天香丹通過(guò)GRP78/NLRP3信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制研究

張夏夏 白銀雪 吳丹丹 孫龍飛 任珊 安冬青

摘要? 目的：基于葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）/NOD樣受體蛋白3（NLRP3）信號(hào)通路探討天香丹通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。方法：將雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠隨機(jī)分為模型組、阿托伐他汀組、天香丹組，每組11只，給予高脂飼料誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型；另取10只雄性C57BL/6J小鼠作為正常組。于造模10周后給予相應(yīng)藥物治療，連續(xù)干預(yù)12周。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀法察胸主動(dòng)脈病理特點(diǎn)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素18（IL-18）、活性氧（ROS）含量；免疫組織化學(xué)法（IHC-P）檢測(cè)胸主動(dòng)脈中GRP78和NLRP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平。結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組存活6只。與模型組比較，阿托伐他汀組和天香丹組IL-1β、IL-18、ROS表達(dá)含量均降低（P＜0.05或P＜0.01）；GRP78、NLRP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)均明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：天香丹能有效改善動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病小鼠炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/NLRP3信號(hào)通路抑制炎癥小體活化、減輕動(dòng)脈粥樣硬化炎癥損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞? 動(dòng)脈粥樣硬化；天香丹；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；NOD樣受體蛋白3；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.11.006

The Anti-atherosclerosis Mechanism of Tianxiangdan by Regulating Endoplasmic Reticulum Stress Through GRP78/NLRP3 Signaling Pathway

ZHANG Xiaxia， BAI Yinxue， WU Dandan， SUN Longfei， REN Shan， AN Dongqing

Xinjiang Medical University Institute of TCM， Urumqi 830011， Xinjiang， China

Corresponding Author? AN Dongqing， E-mail： 995079431@qq.com

Abstract? Objective：Based on the glucose-regulatory protein 78（GRP78）/NOD-like receptor protein 3（NLRP3） signaling pathway to explore the anti-atherosclerosis mechanism of Tianxiangdan through regulation of endoplasmic reticulum stress.Methods：A total of 35 male apolipoprotein E gene knockout（ApoE-/-） mice were randomly divided into model group，atorvastatin group and Tianxiangdan group，with 6 mice in each group.Atherosclerosis model was induced by high fat diet.Another 10 male C57BL/6J mice were selected as the normal group.After 10 weeks of modeling，the corresponding drug treatment was given.The intervention lasted for 12 weeks.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological features of thoracic aorta.Serum interleukin-1β（IL-1β），interleukin-18（IL-18） and reactive oxygen species（ROS） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The positive expression levels of GRP78 and NLRP3 proteins in thoracic aorta were detected by immunohistochemistry（IHC-P）.Results：Compared with model group，the expression levels of IL-1β，IL-18 and ROS in atorvastatin group and Tianxiangdan group decreased（P＜0.05 or P＜0.01），the positive expressions of GRP78 and NLRP3 decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Tiangdan can effectively improve the inflammatory response of mice with atherosclerotic cardiovascular disease，and its mechanism may be related to the regulation of endoplasmic reticulum stress GRP78/NLRP3 signaling pathway to inhibit the activation of inflammasome and reduce the inflammatory damage of arteriosclerotic disease.

Keywords? arteriosclerotic cardiovascular disease; Tianxiangdan; endoplasmic reticulum stress; glucose-regulatory protein 78; NOD-like receptor protein 3; experimental study

基金項(xiàng)目? 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.8206150791）；新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（No.2023D04052）；新疆維吾爾自治區(qū)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（No.XJ2023G198）；新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（No.2020D04006）；新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)（No.2022A03019）

通訊作者? 安冬青，E-mail：995079431@qq.com

引用信息? 張夏夏，白銀雪，吳丹丹，等.天香丹通過(guò)GRP78/NLRP3信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（11）：1955-1960.

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病（arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）是全球死亡的主要原因之一［1］，其中血脂異常是關(guān)鍵的致病因素。據(jù)《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2022概要》［2］報(bào)道，在我國(guó)因ASCVD導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)1 139萬(wàn)例，其不適癥狀的延綿性、長(zhǎng)期性和醫(yī)療昂貴等方面，已成為全球亟待解決的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題。

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制已被廣泛研究，其中炎癥反應(yīng)被認(rèn)為貫穿于其整個(gè)發(fā)病過(guò)程，由此，抑制炎癥反應(yīng)也被稱為“曙光初現(xiàn)”［3］。目前，常規(guī)治療動(dòng)脈粥樣硬化的方法包括調(diào)節(jié)血脂、抗炎、擴(kuò)血管、抗凝等藥物，病變管腔發(fā)生明顯狹窄或堵塞時(shí)，以介入或手術(shù)治療為主。然而長(zhǎng)期聯(lián)合服用以上藥物多伴有肌溶解和肝損傷等副作，目前醫(yī)學(xué)影像技術(shù)也具有一定局限性，并且介入手術(shù)易影響血管阻力指數(shù)導(dǎo)致肌細(xì)胞死亡［4-6］。然而，在我國(guó)，中醫(yī)藥治療動(dòng)脈粥樣硬化療效顯著且副作用較?。?-14］。復(fù)方天香丹已取得臨床成果轉(zhuǎn)化與專利申請(qǐng)，本方由紅景天、丹參、新塔花、降香組成，全方共奏行氣活血、化瘀止痛之功，經(jīng)長(zhǎng)期臨床研究發(fā)現(xiàn)，天香丹具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的療效［15］。

研究者發(fā)現(xiàn)，隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的深入研究，炎癥反應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）之間的串?dāng)_機(jī)制可能是揭示動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的新途徑。ERS標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）已在多種心血管疾病中表達(dá)，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡與動(dòng)脈粥樣硬化的形成和斑塊的脫落密切相關(guān)［16-21］。ERS發(fā)生時(shí)，解離后的GRP78能夠介導(dǎo)多種下游信號(hào)通路激活炎癥小體（nod-likereceptorprotein 3，NLRP3）加重動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展［22-23］。前期研究中發(fā)現(xiàn)，NLRP3可能是天香丹治療動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶標(biāo)［24-25］。但ERS是如何通過(guò)調(diào)控激活NLRP3介導(dǎo)天香丹發(fā)揮其心肌保護(hù)作用的機(jī)制未明確。由此，本研究擬在成功干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，探討天香丹通過(guò)GRP78/NLRP3信號(hào)通路調(diào)控ERS抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，為天香丹防治動(dòng)脈粥樣硬化提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 藥物與試劑

天香丹顆粒購(gòu)自新奇康藥業(yè)股份有限公司（規(guī)格：每包9 g，批號(hào)：210540，藥物專利號(hào)：200910210063.9）；阿托伐他汀鈣片購(gòu)自輝瑞制藥有限公司（批號(hào)：EE0898）。白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素18（IL-18）、活性氧（ROS）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司（批號(hào)：YX-E28912、YX-E21218、YX-E28857）；蘇木精-伊紅（HE）染色液購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司（批號(hào)：BL700B）；兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑、封閉用羊血清購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：PV-6001、ZLI-9022）；3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、抗體GRP78、NLRP3購(gòu)自艾博抗貿(mào)易有限公司（批號(hào)：ab64238、ab21685、ab214185）；通用型抗體稀釋液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)：A1800）。

1.2? 儀器

低溫高速離心機(jī)、全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1150型包埋機(jī)、RM2235型切片機(jī)、恒溫水浴鍋均購(gòu)自德國(guó)Leica；自動(dòng)恒溫烤片儀（湖北泰雅醫(yī)療科技），恒溫干燥箱（上海博訊），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher），正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon）。

1.3? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

43只無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性8周齡小鼠，其中載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠33只，C57BL/6J小鼠10只，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司和新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006。飼養(yǎng)環(huán)境于人工晝夜循環(huán)空氣清潔房?jī)?nèi)，溫度為22～28 ℃，明暗時(shí)間為12 h/12 h，自由飲水、進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（批號(hào)：IACUC-20200331-47）。

1.4? 造模、分組及給藥方法

檢疫適應(yīng)1周后，將33只8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組（高脂飼料＋純化水）、阿托伐他汀組（高脂飼料＋阿托伐他汀鈣片沖泡液）、天香丹組（高脂飼料＋天香丹顆粒沖泡液），每組11只，予高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養(yǎng)；10只C57BL/6J小鼠作為正常組，予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)（基礎(chǔ)飼料＋蒸餾水）。飼養(yǎng)第11周，隨機(jī)處理3只ApoE-/-小鼠檢驗(yàn)斑塊形成后，給予藥物灌胃干預(yù)。藥物以成人臨床用藥劑量同效換算小鼠實(shí)驗(yàn)用藥量灌胃，將干預(yù)藥品溶于500 μL純化水中，阿托伐他汀組與天香丹組分別按照3.0 mg/（kg·d）、2.7 g/（kg·d）的劑量進(jìn)行治療，模型組和正常組以同比例體積的純化水進(jìn)行灌胃，每日1次，每周根據(jù)小鼠體重變化調(diào)整藥物灌胃量，繼續(xù)喂養(yǎng)12周。造模及給藥期間各組均有死亡，最終統(tǒng)計(jì)樣本量各為6只。

1.5? 標(biāo)本留取

末次灌胃后，術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，觸及心尖搏動(dòng)最強(qiáng)處后進(jìn)行胸腹部區(qū)域消毒，沿膈肌下緣剖開(kāi)腹腔，取1 mL注射器與心尖搏動(dòng)處呈30°角刺入5～10 mm處采集血液后取上清，置于－80 ℃低溫保存用于檢測(cè)血清指標(biāo)。后剝離頸、胸、腹主動(dòng)脈組織分裝于4%多聚甲醛固定液中，用于HE、免疫組織化學(xué)法（IHC-P）病理觀察。

1.6? IL-18、IL-1β、ROS水平檢測(cè)

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書，采用雙抗夾心法檢測(cè)各組血清IL-18、IL-1β、ROS水平。

1.7? IHC-P法檢測(cè)胸主動(dòng)脈組織中GRP78、NLRP3蛋白表達(dá)量

切片放入60 ℃烘箱中1 h后置于室溫10 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中浸泡20 min，各梯度乙醇中浸泡5 min，高溫抗原修復(fù)20 min，放置室溫1 h，滴加H2O2酶遮光放置15 min，滴加山羊血清并放入37 ℃烘箱孵育30 min，滴加一抗于4 ℃冰箱過(guò)夜，復(fù)溫30 min，滴加二抗并放入37 ℃烘箱孵育30 min，DAB、蘇木精染液染色后進(jìn)行分化與脫水處理，二甲苯溶液透明并封片，鏡下采集圖像并分析蛋白表達(dá)量。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。定量資料滿足正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? 各組小鼠胸主動(dòng)脈組織HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，模型組可見(jiàn)明顯斑塊，阿托伐他汀組與天香丹組斑塊較模型組減小，正常組無(wú)斑塊出現(xiàn)。詳見(jiàn)圖1。

2.2? 各組血清IL-1β、IL-18、ROS水平比較

與正常組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-18、ROS水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組與天香丹組血清IL-1β、IL-18、ROS水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。詳見(jiàn)圖2。

（A為各組IL-1β水平比較；B為各組IL-18水平比較；C為各組ROS表達(dá)比較）

2.3? 各組胸主動(dòng)脈中GRP78、NLRP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較

與正常組比較，模型組GRP78、NLRP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組與天香丹組GRP78、NLRP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。詳見(jiàn)圖3、圖4、表1。

3? 討? 論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展可引起心肌梗死、心肌纖維化等急性臨床事件［26］，是導(dǎo)致病人死亡的重要危險(xiǎn)因素。動(dòng)脈粥樣硬化本質(zhì)是一類慢性炎癥性疾病，血管內(nèi)膜中沉積的不溶性膽固醇晶體常積累在溶酶體中并破壞其膜結(jié)構(gòu)，溶酶體裂解后釋放的組織蛋白酶可促進(jìn)NLRP3炎癥小體活化、激活NLRP3蛋白，啟動(dòng)下游炎性因子IL-1β、IL-18持續(xù)加重炎癥反應(yīng)，促使壞死核心形成和纖維帽變薄，最終導(dǎo)致斑塊破裂和血栓形成，引起急性血管性病變［27］。因此，靶向抑制NLRP3炎癥小體是治療動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵一環(huán)。

自炎癥小體首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，有關(guān)NLRP3炎癥小體參與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的研究較多，目前動(dòng)脈粥樣硬化中NLRP3炎癥小體活化的學(xué)說(shuō)包含氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、ERS、溶酶體破裂等，其中包含多類別、多形式的分子信號(hào)傳遞，如K＋、Ca2＋的流離，三磷酸腺苷（ATP）、ROS及蛋白分子的釋放［28-30］。ERS介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的多種病理過(guò)程中涉及多條信號(hào)通路，ERS水平持續(xù)升高會(huì)激活NLRP3炎癥小體，本研究在上述作用機(jī)制的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索ERS與NLRP3炎癥小體及信號(hào)蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化中的交互作用。ERS是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在受刺激后引起自身對(duì)蛋白產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白積累的一種反應(yīng)［31］，在不同物種的動(dòng)脈粥樣硬化病變處已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ERS標(biāo)志物［32］。相關(guān)研究證實(shí)除ERS抑制劑外，相關(guān)拮抗藥物也能在動(dòng)脈粥樣硬化模型或環(huán)境下下調(diào)GRP78、NLRP3、IL-18、IL-1β、ROS的表達(dá)，其中中藥丹參提取物丹參酸B在GRP78-NLRP3信號(hào)傳遞過(guò)程中體現(xiàn)出良好的調(diào)控效果［33-37］，以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)ERS參與動(dòng)脈粥樣硬化的查究進(jìn)展持續(xù)加快，但少有研究探索動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中ERS與NLRP3的交互影響及作用。中醫(yī)藥對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治頗有研究且安全效優(yōu)，本研究為中醫(yī)藥調(diào)節(jié)ERS抑制NLRP3炎癥小體活化治療動(dòng)脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。

中醫(yī)治療動(dòng)脈粥樣硬化主要采用化痰、祛瘀、活血、行氣等，并將動(dòng)脈粥樣硬化歸屬于“真心痛”“胸痹”等范疇。痰涎本由氣血化生，虛留于脈且久息成積則會(huì)導(dǎo)致氣虛不推血運(yùn)形成瘀血，血虛不流則脈道不通，痰飲久而不去則血易成濁，壅于血府，血瘀自成。本虛是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的前提，脈中無(wú)氣、血府積濁導(dǎo)致的“痰瘀”阻塞是脈痹發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵，痰瘀互結(jié)、損傷脈道是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的病機(jī)［38］，其中不通則痛的表現(xiàn)最為常見(jiàn)，痰瘀同治與補(bǔ)益并施是動(dòng)脈粥樣硬化的治療原則。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)于穩(wěn)態(tài)下的作用與氣血的功能極其相似，氣血功能的失調(diào)與ERS相關(guān)，部分學(xué)者認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能結(jié)構(gòu)與三焦也有相似之處，氣血的疏通和氣機(jī)的調(diào)暢也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有一定聯(lián)系［39-41］。研究發(fā)現(xiàn)，中藥單體、中藥提取物、中成藥、中藥復(fù)方能在動(dòng)脈粥樣硬化中對(duì)ERS起到調(diào)控作用［42］。復(fù)方天香丹以紅景天為君，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、活血化瘀止血之功；丹參為臣，具有益氣養(yǎng)血、活血通絡(luò)、祛瘀止痛之功效；新塔花與降香俱為辛香走竄之品，有通陽(yáng)宣痹作用，全方遵循“本虛標(biāo)實(shí)”的病機(jī)，以通而不忘其正虛、補(bǔ)而不忘其邪實(shí)的療法達(dá)到治療目的。前期臨床及基礎(chǔ)研究證實(shí)，天香丹能夠通過(guò)降低血清中炎性因子及血脂水平、穩(wěn)定斑塊、改善血管內(nèi)皮功能等方面達(dá)到治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其中涉及血流動(dòng)力學(xué)、核因子-κB信號(hào)通路、基因組學(xué)、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝等研究，然而對(duì)ERS學(xué)說(shuō)的探索較少［43-49］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，天香丹能夠通過(guò)減輕ERS，在動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠胸主動(dòng)脈和血清中下調(diào)ERS起始蛋白GRP78及炎癥蛋白NLRP3、IL-18、IL-1β和促炎物質(zhì)ROS的表達(dá)量。

綜上所述，復(fù)方天香丹可能通過(guò)調(diào)控GRP78/NLRP3信號(hào)通路降低GRP78、NLRP3蛋白和ROS的表達(dá)，減少下游炎性因子IL-18、IL-1β的釋放，緩解ERS并抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)程，達(dá)到減緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。中醫(yī)藥調(diào)控ERS抑制NLRP3炎癥小體在動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，不僅能夠加深對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起病機(jī)制的理解，也可為動(dòng)脈粥樣硬化的診斷提供新方向。

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（收稿日期：2024-01-21）

（本文編輯郭懷?。?/p>