LncRNA FGD5.AS1靶向miR.16.5p/CREB1軸減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)大鼠H9c2心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

謝小芳 趙展慶 符妹垂

摘要 目的： 探究長鏈非編碼RNA（LncRNA）FGD5反義RNA1（FGD5.AS1）對缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響以及對微小RNA.16.5p/cAMP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（miR.16.5p/CREB1）軸的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法： 將H9c2細(xì)胞分為對照組和H/R組（缺氧6 h，復(fù)氧6 h），然后將H/R組細(xì)胞分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為oe.NC組、oe.FGD5.AS1組、oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC組、oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組。實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT.qPCR）檢測細(xì)胞中FGD5.AS1、miR.16.5p、CREB1的mRNA水平；蛋白免疫印跡（Western Blot）法測定裂解凋亡蛋白酶.3（cleaved Caspase.3）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病.2（Bcl.2） 和Bcl.2相關(guān)X蛋白（Bax）蛋白表達(dá)；CCK.8法測定細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分別驗(yàn)證miR.16.5p 和FGD5.AS1、CREB1的靶向關(guān)系。 結(jié)果： 與對照組比較，H/R組細(xì)胞中FGD5.AS1和CREB1的mRNA水平、細(xì)胞存活率、Bcl.2蛋白表達(dá)降低（ P ＜0.05），miR.16.5p mRNA水平、細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase.3、Bax蛋白表達(dá)升高（ P ＜0.05）；與H/R組和oe.NC組比較，轉(zhuǎn)染過表達(dá)FGD5.AS1基因的H9c2細(xì)胞中FGD5.AS1和CREB1的mRNA水平、細(xì)胞存活率、Bcl.2蛋白表達(dá)增高，凋亡率及miR.16.5p、cleaved Caspase.3、Bax水平下降（ P ＜0.05）。雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了FGD5.AS1、CREB1均與miR.16.5p有結(jié)合位點(diǎn)。 結(jié)論： 過表達(dá)FGD5.AS1可能通過靶向下調(diào)miR.16.5p表達(dá)，上調(diào)CREB1表達(dá)，抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞 ?缺氧/復(fù)氧；FGD5反義RNA 1；微小RNA.16.5p/cAMP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白1軸；心肌細(xì)胞凋亡

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.008

LncRNA FGD5.AS1 Targeting miR.16.5p/CREB1 Axis Alleviates Hypoxia/Reoxygenation Induced Apoptosis of Rat H9c2 Cardiomyocytes

XIE Xiaofang， ZHAO Zhanqing， FU Meichui

Hainan West Central Hospital， Danzhou 571700， Hainan， China

Corresponding Author ?FU Meichui， E.mail： fumeichui2022@163.com

Abstract Objective： To explore the effect of long non.coding RNA（LncRNA） FGD5 antisense RNA1（FGD5.AS1） on the apoptosis of rat H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation（H/R） and the regulatory mechanism of microRNA.16.5p/cAMP response element.binding protein 1（miR.16.5p/CREB1） axis. ?Methods： H9c2 cardiomyocytes were divided into control group and H/R group（hypoxia for 6 h，reoxygenation for 6 h）.H/R group cells were transfected separately，then divided into oe.NC group，oe.FGD5.AS1 group，oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC group，and oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic group.Real.time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT.qPCR） was used to detect the mRNA levels of FGD5.AS1，miR.16.5p and CREB1 in cells.The expression of cleaved Caspase.3，B.cell lymphoma/leukemia.2（Bcl.2） and Bcl.2 associated X protein（Bax） were measured by Western Blot.Cell survival rate was measured by CCK.8 method.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.The targeting relationship between miR.16.5p mRNA，F(xiàn)GD5.AS1 and CREB1 was verified by double luciferase activity assay. ?Results： Compared with the control group，mRNA levels of FGD5.AS1 and CREB1，cell survival rate，and Bcl.2 protein expression in H/R group decreased（ P ＜0.05），miR.16.5p mRNA levels，apoptosis rate，and cleaved Caspase.3 and Bax protein expressions increased（ P ＜0.05）.Compared with H/R group and oe.NC group，mRNA levels of FGD5.AS1 and CREB1，cell survival rate，Bcl.2 protein expression increased in H9c2 cells transfected with FGD5.AS1 gene overexpression，the apoptosis rate，levels of miR.16.5p，cleaved Caspase.3，and Bax decreased（ P ＜0.05）.Dual luciferase activity test verified that FGD5.AS1 and CREB1 had binding sites with miR.16.5p. ?Conclusion： Overexpression of FGD5.AS1 may inhibit H/R.induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes through targeted down.regulation of miR.16.5p expression and up.regulation of CREB1 expression.

Keywords ??hypoxia/reoxygenation; FGD5 antisense RNA 1; microRNA.16.5p/cAMP response element.binding protein 1 axis; myocardial ?cells apoptosis

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由于動脈壁上斑塊形成導(dǎo)致心臟血流量減少引起的心臟病。心肌梗死有效的干預(yù)策略是缺血后再灌注，但再灌注會引起心肌缺血再灌注（I/R）損傷并可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡和壞死 ?［1.2］ 。因此，減少心肌細(xì)胞凋亡是心肌I/R損傷預(yù)防和治療的關(guān)鍵。FGD5反義RNA 1（FGD5 antisense RNA 1，F(xiàn)GD5.AS1）是一種癌相關(guān)基因，也是急性心肌梗死發(fā)展中重要的長鏈非編碼RNA（long non.coding RNA，lncRNA），可通過靶向微小RNA（miRNAs）來調(diào)節(jié)心肌I/R損傷后的心肌細(xì)胞凋亡 ?［3］ 。miR.16.5p在心肌缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）中表現(xiàn)為上調(diào)，且可以被lncRNA海綿化來調(diào)節(jié)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷 ?［4］ 。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）響應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP response element.binding protein 1，CREB1）是基因編碼的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以作為miRNA的功能靶標(biāo)調(diào)節(jié)心肌梗死誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡 ?［5］ ，但其與miR.16.5p以及FGD5.AS1靶向關(guān)系的研究較少。因此，本研究基于miR.16.5p/CREB1軸探討FGD5.AS1影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

大鼠H9c2心肌細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)會 保藏委員會細(xì)胞庫；過表達(dá)FGD5.AS1（oe.FGD5.AS1）、 ?miR.16.5p mimic、陰性對照oe.NC/miR.16.5p mimic.NC、 ?p.mirGLO.FGD5.AS1.WT/MUT、p.mirGLO.CREB1.WT/.MUT 質(zhì)粒購于上海吉凱基因公司；Lipofectamine ?TM 3000轉(zhuǎn)染試劑購于北京百奧創(chuàng)新科技有限公司；HiScriptⅡ一 步法實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法 （RT.qPCR）SYBR綠色染料試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；膜聯(lián)蛋白Ｖ.異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V.FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于北京富百科生物技術(shù)有限公司；裂解凋亡蛋白酶.3（cleaved Caspase.3）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病.2（Bcl.2）和Bcl.2相關(guān)X蛋白（Bax）一抗購于英國Abcam公司；細(xì)胞活性檢測（CCK.8）試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司；羊抗兔IgG（H&L）購于武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理

將大鼠H9c2細(xì)胞分為對照組和H/R組，對照組采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，H/R組細(xì)胞先在缺氧培養(yǎng)箱中用不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，再換成含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基并在常氧培養(yǎng)箱中復(fù)氧 6 h ?［6］ 。然后，將H/R組細(xì)胞按照Lipofectamine ?TM 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為H/R組（缺氧6 h，復(fù)氧6 h）、oe.NC組（轉(zhuǎn)染過表達(dá)FGD5.AS1陰性對 照）、oe.FGD5.AS1組（轉(zhuǎn)染過表達(dá)FGD5.AS1）、 oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC組（共轉(zhuǎn)染過表 達(dá)FGD5.AS1和miR.16.5p mimic陰性對照）、 oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組（共轉(zhuǎn)染過表達(dá)FGD5.AS1和miR.16.5p mimic），48 h后分別提取各 組細(xì)胞的RNA，檢測FGD5.AS1、miR.16.5p、CREB1 mRNA 表達(dá)情況，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.2 qRT.PCR測定FGD5.AS1、miR.16.5p和CREB1 mRNA表達(dá)

用Trizol從細(xì)胞中提取總RNA。采用HiScriptⅡ 一步法qRT.PCR SYBR綠色染料試劑盒進(jìn)行RT.qPCR。 反應(yīng)體系：Green Mix，10 μL；One Step SYBR Green Enzyme，1 μL；Forward Primer，0.4 μL；Reverse ?Primer，0.4 μL；RNA，1 μL；H 2O，7.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。以甘油醛.3.磷酸脫氫酶（GAPDH）、U6為內(nèi)參，采用2 ?－ΔΔCt 法計算目的基因的相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

1.2.3 ?CCK.8測定細(xì)胞增殖活力

于96孔板（每孔5×10 3）每孔中所有培養(yǎng)細(xì)胞與10 mL CCK.8試劑在37 ℃下孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測吸光值，并計算細(xì)胞存活率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡

用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌處理過的細(xì)胞2次，并調(diào)整濃度至2×10 5個細(xì)胞/mL。取100 μL樣品 （5×10 4個細(xì)胞）加入5 mL培養(yǎng)管，在管中分別加入 5 μL Annexin V.FITC和10 μL PI。將細(xì)胞輕輕旋轉(zhuǎn)，在25 ℃黑暗中孵育20 min。每管加1×結(jié)合緩沖液500 μL。采用流式細(xì)胞儀立即對細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法測定Bax、cleaved Caspase.3、Bcl.2蛋白表達(dá)

用RIPA裂解液從H9c2細(xì)胞中提取總蛋白。蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS.PAGE）分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)2 h。印跡用cleaved Caspase.3、Bax、Bcl.2一抗（1∶2 000）進(jìn)行 探針檢測。然后用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗 （1∶500）室溫孵育1 h。用顯色試劑孵育3～5 s。用Image J軟件分析蛋白帶，并歸一化為甘油醛.3.磷酸脫氫酶（GAPDH）。

1.2.6 ?熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測miR.16.5p與FGD5.AS1或CREB1 的靶向關(guān)系

StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，miR.16.5p與 FGD5.AS1或CREB1存在結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增FGD5.AS1和CREB1 片段，并將其插入到pmirGLO載體，建立FGD5.AS1野生型質(zhì)粒（p.mirGLO.FGD5.AS1.WT）和CREB1野生型質(zhì)粒（p.mirGLO.CREB1.WT）。然后通過基因突變技術(shù)將FGD5.AS1和CREB1突變，構(gòu)建成FGD5.AS1突變型質(zhì)粒（p.mirGLO.FGD5.AS1.MUT）和CREB1突變型質(zhì)粒（p.mirGLO.CREB1.MUT）。將miR.16.5p mimic或miR.16.5p mimic.NC分別與相應(yīng)的報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后測定熒光酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ?± s ）表示，采用單因素方差分析和SNK. q 檢驗(yàn)。以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FGD5.AS1、miR.16.5p、CREB1在各組H9c2細(xì)胞中的mRNA表達(dá)

相較于對照組，H/R組FGD5.AS1 mRNA、CREB1 ?mRNA 表達(dá)下降，miR.16.5p mRNA表達(dá)增加（ P ＜ 0.05）；與H/R組和oe.NC組比較，oe.FGD5.AS1組 FGD5.AS1 mRNA、CREB1 mRNA表達(dá)均升高， ?miR.16.5p mRNA表達(dá)降低（ P ＜0.05）；與oe.FGD5.AS1 和oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC 組比較， oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組FGD5.AS1 mRNA、CREB1 mRNA表達(dá)均降低，miR.16.5p mRNA表達(dá)升高（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.2 過表達(dá)FGD5.AS1對細(xì)胞存活率和凋亡率的影響

H/R組與對照組比較，細(xì)胞存活率下降，凋亡率增高（ P ＜0.05）；oe.FGD5.AS1組與H/R組和oe.NC組 比較，存活率均增加，凋亡率均下降（ P ＜0.05）；與 ?oe.FGD5.AS1組和oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC組 比較，oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組細(xì)胞存活率均降低，凋亡率均升高（ P ＜0.05）。詳見圖1、表3。

2.3 ?過表達(dá)FGD5.AS1對細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對照組比較，H/R組Bax、cleaved Caspase.3 蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl.2蛋白表達(dá)下調(diào)（ P ＜0.05）；與H/R 組和oe.NC組比較，oe.FGD5.AS1組Bax、cleaved ?Caspase.3 蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl.2蛋白表達(dá)上調(diào)（ P ＜0.05）； 與 ?oe.FGD5.AS1組和oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC 組比較，oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組Bax、cleaved Caspase.3蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl.2蛋白表達(dá)下調(diào)（ P ＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.4 miR.16.5p與FGD5.AS1和CREB1之間的相互作用

StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測的miR.16.5p與FGD5.AS1、 CREB1的作用位點(diǎn)如圖3所示。轉(zhuǎn)染miR.16.5p mimic導(dǎo)致轉(zhuǎn)染FGD5.AS1.WT或CREB1.WT的H9c2細(xì)胞熒光素酶活性下降（ P ＜0.05），這種效應(yīng)被FGD5.AS1或CREB1基因的突變所消除。詳見圖4、圖5。

3 討 論

冠狀動脈的急性和持續(xù)性缺氧缺血會誘發(fā)心肌壞死，進(jìn)而發(fā)生心肌梗死，最終導(dǎo)致心功能受損，并引起炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等一系列生理活動 ?［7］ 。因此，更好地了解參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子對研究治療心肌梗死的新靶點(diǎn)至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA已經(jīng)在多種器官的I/R損傷中檢測到lncRNA的異常表達(dá)。例如，lncRNA FGD5.AS1在急性心肌梗死病人和缺氧細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而過表達(dá)FGD5.AS1增加了H/R處理的心肌細(xì)胞活性，降低了細(xì)胞凋 ?亡 ?［8.9］ 。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H/R組細(xì)胞中FGD5.AS1 mRNA ???水平明顯低于對照組，而與H/R組比較，oe.FGD5.AS1組細(xì)胞中FGD5.AS1 水平、細(xì)胞存活率升高，凋亡率下降，表明FGD5.AS1可加速H/R心肌細(xì)胞增殖，減輕凋亡，然而其分子機(jī)制仍需深入探討。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)lncRNA可通過海綿化miRNAs，進(jìn)一步調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)。miRNA作為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因，可以與下游靶基因的3′.UTR結(jié)合以抑制靶基因表達(dá) ?［10］ 。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR.16.5p可以通過靶向IRS1增加心肌細(xì)胞活力并抑制H/R心肌細(xì)胞凋亡 ?［11］ 。CREB1是癌發(fā)生的相關(guān)因子，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖并抑制凋亡，而另一項研究發(fā)現(xiàn)，CREB1通過激活miR.376a.3p可以促進(jìn)心力衰竭大鼠的心臟功能恢復(fù) ?［12.13］ 。本研究結(jié)果顯示，oe.FGD5.AS1組細(xì)胞中miR.16.5p mRNA水平降低，CREB1 ?mRNA水平升高。揭示了FGD5.AS1過表達(dá)可能下調(diào)miR.16.5p表達(dá)，上調(diào)CREB1表達(dá)。已知cleaved Caspase.3是細(xì)胞發(fā)生凋亡Caspase.3被切割活化形成的，促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl.2作為Bcl.2家族成員，也 是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵標(biāo)志物 ?［14.15］ 。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， ?oe.FGD5.AS1組心肌細(xì)胞的凋亡率及cleaved Caspase.3、 Bax蛋白表達(dá)低于H/R組，細(xì)胞存活率和Bcl.2蛋白表達(dá)高于H/R組。而miR.16.5p mimic的恢復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GD5.AS1過表達(dá)對心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，且StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測及熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)均顯示FGD5.AS1、CREB1與miR.16.5p之間均存在靶向關(guān)系，揭示了FGD5.AS1過表達(dá)抑制H/R誘導(dǎo) 的H9c2心肌細(xì)胞凋亡可能是通過靶向下調(diào)miR.16.5p 表達(dá)，上調(diào)CREB1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，F(xiàn)GD5.AS1過表達(dá)可通過靶向調(diào)控miR.16.5p/CREB1軸來抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡，可能是心肌梗死等心血管疾病治療的潛在靶點(diǎn)。然而，本研究未進(jìn)行FGD5.AS1的敲低實(shí)驗(yàn)，缺乏對比，且分子機(jī)制研究不夠深入，有待后續(xù)探討。

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（收稿日期：2022.11.28）

（本文編輯 鄒麗）