAmpc基因，攜帶率為5.56%。C9及D1菌株耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。

2.3碳青霉烯酶表型檢測

36株CRKP中，23株單產(chǎn)A類酶，10株單產(chǎn)B類酶，1株同時產(chǎn)A類酶和B類酶，2株既不產(chǎn)A類酶也不產(chǎn)B類酶。部分菌株碳青霉烯酶抑制劑增強試驗陽性結果見圖2。菌株常見耐藥基因及碳青霉烯酶表型檢測結果見表3。

3討論

CRKP最主要的耐藥機制是產(chǎn)碳青霉烯酶，除了產(chǎn)碳青霉烯酶之外，有少部分菌株的耐藥機制是產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶和/或Ampc酶合并外膜孔蛋白表達下調(diào)或者缺失。Ambler分類將碳青霉烯酶分為A類、B類和D類三大類，A類為絲氨酸蛋白酶，以KPC酶最為常見；B類為金屬酶，以NDM酶最為常見；D類主要以OXA-48酶最為常見。由于耐藥菌株編碼碳青霉烯酶的耐藥基因通常在質(zhì)粒上，而且質(zhì)粒常常還同時攜帶有對其他抗菌藥物耐藥的基因，因而常表現(xiàn)出廣泛耐藥甚至是全耐藥的特征，并容易在不同菌株及菌種之間傳播，可引起院內(nèi)暴發(fā)感染，致使臨床的抗感染治療面臨著無藥可用的困境［11-12］。本研究顯示，36株分離株對除頭孢他啶/阿維巴坦之外的所有β內(nèi)酰胺類藥物和氟喹諾酮類藥物耐藥率均超過90%，對阿米卡星的耐藥率為63.9%，對磺胺類藥物復方新諾明耐藥率為61.1%，這一結果與國內(nèi)其他報道相符［13-15］。

頭孢他啶/阿維巴坦是由頭孢他啶和阿維巴坦組成的新型抗生素，其對碳青霉烯耐藥腸桿菌目細菌（carbapenem-resistantenterobacterales，CRE）具有較好的抗菌活性，我國2019年9月批準可以使用其治療CRE感染。然而頭孢他啶/阿維巴坦對A類酶和部分D類酶有抗菌活性，對B類金屬酶無抗菌活性，因此針對產(chǎn)生不同型別碳青霉烯酶的CRE菌株，用藥治療方案會有差異，明確CRE的耐藥機制有利于指導治療方案的制訂［16］。自2015年FDA批準臨床使用頭孢他啶/阿維巴坦治療CRE以來，關于產(chǎn)生耐頭孢他啶/阿維巴坦的CRE菌株的報道越來越多，在我國也陸續(xù)有相關報道，尤其是耐頭孢他啶/阿維巴坦的KP。目前我國大部分實驗室不常規(guī)進行頭孢他啶/阿維巴坦的藥敏試驗，因此缺乏CRE對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥性的相關流行病學數(shù)據(jù)，臨床主要以經(jīng)驗治療為主。隨著越來越多的耐藥突變體的出現(xiàn)，經(jīng)驗治療失敗的概率也在不斷增加，因此針對頭孢他啶/阿維巴坦進行常規(guī)藥敏試驗有助于減少經(jīng)驗治療失敗的可能。本研究中有12株CRKP顯示對頭孢他啶/阿維巴坦產(chǎn)生耐藥性，除了編號為D1的菌株之外，其余頭孢他啶/阿維巴坦耐藥菌株均產(chǎn)B類金屬酶。KP對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥機制主要有三種：①產(chǎn)生B類金屬酶；②KPC酶的表達增加與膜孔蛋白突變；③blaKPC基因關鍵位點發(fā)生突變［17］。2022年復旦大學附屬華山醫(yī)院在《柳葉刀》報道了1例使用頭孢他啶/阿維巴坦治療后，一株KP的blaKPC-2基因發(fā)生突變進化為blaKPC-76，進而引起頭孢他啶/阿維巴坦耐藥，導致治療失敗的病例［18］。自2020年以來，blaKPC基因突變體的數(shù)量迅速增加。到目前為止，GenBank數(shù)據(jù)庫中登記有145個blaKPC突變體，所有這些突變體都是blaKPC-2和blaKPC-3的突變，關于這些突變體的報告主要來自美國和中國［19］。D1菌株檢測結果顯示同時攜帶blaKPC、blaAmpc、blaTEM和blaSHV四個耐藥基因，不排除可能為blaKPC產(chǎn)生突變引起的耐藥，其具體耐藥機制有待后續(xù)進一步探討。

不同國家和地區(qū)流行的CRE菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶型別均有差異，CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)對2018年收集自全國的935株CRE研究結果顯示，產(chǎn)KPC酶、NDM酶和OXA-48型碳青霉烯酶菌株所占比例分別為51.6%、35.7%和7.3%，其中有少數(shù)菌株產(chǎn)生多種碳青霉烯酶。而在美國，則以產(chǎn)NDM酶最為常見，OXA-48較少［10］。本研究顯示，本院分離的CRKP以產(chǎn)KPC酶為主，占比為63.89%，NDM酶次之，占比為19.44%，未檢出產(chǎn)OXA-48的菌株。這一結果與CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)調(diào)查結果相似。除了地域區(qū)別之外，兒童和成人分離菌株的碳青霉烯酶攜帶型別也有差異，NDM酶主要見于從兒童患者中分離的CRE，而從成人患者中分離的CRE則主要是以產(chǎn)KPC酶為主［20］。本研究收集的菌株均來自成人患者，因此無法比較不同人群間的差異。除了碳青霉烯酶耐藥基因之外，我們還檢測到了幾個常見的超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因和Ampc酶基因，結果顯示大部分菌株都同時攜帶有超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因，以blaSHV攜帶率最高，其次是blaTEM，較少菌株攜帶有blaCTX-m。而blaAmpc基因攜帶率較低，僅有2株檢出。當菌株同時產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶時，由于碳青霉烯酶會影響超廣譜β內(nèi)酰胺酶表型檢測的結果，因此在發(fā)放臨床報告的時候應注意避免發(fā)放假陰性的超廣譜β內(nèi)酰胺酶表型檢測結果。

目前，細菌耐藥已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生問題，尤其是近幾年CRKP的高發(fā)病率及高致死率，因此對本地區(qū)常見CRKP耐藥性和基因表型進行調(diào)查可以為臨床抗生素的合理應用和感染的防控提供科學依據(jù)。

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