華法林鈉羥酮縮合雜質(zhì)的合成研究

摘 要 目的：合成華法林鈉生產(chǎn)工藝中產(chǎn)生的雜質(zhì)WF-Z1～WF-Z6；方法：以2’-羥基苯乙酮（SM-1）為起始原料與碳酸二甲酯（SM-2）進(jìn)行縮合反應(yīng)生成4-羥基-1-苯并吡喃-2-酮（WF-1），然后與4-苯基-3-丁烯-2-酮（SM-3）進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)得到3-（α-丙酮基芐基）-4-羥基香豆素（WF），最后在酸性條件下與甲醇，乙醇或異丙醇進(jìn)行縮酮反應(yīng)得到相應(yīng)的目標(biāo)雜質(zhì)WF-Z1～WF-Z6。結(jié)果：目標(biāo)雜質(zhì)采用液相聯(lián)用質(zhì)譜（LCMS），核磁共振氫譜（1H NMR），核磁共振碳譜（13C NMR）等檢測(cè)手段鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)論：合成的雜質(zhì)可以作為華法林鈉工藝雜質(zhì)的雜質(zhì)對(duì)照品，且本工藝路線起始原料廉價(jià)易得，有望用于工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 華法林 華法林鈉 工藝雜質(zhì) 合成

中圖分類號(hào)：O626.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2024）07-0071-05

引用本文 江云兵， 周偉， 朱陽(yáng). 華法林鈉羥酮縮合雜質(zhì)的合成研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（7）： 71-75.

Synthesis study of acetal impurities in warfarin sodium

JIANG Yunbing， ZHOU Wei， ZHU Yang

（the Central Research Institute of Shanghai Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To synthesize the impurities WF-Z1-WF-Z6 produced in the production process of warfarin sodium. Methods： Using 2′-hydroxyacetophenone （SM-1） as a starting material， 4-hydroxy-chromen-2-one （WF-1） was synthesized by condensation reaction with dimethyl carbonate （SM-2）. Subsequently， Michael addition reaction with 4-phenyl-3-buten-2-one （SM-3） was carried out to obtain 3-（α-acetoneylbenzyl）-4-hydroxycoumarin （WF）， and finally the corresponding target impurities WF-Z1-WF-Z6 were synthesized by reaction with methanol， ethanol or isopropanol under acidic conditions. Results： The chemical structure of these impurities were identified by LCMS， 1H NMR， 13C NMR. Conclusion： The synthesized impurities can be used as a reference material for the quality control of warfarin sodium and moreover， the starting materials used in this synthetic route are cheap and easy to obtain and it is expected to be used in industrial production.

KEY WORDS warfarin； warfarin sodium； impurities； synthesis

華法林鈉的化學(xué)名稱為3-（3-氧代-1-苯基丁基）-4-羥基-2H-1-苯并吡喃-2-酮鈉鹽，為雙香豆素的衍生物之一，于1954年6月被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，主要用于抑制血液中的血小板聚集，預(yù)防血栓栓塞性疾病，也可作為心肌梗死的輔助用藥，是目前應(yīng)用最廣泛的抗凝血藥。由于其結(jié)構(gòu)與維生素K相似，具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制維生素K的作用，抑制肝細(xì)胞中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的合成，從而起到抗凝血作用[1-2]。

作為抗凝血活性藥物成分的華法林鈉[3-6]，其化學(xué)合成方法受到廣泛的關(guān)注并被報(bào)道[7-10]。其主要合成途徑是利用中間體華法林與相應(yīng)的堿金屬或者堿性化合物成鹽，然后經(jīng)過(guò)脫色、噴霧干燥分離或不同的鹽冷凍干燥等方式制備華法林鈉。但是報(bào)道的合成路線中存在后處理操作繁雜、收率低、安全風(fēng)險(xiǎn)較高等問(wèn)題，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本工藝研究基于文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]的方法進(jìn)行改進(jìn)，利用2’-羥基苯乙酮（SM-1）和碳酸二甲酯（SM-2）為原料制備4-羥基-1-苯并吡喃-2-酮（WF-1），然后與4-苯基-3-丁烯-2-酮（SM-3）反應(yīng)制備3-（a-丙酮基芐基）-4-羥基香豆素（WF），再與堿性氫氧化物或者碳酸鹽反應(yīng)，最終制備得華法林鈉堿性鹽。但是在中間體WF制備的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生羥酮縮合雜質(zhì)，該類有機(jī)雜質(zhì)控制不當(dāng)則會(huì)隨后續(xù)反應(yīng)影響成品華法林鈉的質(zhì)量控制，故對(duì)華法林羥酮縮合雜質(zhì)的合成研究并且進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制具有重要的意義。同時(shí)本工藝研究對(duì)該類雜質(zhì)在工藝中可能產(chǎn)生的機(jī)理進(jìn)行了合理的推測(cè)解釋。

1 儀器與試劑

RV10加熱磁力攪拌器（德國(guó)IKA公司）；Bruker DMX 400 MHz 核磁共振儀、氘代氯仿（CDCl3）、氘代甲醇（MeOD）、四甲基硅烷（TMS）（瑞士Bruck BioSPin公司）；Agilent 5975C質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Waters 2695型高效液相色譜儀、沃特斯2489制備純化儀器（美國(guó)Waters公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）；PL2002分析天平（瑞士梅特勒公司）。

2’-羥基苯乙酮[密度為1.131～1.135 g/mL，氣相（GC）含量≥99.0%，濟(jì)南魯欣化工科技有限公司]；碳酸二甲酯（密度為0.973～0.977 g/mL，GC含量≥99.0%，東營(yíng)石大勝華新材料有限公司）；4-苯基-3-丁烯-2-酮（熔點(diǎn)為37.5～41.0 ℃，GC含量≥99.0%，武漢格羅麗材料有限公司）；二甲苯、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等常規(guī)溶劑均為市售分析純；濃鹽酸、氫氧化鈉、N，N-二異丙基乙胺等均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 合成方法

首先以SM-1為起始原料，與SM-2進(jìn)行縮合反應(yīng)生成WF-1，再與SM-3進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)得到WF，然后與甲醇，乙醇或異丙醇作為溶劑在酸性條件下進(jìn)行羥酮縮合反應(yīng)得到相應(yīng)的目標(biāo)化合物雜質(zhì)WF-Z1～WFZ6，具體路線如圖1所示。

2.1 化合物WF-1的合成

在反應(yīng)瓶中分別加入氫氧化鈉（58.4 g，1.46 mol）加入到無(wú)水乙醇（100 mL）和二甲苯（500 mL），氬氣保護(hù)下，開(kāi)啟攪拌，加熱至90 ℃，回流2 h，然后在快速攪拌下滴加SM-1（100.0 g，0.73 mol）和SM-2（193.0 g，1.63 mol）的混合溶液，加熱至溫度95 ℃，繼續(xù)保溫?cái)嚢璺磻?yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻，加去離子水，用濃鹽酸調(diào)pH，過(guò)濾，濾餅洗滌，于70 ℃真空干燥，得類白色固體WF-1 95.0 g，收率79.8%。

1H NMR（400 MHz，MeOD）：δ 7.91（dd，J=7.8，1.3 Hz，1H），7.70～7.59（m，1H），7.35（dd，J=11.7，5.2 Hz，2H），4.89（s，2H）。

13C NMR（100.6 MHz，MeOD）：δ 166.92，164.63，153.89，132.39 ，123.87，123.11，116.22，115.89，90.33。MS-ESI（m/z）：163.2[M+H]+。

2.2 化合物WF的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入WF-1（90.0 g，0.56 mol）、SM-3（98.4 g，0.672 mol）和水（800 mL），加入N，N-二異丙基乙胺（6.55 g），升溫至100 ℃攪拌反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，降溫，向體系中再加丙酮加熱溶解，冷卻結(jié)晶，過(guò)濾得固體，于50～60 ℃真空烘箱干燥，得白色固體WF 116.0 g，收率67.8%。

1H NMR（400 MHz，MeOD）：δ 7.95（td，J=7.8，1.4 Hz，1H），7.62（dd，J=17.1，8.5 Hz，1H），7.32（dtd，J= 19.5，12.5，4.0 Hz，6H），7.20～7.15（m，1H），4.17～4.05（m，1H），2.41（dt，J=13.0，6.5 Hz，1H），2.07～1.93（m，1H），1.73（s，3H）。

13C NMR（100.6 MHz，MeOD）：δ 162.24，159.89，152.77，143.81，131.78，131.51，128.26，127.70，127.09，126.84，125.81，123.82，122.60，115.92，103.69，99.53，42.75，35.55，26.39。MS-ESI（m/z）：309.3[M+H]+。

2.3 化合物WF-Z1和WF-Z2的合成

在反應(yīng)瓶中，加入WF（20 g，0.064 9 mol），甲醇（100 mL），濃鹽酸（20 mL），于60 ℃加熱并回流5 h，反應(yīng)完畢，減壓濃縮至干得混合物，制備純化，依據(jù)文獻(xiàn)[13]描述確認(rèn)構(gòu)型，分別得到對(duì)映異構(gòu)體 （2S，4S）-2-甲氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2R，4R）-2-甲氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z1）8 g，收率38.2%；對(duì)映異構(gòu)體 （2R，4S）-2-甲氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2S，4R）-2-甲氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z2）5 g，收率23.9%。

WF-Z1：1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.91（dd，J=7.9，1.3 Hz，1H），7.55（ddd，J=8.6，7.3，1.6 Hz，1H），7.36～7.27（m，4H），7.27～7.20（m，3H），4.16 （dd，J=11.7，7.0 Hz，1H），3.36 （s，3H），2.52（dd，J=14.0，7.0 Hz，1H），2.01（dd，J=14.4，11.4 Hz，1H），1.70（s，3H）。

13C NMR（100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.07，158.13，153.07，143.45，131.51，128.63，127.07，126.45，123.72，122.36，116.64，115.73，105.56，101.34，49.84，43.44，35.52，22.26。MS-ESI（m/z）：323.2[M+H]+。

WF-Z2： 1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.93（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），7.66～7.51（m，1H），7.42～7.25（m，4H），7.25～7.17（m，3H），4.17（dd，J=7.4，3.9 Hz，1H），3.26（s，3H），2.49（dd，J=14.1，3.9 Hz，1H），2.35（dd，J=14.1，7.4 Hz，1H），1.6（s，3H）。

13C NMR（100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.84，158.93，153.01，143.07，131.74，128.09，127.40，126.14，123.84，122.45，116.73，115.65，103.19，102.46，49.28，39.83，35.36，22.46。MS-ESI（m/z）：323.2[M+H]+。

2.4 化合物WF-Z3和WF-Z4的合成

在反應(yīng)瓶中，加入WF（20 g，0.064 9 mol），乙醇（100 mL），濃鹽酸（20 mL），于60 ℃加熱并回流5 h，反應(yīng)完畢，減壓濃縮至干得混合物，制備純化，依據(jù)文獻(xiàn)[13]描述確認(rèn)構(gòu)型，分別得到類白色固體對(duì)映異構(gòu)體 （2S，4S）-2-乙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2R，4R）-2-乙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z3） 7 g，收率32.1%；對(duì)映異構(gòu)體 （2R，4S）-2-乙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2S，4R）-2-乙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z4）5 g，收率22.9%。

WF-Z3：1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.90（dd，J=7.8，1.4 Hz，1H），7.55（ddd，J=8.6，7.3，1.6 Hz，1H），7.38～7.29（m，4H），7.29～7.20（m，3H），4.20（dt，J=14.8，7.4 Hz，1H），3.76（dq，J=9.1，7.0 Hz，1H），3.59（dq，J=9.1，7.1 Hz，1H），2.53（dd，J=14.0，6.9 Hz，1H），2.00（dd，J=14.0，11.8 Hz，1H），1.72（s，3H），1.13（t，J=7.1 Hz，3H）。

13C NMR （100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.96，159.08，153.01，142.98，131.68，127.96，127.58，126.04，123.80，122.59，116.72，115.73，102.96，102.31，57.87，40.08，35.19，23.06，15.03。MS-ESI（m/z）：337.2[M+H]+。

WF-Z4：1H NMR（400 MHz，CDCl3）：δ 7.91（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），7.58（ddd，J=8.6，7.4，1.6 Hz，1H），7.36（ddd，J=15.2，8.3，4.4 Hz，2H），7.30～7.14（m，5H），4.17（dd，J=7.4，3.7 Hz，1H），3.71～3.55（m，2H），2.51（dd，J=14.1，3.8 Hz，1H），2.33（dd，J=14.1，7.4 Hz，1H），1.67（s，3H），0.96（t，J=7.0Hz，3H）。

13C NMR （100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.96，159.08，153.01，142.98，131.68，127.96，127.58，126.04，123.80，122.59，116.72，115.73，102.96，102.31，57.87，40.08，35.19，23.06，15.03。MS-ESI（m/z）：337.2[M+H]+。

2.5 化合物WF-Z5和WF-Z6的合成

在反應(yīng)瓶中，加入WF（20 g，0.064 9 mol），異丙醇（100 mL），濃鹽酸（20 mL），60 ℃加熱，反應(yīng)5 h，反應(yīng)完畢，減壓濃縮至干得混合物，制備純化，依據(jù)文獻(xiàn)[13]描述確認(rèn)構(gòu)型，分別得到類白色固體對(duì)映異構(gòu)體（2S，4S）-2-異丙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2R，4R）-2-異丙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z5）7.2 g，收率31.7%；對(duì)映異構(gòu)體 （2R，4S）-2-異丙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮和（2S，4R）-2-異丙氧基-2-甲基-4-苯基-3，4-二氫-2H，5H-吡喃[3，2-c]色滿-5-酮（WF-Z6）5.5 g，收率24.2%。

WF-Z5：1H NMR （400 MHz，CDCl3）：δ 7.95～7.81（m，1H），7.62～7.45（m，1H），7.33（dd，J=11.5，3.8 Hz，4H），7.29～7.19（m，3H），4.35～4.25（m，1H），4.20（dd，J=11.8，6.8 Hz，1H），2.49（dt，J=10.5，5.2 Hz，1H），2.02～1.91（m，1H），1.73（s，3H），1.23（d，J=6.2 Hz，3H），0.91（d，J=6.1 Hz，3H）。

13C NMR （100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.21，158.54， 153.01，143.68，131.45，128.58，127.10，126.38，123.71，122.54，116.65，115.84，105.15，101.47，65.43，44.14，35.33，24.18，23.75，23.62。MS-ESI（m/z）：351.2[M+H]+。

WF-Z6：1H NMR （400 MHz，CDCl3）：δ 7.88（dd，J=7.9，1.5 Hz，1H），7.63～7.50 （m，1H），7.41～7.30（m，2H），7.30～7.15（m，5H），4.26（dt，J=12.3，6.2 Hz，1H），4.15（dd，J=7.3，4.7 Hz，1H），2.46（dd，J=14.0，4.7 Hz，1H），2.30（dd，J=14.0，7.4 Hz，1H），1.67（s，3H），1.05（d，J=6.1 Hz，3H），1.02（d，J=6.2 Hz，3H）。

13C NMR （100.6 MHz，CDCl3）：δ 161.95，159.40，153.01，143.03，131.64，127.93，127.57，125.97，123.73，122.68，116.66，115.84，102.92，101.47，65.97，40.94，35.52，24.09，24.03，23.45。MS-ESI（m/z）：351.2[M+H]+。

3 雜質(zhì)來(lái)源

本工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中涉及使用酸堿調(diào)節(jié)pH的操作工序，該類雜質(zhì)來(lái)源主要是由華法林在酸性條件下與醇類進(jìn)行的羥酮縮合反應(yīng)所產(chǎn)生，與文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]的合成該類雜質(zhì)的方法和路徑一致，因此推測(cè)其產(chǎn)生途徑如圖2所示，后期工藝開(kāi)發(fā)的過(guò)程中可以考慮避免使用醇類溶劑，或者開(kāi)發(fā)更合適的純化工藝，降低該類雜質(zhì)在中間體華法林的含量，確保有機(jī)雜質(zhì)在中間體制定的標(biāo)準(zhǔn)范圍以內(nèi)，進(jìn)而保證本工藝開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的華法林鈉符合質(zhì)量要求。

4 討論

本研究以SM-1為原料，通過(guò)縮合和邁克爾加成兩步反應(yīng)得到WF，然后以低級(jí)醇類作為溶劑在酸性條件下進(jìn)行羥酮縮合反應(yīng)得到相應(yīng)的目標(biāo)雜質(zhì)WF-Z1～WF- Z6。由于其原料廉價(jià)易得，可以克級(jí)量制備相應(yīng)的縮合雜質(zhì)，避免工藝開(kāi)發(fā)中雜質(zhì)經(jīng)過(guò)富集、純化、再純化等繁瑣途徑，從而為原料藥的質(zhì)量研究提供保障。另外，該雜質(zhì)來(lái)源主要是由于華法林制備過(guò)程中在酸性條件下與醇類進(jìn)行的羥酮縮合反應(yīng)所導(dǎo)致，后期工藝開(kāi)發(fā)的過(guò)程中可以考慮避免使用醇類溶劑，或者開(kāi)發(fā)更合適的純化工藝制備得到高質(zhì)量華法林，進(jìn)而避免該類雜質(zhì)或者將其在華法林中的含量降低到工藝開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)以下，最終可安全可靠地工業(yè)化生產(chǎn)出符合藥典要求的華法林鈉原料藥。

參考文獻(xiàn)

[1] Majerus PW， Broze GJ， Miletich， JP， et al. Goodman and Gilman’s the pharmacological basis of therapeutics， 9th edition[M]. New York： McGraw-Hill Education， 1996： 1346-1350.

[2] 李夢(mèng)瑤， 蔡志強(qiáng)， 侯玲， 等. 新型小分子抗凝血藥物的合成、作用機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 合成化學(xué)， 2020， 28（4）： 346-359.

[3] 劉小冬， 孔毅. 抗凝血藥物研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥衛(wèi)生， 2017， 3（5）： 287-289.

[4] 胡章海. 抗血栓藥物的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 安徽醫(yī)藥， 2017， 21（5）： 785-788.

[5] 王秀， 夏泉. 抗凝血藥物臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀及研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥， 2011， 15（10）： 1189-1192.

[6] 陳新謙， 金有豫， 湯光. 新編藥物學(xué)（第15版）[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 2003， 527-528.

[7] Schroader CH， Madison， Link KP， et al. Process of making crystalline warfarin sodium： US2765321[P]. 1956-10-02.

[8] Schroader CH， Link KP， Madison W， et al. Warfarin sodium： US3077481[P]. 1963-02-12.

[9] Paul LK， Schroeder CH， Link KP， et al. Warfarin alkali metal derivative process： US3192232[P]. 1965-06-29.

[10] Ohnishi M， Sugawara R， Kusano T， et al. Structure-activity relationship between the hydro-phobicity of alkali metal salts of warfarin [3-（a-acetonyl-benzyl） -4-hydroxycoumarin] and the effectiveness of the taste response to these salts in mice[J]. Biosci Bintech Biochem， 1995， 59（6）： 995-1006.

[11] Uwaydah IM， Mohammad A， Brown CH， et al. Syntheses based on 2-hydroxy acetophenone： WO9724347[P]. 1997-07-10.

[12] Bercovici S， Evron Y， Fuxman O， et al. Process for synthesis of pure warfarin acid， warfarin alkali metal salts and corresponding clathrates： US20020120155[P]. 2002-08-29.

[13] Rayar AM， Lagarde N， Martin F， et al. New selective cyclooxygenase-2 inhibitors from cyclocoumarol： synthesis， characterization， biological evaluation and molecular modeling[J]. Eur J Med Chem， 2018， 146（1）： 577-587.

[14] Krstic LJ， Sukdolak S， Solujic S， et al. An efficient synthesis of warfarin acetals on montmorillonite clay k-10 with microwaves[J]. J Serb Chem Soc， 2002， 67（5）： 325-329.

[15] Shahzadi S， Ali S， Asif I， et al. The mechanism and crystal structure of 2-methoxy-2-methyl-4-phenyl-3，4，4a，10btetrahydro-2H，H-pyrano[3，2-c]chromen-5-one. Acetal of warfarin acid[J]. Turk J Chem， 2006， 30（6）： 703-709.