淫羊藿次苷Ⅱ調節(jié)海馬tau蛋白磷酸化水平改善慢性腦低灌注大鼠的學習記憶功能障礙

尹彩霞 崔婷 張玨

【摘 要】???目的： 研究淫羊藿次苷Ⅱ（ICS Ⅱ）抗慢性腦低灌注（CCH）誘導的大鼠學習記憶功能減退的作用及其可能的作用機制。 方法： Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力，HE染色觀察海馬神經元的形態(tài)，Nissl染色觀察海馬神經元的存活數(shù)量，Western blot檢測海馬tau蛋白在絲氨酸199位點磷酸化（p-Ser 199-tau）、絲氨酸396位點磷酸化（p-Ser 396-tau）、絲氨酸404位點磷酸化（p-Ser 404-tau）及蘇氨酸231位點磷酸化（p-Thr 231-tau）的水平。 ?結果： ?ICS Ⅱ（16 mg/kg）能改善CCH大鼠的學習記憶障礙，減輕海馬CA1區(qū)神經元結構損傷，增加海馬CA1區(qū)存活神經元數(shù)量，降低海馬p-Ser 199-tau、p-Ser 396-tau、p-Ser 404-tau、p-Thr 231-tau的水平。 結論： ICS Ⅱ 具有改善CCH所致大鼠學習記憶功能減退及海馬神經元損傷的作用，其機制可能與下調tau蛋白異常磷酸化水平有關。

【關鍵詞】 ?淫羊藿次苷Ⅱ；tau蛋白；慢性腦低灌注；學習記憶；海馬神經元

【中圖分類號】R96

【文獻標志碼】 A ???【文章編號】1007-8517（2024）08-0037-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.08.zgmzmjyyzz202408009

Icariside II Improves Learning and Memory Impairments Induced by Chronic Cerebral Hypoperfusion

Through Regulating Tau Phosphorylation Levels in Rat Hippocampus

YIN Caixia CUI Ting ZHANG Jue

Zunyi Medical And Pharmaceutical College，Zunyi 563006，China

Abstract：

Objective ?To investigate the effect of icariside II （ICS II） on learning and memory impairments induced by chronic cerebral hypoperfusion（CCH）and the possible mechanisms in rats. ?Methods ?The learning and memory function of rats were detected by Morris water maze; morphology of hippocampal neurons were detected by HE staining; Neuronal survival quantity of hippocampus were detected by Nissl staining; Western blot was used to examine the levels of p-Ser199-tau， p-Ser396-tau， p-Ser404-tau and p-Thr231-tau. Results ?ICS Ⅱ （16 mg/kg） could improve learning and memory induced by CCH in rats， attenuate the hippocampal CA1 region neurons injury， increase the number of surviving neurons in hippocampal CA1 region， and decrease the levels of p-Ser 199-tau， p-Ser 396-tau， p-Ser 404-tau， p-Thr 231-tau in hippocampus. Conclusion ?Icariside II has an improvement effect on CCH-induced learning and memory impairments and neuronal injury of hippocampus in rats. The mechanism may be related to the down-regulation of tau phosphorylation levels.

Key words：

Icariside II; Tau; Chronic Cerebral Hypoperfusion; Learning and Memory; Hippocampal Neurons

血管性癡呆（vascular dementia， VD）是一種由缺血性中風、出血性腦卒中或腦血管疾病等引起的神經退行性疾病 ?［1-2］ 。其典型的臨床特征為嚴重的認知功能障礙、記憶能力減退及人格改變 ?［1］ 。研究 ?［3］ 證實VD最主要的發(fā)病機制是慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）。CCH是一種以持續(xù)性腦血流量減少為特征的病理變化過程，可誘發(fā)認知功能障礙、損傷海馬CA1區(qū)神經元，過程的發(fā)生與其促進tau蛋白過度磷酸化密切相關 ?［4-6］ 。Tau蛋白過度磷酸化可形成神經原纖維纏結，產生神經毒性作用，加重學習記憶能力減退，促進皮質和海馬部位神經元的損傷 ?［6-7］ 。研究 ?［6］ 顯示tau蛋白異常磷酸化水平的降低可有效改善CCH誘導的VD大鼠模型的認知功能障礙及神經元凋亡。由此可見，下調tau蛋白異常磷酸化水平對于改善CCH誘導的學習記憶功能減退及海馬神經元損傷具有重要作用。目前，臨床尚無理想的VD治療藥物。故而，基于VD的發(fā)病機制繼續(xù)探尋安全、高效的VD治療藥物刻不容緩。

淫羊藿次苷II（Icariside II，ICS II）是從貴州道地中藥材淫羊藿中提取得到的一種黃酮類化合物，其藥理作用非常廣泛，如抗骨質疏松、抗性功能障礙、抗衰老、抗糖尿病、抗炎、抗腫瘤及抗缺血性腦損傷等 ?［8-13］ 。近年來，ICS II在改善癡呆大鼠模型的學習記憶障礙及神經元損傷方面取得了較好的效果 ?［14］ 。特別是，ICS II可通過抑制β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的產生及促進Aβ的降解減輕CCH誘導的大鼠學習記憶減退及海馬神經元損傷，從而發(fā)揮抗VD的作用 ?［15］ 。然而，ICS II抗VD的作用是否還與其降低tau蛋白異常磷酸化水平有關尚不清楚。因此，實驗采用雙側頸總動脈結扎（bilateral common carotid artery ligation，BCCAO）誘導CCH，制備VD樣大鼠模型，選用ICS II有效劑量 16 mg/kg，以初步觀察ICS II對該模型大鼠學習記憶能力減退及海馬神經元損傷的影響，并探究其機制是否與下調tau蛋白異常磷酸化水平有關，為ICS II用于VD的治療提供更深入的基礎藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 ?實驗動物 SPF級雄性SD大鼠由重慶騰鑫華阜實驗動物銷售有限公司提供，體重230～ 250 g ，許可證號為SCXK-（京）2019-0008。將SD大鼠適應性飼養(yǎng)（每籠5只）7 d后進行后續(xù)實驗。

1.1.2 儀器 BX43正置顯微鏡（日本Olympus 公司）；DDY-10型電泳儀及DDY-7BⅢ型電轉儀（美國BIO-RAD公司）；RM2245輪轉式切片機（德國Leica公司）。TopScan Version 3.00水迷宮測試系統(tǒng)（北京吉安得爾科技有限公司）。

1.1.3 材料 淫羊藿次苷II（純度98%，CAS號：113558-15-9，上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司）；尼氏染色液（貨號：G1436，北京索萊寶科技有限公司）；p-Ser199-tau兔多克隆抗體（貨號：# 29957S，Cell Signaling 公司）；p-Ser396-tau兔單克隆抗體（貨號：ab32057）、p-Ser404-tau兔單克隆抗體（貨號：ab92676）、p-Thr231-tau兔單克隆抗體（貨號：ab151559）均購于英國Abcam有限公司；Tau 兔多克隆抗體（貨號：bs-20443R，北京博奧森生物技術有限公司）；GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥方法 將25只成年雄性SD大鼠隨機分為4組：假手術組（ n= 6）、假手術給藥組（ n= 6）、BCCAO組（ n= 7）及BCCAO給藥組（ n= 6）。大鼠經7% 水合氯醛溶液麻醉后以仰臥位固定于大鼠手術板上，然后用眼科剪沿頸部正中位置剪一2 cm切口，小心將左側和右側的頸總動脈從迷走神經、頸動脈鞘和胸骨舌骨肌中分離出來，并不可逆地將兩側頸總動脈進行結扎，制備CCH誘導的VD大鼠模型，同法分離假手術組和假手術給藥組大鼠的雙側頸總動脈，但不結扎。研究證實大鼠造模后需經9 d才可形成CCH ?［16］ 。因此，手術結束后第10天開始給藥，假手術給藥組及BCCAO給藥組每日一次灌胃給予 ICS II 16 mg/kg，假手術組及BCCAO組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥28 d。

1.2.2 學習記憶能力測試 給藥第24天行Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力，連續(xù)檢測 5 d。 其中，包括4天的定位航行和1天的空間探索。在定位航行實驗中，所有大鼠每天被檢測2次，同時記錄大鼠的逃避潛伏期，若大鼠在規(guī)定時間內（120 s）未找到站臺，則大鼠逃避潛伏期記為 120 s， 并引導大鼠于站臺上停留15 s。 將站臺撤去后進行空間探索實驗，所有大鼠被檢測1次，同時記錄大鼠在120 s內穿過目標象限的次數(shù)、在目標現(xiàn)象停留的時間百分比及游泳速度。根據Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)記錄的數(shù)據，進行Repeated measures ANOVA和One-Way ANOVA統(tǒng)計學分析。

1.2.3 海馬神經元形態(tài)結構及存活數(shù)量的觀察 5天的Morris水迷宮實驗結束后，每組大鼠隨機選取3只進行麻醉，后用PBS緩沖液和4%多聚甲醛對該大鼠作透灌處理，隨即斷頭 并小心剝離出全腦，此時，再繼續(xù)用4%多聚甲醛溶液將上述全腦固定7 d，固定好的全腦經石蠟包埋及冠狀切片（厚度為5 μm）后分別用蘇木素-伊紅和甲苯胺藍行HE染色和Nissl染色，最后用BX43正置光學顯微鏡觀察海馬部位神經元的形態(tài)結構及神經元的存活數(shù)量。

1.2.4 Tau蛋白各位點磷酸化水平的檢測 各組剩余大鼠經麻醉后斷頭取腦，大腦置于平整的冰袋上進行雙側海馬的分離，分離出來的海馬組織保存于-80 ℃低溫冰箱，后用Western blot法檢測該海馬組織中tau蛋白各位點磷酸化水平。操作如下：RIPA裂解液提取海馬組織總蛋白→BCA試劑盒測定蛋白濃度→用PBS和5×上樣緩沖液制備實驗樣本（含20 μg蛋白）→配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠→將實驗樣本加入該凝膠孔道中進行電泳→通過電轉將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜→ 用5%脫脂牛奶封閉該PVDF膜（封閉時間為2 h）→封閉好的膜加入對應一抗（p-Ser199-tau， 1∶?1000 ；p-Ser396-tau，1∶?1000；p-Ser404-tau，1∶?1000；p-Thr231-tau.，1∶?1000；tau， 1∶?2000 ；GAPDH，1∶?5000）→4 ℃過夜孵育→加入對應二抗（過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG（H+L），1∶?2000）→常溫反應60 min→用ECL發(fā)光劑顯影→結果用ImageJ軟件進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析本實驗所有數(shù)據，同時用均數(shù)加減標準差（ x ?±SEM）表示。水迷宮實驗中的逃避潛伏期采用Repeated measures ANOVA進行分析，其余數(shù)據均用One-Way ANOVA進行分析。 P< 0.05為有統(tǒng)計學意義； P< 0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ICS II對BCCAO誘導的大鼠學習記憶減退的影響 Morris水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力。如表1及圖1B所示，各組大鼠在定位航行實驗中的逃避潛伏期隨著時間的延長基本呈下降趨勢。與假手術組比較，BCCAO組大鼠的平均逃避潛伏期在Morris水迷宮實驗的第4天明顯延長（ P< 0.01）；與BCCAO組大鼠比較，BCCAO給藥組大鼠的平均逃避潛伏期在Morris水迷宮實驗的第4天明顯縮短（ P< 0.01）。如表2及圖1C所示，各組大鼠在空間探索實驗中的游泳速度無明顯差異，說明大鼠的運動功能對逃避潛伏期無影響。

2.2 ICS II對BCCAO誘導的大鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)結構損傷的影響 HE染色觀察海馬CA1區(qū)神經元的形態(tài)。如圖2所示，與假手術組大鼠比較，BCCAO組大鼠海馬CA1區(qū)神經元發(fā)生變性和萎縮；與BCCAO組大鼠比較，BCCAO給藥組大鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)結構趨于正常，沒有出現(xiàn)明顯的變性和萎縮現(xiàn)象。

2.3 ICS II阻遏BCCAO誘導的大鼠海馬CA1區(qū)存活神經元數(shù)目的減少 Nissl染色觀察海馬神經元的存活數(shù)量。如表3及圖3所示，與假手術組大鼠比較，BCCAO組大鼠海馬CA1區(qū)存活神經元數(shù)目明顯減少（ P< 0.01）；與BCCAO組大鼠比較，BCCAO給藥組大鼠海馬CA1區(qū)存活神經元數(shù)目增加（ P< 0.05）。

2.4 ICS II對各組大鼠海馬p-Ser199-tau、p-Ser396-tau水平的影響 Western blot檢測大鼠海馬p-Ser199-tau、p-Ser396-tau水平。如表4及圖4所示，與假手術組比較，BCCAO組p-Ser199-tau、p-Ser396-tau水平顯著增加（ P< 0.01）；ICS II 16mg/kg連續(xù)給藥28 d后，減少了BCCAO組大鼠海馬p-Ser199-tau、p-Ser396-tau水平（ P< 0.01； P< 0.05）。

2.5 ICS II對各組大鼠海馬p-Ser404-tau、p-Thr231-tau水平的影響 Western blot檢測大鼠海馬p-Ser404-tau、p-Thr231-tau水平。如表5及圖5所示，與假手術組大鼠比較，BCCAO組p-Ser404-tau、 p-Thr231-tau水平顯著增加（ ?P< ?0.01）；ICS II 16mg/kg連續(xù)給藥28 d天后，明顯減少了BCCAO組大鼠海馬p-Ser404-tau、 p-Thr231-tau水平（ P< 0.01）。

3 討論

VD所表現(xiàn)出來的漸進性認知功能障礙主要由CCH引起。CCH會導致腦血流量缺乏而減少大腦的能量供應，從而促進腦內tau蛋白異常磷酸化、Aβ沉積、海馬神經元變性及學習記憶能力減退等，最終產生與VD相似的行為學特征 ?［15， 17， 18］ 。雙側頸總動脈結扎（bilateral common carotid artery ligation，BCCAO）能夠成功地模擬人類CC H的病理學狀態(tài)，且被廣泛應用于VD的相關研究中 ?［4， 15， 19-21］ 。實驗采用BCCAO誘導CCH，制備類VD樣大鼠模型，觀察ICS II 是否能夠改善該模型大鼠的學習記憶障礙及海馬CA1區(qū)神經元損傷，并探尋其初步機制。本實驗Morris水迷宮結果與前期研究 ?［22］ 一致，均證實了BCCAO誘導的CCH會引發(fā)大鼠學習記憶功能退化，提示本實驗類VD樣大鼠模型的制備較為成功。值得關注的是，ICS II 16 mg/kg能明顯縮短BCCAO組大鼠的逃避潛伏期而不影響大鼠的游泳速度，提示本實驗所用SD大鼠的運動功能對該行為學結果無影響，更能證實ICS II具有改善類VD 樣大鼠學習記憶功能障礙的作用。

學習記憶能力的獲取與大腦海馬的結構及功能密切相關。海馬主要由3個區(qū)域組成，分別為CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)。其中，CA1區(qū)能完成記憶的編碼，CA3區(qū)能介導完整記憶的提取，DG區(qū)能產生新生神經元而協(xié)調空間記憶的格局分離。當海馬神經元發(fā)生凋亡、損傷或丟失時，會降低海馬突觸的可塑性，減弱長時程增強效應，最終造成空間學習記憶功能減退 ?［23-25］ 。而且，研究 ?［3］ 表明BCCAO誘導的CCH可導致海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)結構發(fā)生明顯的病理學改變。因而，本實驗采用HE染色觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經元的形態(tài)結構，結果與上述研究類似，BCCAO組大鼠海馬CA1區(qū)神經元發(fā)生明顯變性和萎縮，提示BCCAO誘導的CCH可能會通過干擾海馬CA1區(qū)正常的記憶編碼而使學習記憶能力退化。然而，ICS II 16 mg/kg的長期治療能夠明顯緩解其海馬CA1區(qū)神經元變性和萎縮的現(xiàn)象，提示ICS II 16 mg/kg對海馬CA1區(qū)神經元有保護作用。另外，海馬神經元損傷還可引起尼氏小體溶解或消失，使得存活神經元數(shù)目減少，而尼氏染色法可將尼氏小體染成藍色而反應存活神經元數(shù)量。故而，本實驗采用尼氏染色的方法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)神經元存活情況，結果顯示BCCAO組大鼠海馬CA1區(qū)存活神經元數(shù)目顯著減少，與Wang等 ?［19］ 的研究結果一致。同時，大鼠經ICS II 16 mg/kg治療28 d后，其海馬CA1區(qū)存活神經元數(shù)目呈增加趨勢，提示ICS II 16 mg/kg對BCCAO誘導的大鼠海馬CA1區(qū)存活神經元數(shù)目的減少有阻遏作用，這一作用可能會促進海馬CA1區(qū)記憶編碼的穩(wěn)定，有助于改善學習記憶能力。

Tau蛋白異常磷酸化導致的海馬神經元損傷是誘發(fā)學習記憶功能減退的主要機制之一 ?［26］ 。實際上，在大腦的神經元內，tau蛋白是一種含量較高且攜帶多種磷酸基團的微管相關蛋白，其主要作用是與微管結合而調節(jié)微管結構和軸突運輸，進而達到維持并固定神經細胞骨架的作用 ?［27］ 。但是，當tau蛋白在多個位點發(fā)生異常磷酸化后會干擾其與微管的結合而降低神經細胞骨架的穩(wěn)定性。同時，異常磷酸化的tau蛋白會在腦內聚集形成神經原纖維纏結而產生神經毒性，最終會導致神經元損傷及學習記憶功能障礙 ?［28-29］ 。更為重要的是，有文獻 ?［30］ 報道在BCCAO誘導的類VD樣大鼠模型的腦內tau蛋白異常磷酸化的水平過高，而通過抑制tau蛋白的異常磷酸化可減輕該大鼠模型的學習記憶功能障礙 ?［30］ 。因此，本實驗采用Western blot法檢測大鼠海馬tau蛋白在不同位點的磷酸化水平，結果顯示BCCAO組大鼠海馬tau蛋白在絲氨酸199（serines 199，Ser 199）、絲氨酸396（serines 396，Ser 396）、絲氨酸404（serines 404，Ser 404）以及蘇氨酸231（threonines 231，Thr 231）四個位點的磷酸化水平高于假手術組，即BCCAO組大鼠海馬p-Ser 199-tau、p-Ser 396-tau、p-Ser 404-tau及p-Thr 231-tau的水平高于假手術組，與前期研究結果 ?［27］ 一致。然而，BCCAO組大鼠經ICS II 16 mg/kg治療后其腦內tau蛋白在上述四個位點的磷酸化水平降低，提示ICS II 16 mg/kg可通過減少海馬p-Ser 199-tau、p-Ser 396-tau、p-Ser 404-tau及p-Thr 231-tau的水平，阻遏BCCAO誘導的類VD樣大鼠模型的神經元損傷及存活神經元數(shù)目的減少，發(fā)揮抗VD的作用。

綜上所述，實驗主要證實了p-Ser 199-tau、p-Ser 396-tau、p-Ser 404-tau及p-Thr 231-tau等四個磷酸化的tau蛋白能促進BCCAO誘導的大鼠學習記憶功能減退及海馬神經元損傷的發(fā)生與發(fā)展，進一步加深了筆者對VD發(fā)病機制的認識。ICS II能改善BCCAO誘導的大鼠學習記憶功能減退及海馬神經元損傷，其作用機理與減少tau蛋白的異常磷酸化水平有關。

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（收稿日期：2023-07-24 編輯：劉 斌）