擬無(wú)枝酸菌糖肽類(lèi)和聚酮類(lèi)抗生素的遺傳信息及生物合成途徑的研究進(jìn)展

收稿日期：2023-10-11

作者簡(jiǎn)介：牛莎莎，助理工程師，主要從事微生物菌種選育工作。

*通信作者：牛春，助理工程師，主要從事微生物菌種選育工作。

摘要：擬無(wú)枝菌屬（Amycolatopsis）是萬(wàn)古霉素和利福霉素等次生代謝產(chǎn)物的菌株，該菌屬天然抗生素的分子遺傳學(xué)已經(jīng)有了廣泛研究。由于抗生素耐藥率的上升，尋找新的藥物來(lái)對(duì)抗感染治療已成為當(dāng)務(wù)之急。了解代謝產(chǎn)物遺傳信息的新進(jìn)展有助于合理地操縱生物合成途徑，以便于研發(fā)新型抗生素。本文綜述了近年來(lái)通過(guò)Amycolatopsis基因組序列發(fā)現(xiàn)的糖肽類(lèi)和聚酮類(lèi)抗生素及其生物合成途徑方面的成果。

關(guān)鍵詞：擬無(wú)枝酸菌；糖肽類(lèi)抗生素；聚酮類(lèi)抗生素；萬(wàn)古霉素；利福霉素；生物合成途徑

中圖分類(lèi)號(hào)：R978.1" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " "文章編號(hào)：1001-8751（2024）02-0074-10

Progress on Genetic Information and Biosynthetic Pathways of Glycopeptide and Polyketide Antibiotics of Amycolatopsis

Niu Sha-sha，" "Zhang Ping，" "Niu Chun

（Ningxia Tairui Phamaceutical Co.， LTD.， Yinchuan 750100）

Abstract： The genus Amycolatopsis produces secondary metabolites like rifamycin and vancomycin， which are widely used in agriculture and medicine. This genus's natural antibiotics' molecular genetics have been thoroughly researched. Due to the rise in antibiotic resistance， finding new drugs to fight infections has become a priority. New advances in understanding the genetic information of metabolites can help rationally manipulate biosynthetic pathways for the development of new natural antibiotics." In this review， we review the recent achievements of glycopeptide and polyketide antibiotics discovered by the Amycolatopis genome sequence and their biosynthetic pathways.

Key words： Amycolatopsis;" "glycopeptide antibiotics;" "polyketide antibiotics;" vancomycin;" "rifamycin; biosynthetic pathways

1 介紹

微生物來(lái)源的抗生素對(duì)人類(lèi)健康做出了重大貢獻(xiàn)。其中，放線菌是藥物先導(dǎo)化合物的最重要來(lái)源。然而，隨著多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)以及耐藥細(xì)菌感染病例數(shù)量不斷增加，迫切需要研發(fā)新型抗生素。近年來(lái)，隨著微生物天然產(chǎn)物生物合成的分子遺傳學(xué)和合成生物學(xué)的不斷發(fā)展，通過(guò)操縱酶、調(diào)控基因和生物合成途徑等方法，對(duì)現(xiàn)有抗生素結(jié)構(gòu)的靶向修飾，有望產(chǎn)生具有新穎結(jié)構(gòu)或優(yōu)越性能的天然產(chǎn)物類(lèi)似物從而獲得新型抗生素[1]。

放線菌目包含大量的屬，鏈霉菌屬是70%～80%次級(jí)代謝產(chǎn)物的來(lái)源，其代謝產(chǎn)物能夠合成多種天然生物活性產(chǎn)物。此外，抗生素的重要產(chǎn)生菌還有擬無(wú)枝酸菌屬（Amycolatopsis）、游動(dòng)放線菌屬、小單孢菌屬和糖多孢菌屬[2]。其中擬無(wú)枝酸菌屬被認(rèn)為是涵蓋多種有價(jià)值的生物活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源，包括利福霉素和萬(wàn)古霉素[3]。擬無(wú)枝酸菌屬是具有IV型細(xì)胞壁且缺乏分枝菌酸的放線菌，該屬涵蓋94個(gè)已驗(yàn)證種和4個(gè)亞種，在假諾卡氏菌科（Pseudonocardiaceae）進(jìn)化樹(shù)中形成了一個(gè)獨(dú)特的分支。他們中的大多數(shù)在各種土壤中定植，少數(shù)在陸地（昆蟲(chóng)、地衣、島嶼和植物）和海洋（海綿和沉積物）環(huán)境中生存。擬無(wú)枝酸菌屬物種具有生物降解、生物轉(zhuǎn)化和生物吸附的潛力，這可能解決未來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題[4]。來(lái)自擬無(wú)枝酸菌屬菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物有多酚類(lèi)、線性聚酮化合物、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酰胺類(lèi)、噻唑基肽類(lèi)、環(huán)肽類(lèi)、糖肽類(lèi)、酰胺和氨基衍生物、糖苷衍生物、烯二炔衍生物和倍半萜類(lèi)等，其生物活性包括抗微生物、細(xì)胞毒性、抗氧化劑、topoIIα抑制、抗高血糖、酶抑制和DNA損傷[5]。

擬無(wú)枝酸菌產(chǎn)生兩種主要類(lèi)型的抗生素：糖肽類(lèi)和聚酮類(lèi)。糖肽類(lèi)抗生素用于治療嚴(yán)重的革蘭陽(yáng)性菌感染，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）[6]。糖肽類(lèi)的抗微生物活性基于與細(xì)菌細(xì)胞胞膜的結(jié)合，而不是與靶蛋白的結(jié)合。糖肽與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜外表面上的肽聚糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸（D-Ala-D-Ala）二肽末端結(jié)合[7]，進(jìn)而干擾肽聚糖層的成熟，由于不完整和受損的細(xì)胞壁容易受到滲透壓的影響，復(fù)制細(xì)菌無(wú)法存活。但是，糖肽類(lèi)抗性生物體用D-丙氨酰-D-乳酸鹽（D-Ala-D-Lac）或D-丙氨酰-D-絲氨酸（D-Ala-D-Ser）替換D-Ala-D-Ala末端，從而顯著降低抗生素對(duì)細(xì)胞靶標(biāo)的親和力[8]。所有糖肽類(lèi)抗生素都有一個(gè)基于七肽骨架的共同結(jié)構(gòu)，肽側(cè)鏈氧化交聯(lián)形成大環(huán)，并在不同位置攜帶糖取代基[9]。聚酮類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)變化很大，包括環(huán)狀、非環(huán)狀、小、大、簡(jiǎn)單和復(fù)雜分子，可以分為亞群：脂肪酸，聚丙酸酯和芳香族聚酮。由擬無(wú)枝酸菌屬產(chǎn)生的利福霉素等都是通過(guò)聚酮化合物前體獲得的。聚酮類(lèi)抗生素的抗菌作用各不相同：螯霉素通過(guò)抑制RNA翻譯來(lái)阻止細(xì)菌生長(zhǎng)，而利福霉素則抑制DNA依賴(lài)性RNA合成[10]。從擬無(wú)枝酸菌屬已公布基因組序列中，已經(jīng)檢測(cè)到許多與次生代謝物相關(guān)的生物合成基因簇。例如，除東方擬無(wú)枝酸菌中的萬(wàn)古霉素生物合成基因外，已鑒定出26個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇[11]。目前，對(duì)擬無(wú)枝酸菌屬其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成研究較少[12]，有必要對(duì)擬無(wú)枝酸菌屬中具有生物活性的化合物在作用機(jī)制、生物合成和調(diào)控基因等方面進(jìn)行深入研究。本文以擬無(wú)枝酸菌中分離的抗生素為例，討論了遺傳信息和生物合成途徑的研究進(jìn)展，分析這些生物活性產(chǎn)物的生物合成基因簇和生物合成途徑，為合成抗耐藥病原微生物的新藥奠定基礎(chǔ)。

2 糖肽類(lèi)抗生素在擬無(wú)枝酸菌屬中的生物合成

2.1 萬(wàn)古霉素及其類(lèi)似物

萬(wàn)古霉素（Vancomycin）是1956年從Amycolatopsis orientalis（原Streptomyces orientalis）中分離得到的一類(lèi)糖肽類(lèi)抗生素，臨床應(yīng)用已有60年，檢測(cè)萬(wàn)古霉素有關(guān)物質(zhì)，推廣使用歐洲藥典（EP）10.0中的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法[13]。萬(wàn)古霉素是一種七肽鏈形成的三環(huán)結(jié)構(gòu)糖肽，它的兩個(gè)重要類(lèi)似物是氯東方菌素A（Chloroeremomycin）和巴爾赫霉素（Balhimycin）。與萬(wàn)古霉素的L-vancosamine-1，2-葡萄糖不同，氯東方菌素A的雙糖是L-4-epi-vancosamine-1，2-葡萄糖[9]；而巴爾赫霉素在糖基化模式上與萬(wàn)古霉素有所不同（圖1）。另外，糖肽類(lèi)抗生素的七肽骨架富含源自莽草酸途徑的芳香族殘基，巴爾赫霉素的產(chǎn)生菌Amycolatopsis balhimycina含有莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，即脫氧-d-阿拉伯-庚酮酸-7-磷酸合酶（Dahp）和苯丙酸脫氫酶（Pdh），是糖肽類(lèi)抗生素的關(guān)鍵前體酪氨酸，也是預(yù)苯酸脫水酶（Pdt）的激活劑，Pdt在Amycolatopsis balhimycina中的過(guò)表達(dá)可促使菌株中抗生素產(chǎn)量增加[14]。此外，Oritavancin作為新一代半合成脂糖肽抗生素，其直接前體糖肽A82846B與萬(wàn)古霉素在結(jié)構(gòu)上具有相似性，而上述結(jié)論源于研究人員利用CRISPR-Cas12a系統(tǒng)，將萬(wàn)古霉素基因簇中的糖基轉(zhuǎn)移酶模塊（gtfDE）和糖基合成模塊（vcaAEBD）分別替換為A82846B基因簇中相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶模塊（gtfABC）和糖基合成模塊（evaAEBD），即通過(guò)人工構(gòu)建的合成途徑成功制備了A82846B[15]。

根據(jù)相應(yīng)基因簇編碼的蛋白序列推斷，巴爾赫霉素、氯東方菌素A和萬(wàn)古霉素的生物合成途徑是相似的[16]。萬(wàn)古霉素生物合成涉及三個(gè)步驟。首先，合成7個(gè)氨基酸前體，其中3個(gè)非蛋白氨基酸生物合成酶的編碼基因，分別為AORI_1491-1497和AORI_1502-1505。接下來(lái)，七個(gè)前體通過(guò)非核糖體肽合成酶（NRPSs）VcmA、VcmB和VcmC組裝形成七肽骨架。最后完成七肽主鏈的組裝后修飾，包括環(huán)化、鹵化、甲基化和糖基化。七肽骨架的環(huán)化涉及三個(gè)P450基因（oxyA，oxyB，oxyC），而糖基化涉及兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（gtfD，gtfE） [11]（圖2）。

有關(guān)P450基因，研究顯示參與七肽骨架環(huán)化的P450基因是從萬(wàn)古霉素的產(chǎn)生菌Amycolatopsis" orientalis[17]，氯東方菌素A的產(chǎn)生菌Amycolatopsis" orientalis A82846[18]和巴爾赫霉素的產(chǎn)生菌Amycolatopsis balhimychina[19]中克隆出來(lái)的。具有Amycolatopsis orientalis相應(yīng)加氧酶基因的Amycolatopsis balhimychina突變株通過(guò)異源互補(bǔ)可恢復(fù)巴爾赫霉素的生產(chǎn)，證明巴爾赫霉素和萬(wàn)古霉素產(chǎn)生菌的加氧酶功能等效[20]。另外通過(guò)Amycolatopsis" balhimycina基因敲除實(shí)驗(yàn)，可確定OxyA-C參與三種苯酚偶聯(lián)反應(yīng)。第一次偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生在殘基4和殘基6之間，由OxyB催化；第二次反應(yīng)發(fā)生在殘基2和4之間（OxyA），最后在殘基5和7之間（OxyC）。上述前兩個(gè)反應(yīng)是C-O耦合，而最后一個(gè)反應(yīng)是C-C耦合[21]。同時(shí)在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，一個(gè)保守的X-結(jié)構(gòu)在所有糖肽類(lèi)抗生素的非核糖體肽合成酶（NRPS）復(fù)合物中，當(dāng)招募必需的Oxy酶（OxyA-C）時(shí)，對(duì)糖肽類(lèi)生物合成中Oxy催化的交聯(lián)結(jié)合起重要作用[22]。

1989年，研究推測(cè)在Amycolatopsis orientalis中首次鑒定到糖基轉(zhuǎn)移酶（Gtf）與肽核中添加的糖基有關(guān)。也從萬(wàn)古霉素產(chǎn)生菌Amycolatopsis orientalis C329.4中擴(kuò)增出兩個(gè)Gtf基因（gtfD，gtfE）。GtfD和GtfE經(jīng)異種表達(dá)和純化后，活性得到了表征。GtfE參與萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)修飾，將葡萄糖轉(zhuǎn)移到萬(wàn)古霉素的糖苷配基（UDP-葡聚糖作為糖基供體） 形成萬(wàn)古霉素假苷元；而GtfD能夠利用非天然受體和非天然核苷酸糖供體UDP-4-epi-Vancosamine合成一種新型混合替考拉寧/萬(wàn)古霉素的糖肽類(lèi)抗生素。同時(shí)從氯東方菌素A的產(chǎn)生菌Amycolatopsis orientalis A82846中擴(kuò)增出三個(gè)Gtf基因（gtfA、gtfB、gtfC）[23]。推測(cè)GtfA催化4-epi-vancosaminyl轉(zhuǎn)移6β-OH-tyr殘基的β-羥基；GtfB的糖基化活性與GtfE相似，但效率較低。GtfC的活性與GtfD相似[24]。此外，發(fā)現(xiàn)Gtf能夠產(chǎn)生新的糖基化模式，從而產(chǎn)生雜化糖肽類(lèi)抗生素。1997年首次報(bào)道了用gtfs產(chǎn)生的雜交糖肽類(lèi)抗生素，將gtf基因?qū)胴S加鏈霉菌（Streptomyces toyocaensis）中，產(chǎn)生了一種替考拉寧的七肽類(lèi)抗生素A47934 （無(wú)糖殘基）。

替考拉寧也是一種糖肽類(lèi)抗生素，它與萬(wàn)古霉素的區(qū)別在于肽骨架上多了脂肪酸側(cè)鏈，提高了親脂性，更易于滲入組織和細(xì)胞，以及芳香氨基酸1和3之間有額外的環(huán)閉合[25-26]。Losey等[24]使用GtfE將大量NDP-葡萄糖類(lèi)似物轉(zhuǎn)移到萬(wàn)古霉素和替考拉寧的七肽骨架上，然后用GtfD與4-epi-vancosamine對(duì)糖基肽修飾，得到萬(wàn)古霉素和替考拉寧衍生物。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，GtfE通過(guò)替考拉寧苷元和UDP-葡萄糖生成替考拉寧糖基化衍生物。使用GtfD將非天然核苷酸糖（udp-4-epi-Vancosamine）轉(zhuǎn)移到該非天然受體上，可合成一種新的替考拉寧/萬(wàn)古霉素的雜合糖肽類(lèi)抗生素，其對(duì)敏感菌株的活性明顯高于兩種親本糖肽類(lèi)抗生素[27]。Truman等[28]報(bào)道通過(guò)混合和匹配糖肽糖基轉(zhuǎn)移酶的N端和C端結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生功能性嵌合糖基轉(zhuǎn)移酶，設(shè)計(jì)構(gòu)建GtfA和GtfB嵌合體，可以生成大量的雜化糖肽類(lèi)抗生素。

這些早期的研究表明，通過(guò)結(jié)合不同的苷元、NDP-氨基脫氧己糖變體和Gtfs，有可能制造新的糖肽定向文庫(kù)。

2.2 阿伏霉素

阿伏霉素（Avoparcin）的化學(xué)性質(zhì)與萬(wàn)古霉素相似，是抗生素的混合物：主要有α和β兩個(gè)組成部分，除了在β變體上多了一個(gè)芳香族氯原子外，其他結(jié)構(gòu)都相同（圖3）。阿伏霉素最初是從Amycolatopsis coloradensis（原屬念珠鏈霉菌）中分離出來(lái)的，是一種II型糖肽類(lèi)抗生素，在農(nóng)業(yè)上被用作促進(jìn)生長(zhǎng)的飼料添加劑[29]。因?yàn)榘⒎顾卦谵r(nóng)場(chǎng)的廣泛使用會(huì)增加萬(wàn)古霉素耐藥菌株的流行，動(dòng)物和人類(lèi)糞便樣本中萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌（VRE）的發(fā)生率和多樣性已得到充分記錄，所以1997年開(kāi)始被歐盟委員會(huì)禁止使用[30]。由于目前禁止使用阿伏霉素，因此對(duì)其遺傳信息的進(jìn)一步研究受到限制。

2.3 瑞斯托菌素

Amycolatopsis lurida是唯一目前用于商業(yè)生產(chǎn)瑞斯托菌素（Ristocetin）的菌種。瑞斯托菌素是III型糖肽類(lèi)抗生素，最初是以Ristocetin A和Ristocetin B的混合物被發(fā)現(xiàn)，它們的微生物特性相似，但Ristocetin B更活躍。最近，發(fā)現(xiàn)Amycolatopsis sp.MJM2582和Amycolatopsis japonicum也能產(chǎn)生瑞斯托菌素。瑞斯托菌素的一個(gè)顯著特征是它的支鏈四糖結(jié)構(gòu)，由于其毒副作用包括血小板減少和血小板凝集，瑞斯托菌素僅用于體外診斷應(yīng)用[31]。

Amycolatopsis sp.MJM2582的瑞斯托菌素生物合成基因簇（ris）序列于2014年首次被報(bào)道[32]。幾乎與此同時(shí)，Spohn等[33]報(bào)道了Amycolatopsis japonicum的風(fēng)險(xiǎn)基因簇，這個(gè)基因簇是沉默的。但是，將巴爾赫霉素通路特異性調(diào)控基因bbrAba（bbr基因來(lái)自Balhimychina）在Amycolatopsis japonicum中異源表達(dá)后可以激活瑞斯托霉素（Ristomycin）的隱性基因簇[34]。這表明來(lái)自瑞斯托霉素和瑞斯托菌素生產(chǎn)菌的調(diào)節(jié)功能相似。

通過(guò)對(duì)ris編碼蛋白的序列的研究，發(fā)現(xiàn)了瑞斯托菌素的生物合成途徑：四個(gè)NRPS將β-羥基酪氨酸（Bht）、4-羥基苯甘氨酸（Hpg）和3，5-二羥基苯基甘氨酸（Dpg）組裝成肽，然后修飾七肽。四種細(xì)胞色素P450酶，六種Gtfs和兩種甲基轉(zhuǎn)移酶（Mtfs）參與瑞斯托菌素苷元的糖基化和甲基化[32]（圖4）。瑞斯托菌素是非氯代糖肽類(lèi)抗生素，其生物合成路線包括稀有的二脫氧糖L-ristosamine，這是瑞斯托菌素生產(chǎn)所必需的。Ristocetin A的糖苷被證明沒(méi)有血小板聚集的毒副作用，更重要的是，與瑞斯托菌素相比，表現(xiàn)出更好的抗菌活性，這意味著這種苷元有希望被開(kāi)發(fā)成一種抗菌制劑。

3 聚酮類(lèi)抗生素在擬無(wú)枝酸菌屬中的生物合成

3.1 利福霉素

利福霉素（Rifamycin）最早是從Amycolatopsis mediterranei分離出來(lái)的，利福霉素B是通過(guò)商業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的，利福霉素SV是利福霉素B的生物合成前體，效力更強(qiáng)，是第一個(gè)臨床使用的利福霉素[35]。利福霉素屬于安莎類(lèi)抗生素[36]，因其類(lèi)似籃子的分子結(jié)構(gòu)而得名，即芳香部分在非相鄰位置由脂肪鏈橋接。同位素標(biāo)記前體的追蹤實(shí)驗(yàn)、誘變和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，利福霉素是由芳香起始單元3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）、兩個(gè)乙酸酯和八個(gè)丙酸酯的延伸鏈組裝而成的聚酮[37]。利福霉素B生物合成中氨基莽草酸（ASA）途徑的一系列反應(yīng)可導(dǎo)致AHBA的合成，先將合成的3，4-二脫氧-4-氨基-D-阿拉伯-庚糖酸7-磷酸（aminoDAHP）轉(zhuǎn)化為3-脫氫奎寧酸（aminoDHQ），后者脫水為5-脫氧-5-氨基-3-脫氫莽草酸（aminoDHS），最后通過(guò)AHBA合成酶芳構(gòu)化為AHBA[38]。在2010年，首個(gè)完整的Amycolatopsis mediterranei基因組序列被報(bào)道（擬無(wú)枝酸菌屬的第一個(gè)基因組測(cè)序）[39]。

Yu等研究顯示[40]，通過(guò)失活和異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)基因rifG～rifN參與了AHBA的生物合成。五個(gè)大型開(kāi)放閱讀框架（ORF，rifA-E）共同編碼I型PKS以及NRPS腺苷化/巰基化結(jié)構(gòu)域[41]。AHBA是起始單元，2個(gè)丙二酰輔酶A分子和8個(gè)甲基丙二酰輔酶A分子是形成初始大環(huán)中間體Proansamycinx的延伸單元。RifA-E負(fù)責(zé)組裝一個(gè)線性的非修飾體；隨后一種由rifF編碼的酰胺合成酶催化這種未解肽的再釋放，并將其環(huán)化成大內(nèi)酰胺，即Proansamycin X。通過(guò)羥基化、乙酰化和甲基化，形成后期中間體利福霉素SV[37]。最后，細(xì)胞色素P450單加氧酶Rif16和轉(zhuǎn)酮酶Rif15將利福霉素SV轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物利福霉素[42]（圖5）。此外，利用蛋白—蛋白質(zhì)相互作用研究參與利福霉素生物合成的不同結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RifA、RifK、RifL、Rif-Orf19是主要的調(diào)控中心[43]。

RNA聚合酶β亞基（由rpoB編碼）與各種放線菌對(duì)利福平的耐藥性有關(guān)。遺傳學(xué)研究表明，rpoB突變顯著激活隱性或沉默的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，從而導(dǎo)致這些放線菌中產(chǎn)生新的抗生素[44]。

3.2 Chelocardin

Chelocardin（CHD）是一種非典型四環(huán)素，它是一種重要的多酮類(lèi)廣譜抗生素。典型的四環(huán)素通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成來(lái)阻止細(xì)菌生長(zhǎng)，與之相反，非典型四環(huán)素似乎擾亂了細(xì)菌胞質(zhì)膜的組織，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[45]。1962年首次報(bào)道自Amycolatopsis sulphurea分離的CHD，典型的四環(huán)素在C-2上有一個(gè)碳酰胺基團(tuán)，與之相比，CHD具有不同尋常的結(jié)構(gòu)特征，包括C-2上有一個(gè)乙酰基，環(huán)上有獨(dú)特的芳構(gòu)化模式C和C-9的功能化[46]。

2013年，從Amycolatopsis sulurea中克隆出CHD生物合成基因簇（chd），它包含18個(gè)候選ORF和一個(gè)II型PKS。推測(cè)CHD可能的生物合成途徑：第一步是合成新生聚酮主鏈，由最小的II型PKS催化，該基因由酮合酶α、酮合酶β和?；d體蛋白（分別由chdP，chdK和chdS編碼）組成。接下來(lái)是CHD主鏈的環(huán)化和芳構(gòu)化，以及對(duì)核心的修飾，包括C-9甲基化和C-4羥基化（圖6）[47]。CHD生物合成途徑中的許多基因在典型的四環(huán)素生物合成途徑中沒(méi)有對(duì)應(yīng)的基因，這與C-9甲基轉(zhuǎn)移酶chdMII、C4-氨基轉(zhuǎn)移酶chdN和輸出/抗性基因chdR有關(guān)，因此表明CHD基因簇整合了來(lái)自II型金黃色酸PKS系統(tǒng)的基因[48]?？偟膩?lái)說(shuō)，這些酶促使分子具有獨(dú)特的環(huán)C芳構(gòu)化，從而導(dǎo)致四環(huán)素主鏈的不尋常結(jié)構(gòu)。此外，大多數(shù)II型PKSs被認(rèn)為是由一個(gè)丙烯基單位的脫羧引發(fā)的，CHD的生物合成是由乙酸引發(fā)的，這種差異表明，通過(guò)組合生物合成有效地產(chǎn)生了新四環(huán)骨架[46]。

3.3 ECO-0501

13-羥基-2，12，14，16，22-五甲基-28-八烷基-2，4，6，8，10，14，20，24-辛烯酸（2-羥基-5-氧-環(huán)戊烯-1-烯基）酰胺（ECO-0501）是2006年通過(guò)基因組掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種新型線性多烯類(lèi)抗生素[49]。該化合物從Amycolatopsis orientalis中分離得到，其結(jié)構(gòu)定義了一個(gè)新的聚酮類(lèi)抗菌藥物：辛烯酸葡糖苷。

ECO-0501生物合成集群的跨度約為100 kb，由27個(gè)ORF組成，其中包括一個(gè)Ⅱ類(lèi)PKS?；谄渑c合成抗真菌劑ECO-02301基因簇的相似性[50]，ECO-0501生物合成途徑預(yù)測(cè)為PKS體系（ORFs 18-23）可生成含有多烯發(fā)色團(tuán)的長(zhǎng)聚酮骨架。三個(gè)ORF編碼將精氨酸轉(zhuǎn)化為4-胍-硝基丁基輔酶A的酶，并將活化的4-胍-硝基丁基裝載到第一個(gè)PKS模塊的裝載?；d體蛋白結(jié)構(gòu)域上，從而確定了聚酮的起始單元。兩個(gè)ORF為5-氨基乙酰丙酸酯的合成提供了酶，并通過(guò)輔酶A酯將其轉(zhuǎn)化為氨基—羥基環(huán)戊烯酮，而氨基—羥基環(huán)戊烯酮被編碼的酶濃縮到聚酮鏈的羧基端ORF 15。由ORF13編碼的糖氧化還原酶將D-葡萄糖氧化形成D-葡萄糖醛酸，隨后通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶（ORF 14）將其轉(zhuǎn)移到聚酮鏈的羥基上（圖7）[49]。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)ECO-0501基因簇表達(dá)分析表明，ECO-orf 4的轉(zhuǎn)錄與聚酮化合物生物合成的基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)，這些結(jié)果表明ECO-orf 4是ECO-0501生物合成所必需的途徑特異性正調(diào)控基因[51]。

4 總結(jié)與展望

擬無(wú)枝酸菌屬提供了大量有價(jià)值的抗生素，從該屬菌株中分離出的六種類(lèi)型抗生素已被闡明。除了ECO-0501是通過(guò)基因組分析和經(jīng)典篩選方法發(fā)現(xiàn)外，幾乎所有這些活性產(chǎn)物都是基于經(jīng)典的生物測(cè)定指導(dǎo)分離研究發(fā)現(xiàn)的。在Amycolatopsis orientalis ATCC 43491中發(fā)現(xiàn)了至少10個(gè)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（包括ECO-0501，但不包括萬(wàn)古霉素）的遺傳位點(diǎn)。這使人們?cè)俅握J(rèn)識(shí)到這個(gè)屬的生物合成潛力還遠(yuǎn)沒(méi)有得到充分利用。

基因組測(cè)序和基因操作技術(shù)的快速發(fā)展使研究人員能夠研究這些次生代謝產(chǎn)物的生物合成基因，以及生物體采用的酶促策略。對(duì)這些途徑的理解，便于考慮調(diào)整生物合成系統(tǒng)，使其利益最大化。此外，為了設(shè)計(jì)具有特異性途徑來(lái)生產(chǎn)新的“非自然”產(chǎn)品，應(yīng)該加大努力，破譯當(dāng)下難以捉摸的沉默或神秘基因簇。

參 考 文 獻(xiàn)

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