魚源β-防御素的生物信息學分析

收稿日期：2023-03-22

基金項目：濱州醫(yī)學院科研啟動基金（BY2021KYQD02）。

作者簡介：仇梓穎，本科，主要從事海洋生物抗菌肽基因挖掘和功能機制研究。

*通信作者：馬運琪，講師，主要從事海洋生物抗菌肽基因挖掘和功能機制研究。

摘要：魚源β-防御素是抗菌肽家族的重要成員，具有廣譜抗菌、不損傷真核細胞、不易產生耐藥性等特點，可應用于漁業(yè)養(yǎng)殖和臨床醫(yī)學等方面，但目前面臨著提取工藝復雜、含量較低、提取所用蛋白酶需求量大及以生產成本高等問題。因此分析其理化性質、結構和殺菌功能，對構造便捷和低廉的衍生肽具有重要的意義。本研究結合生物信息學軟件和工具預測分析其理化性質、二級結構、磷酸化和糖基化位點、疏水性、細胞內定位和信號肽。結果提示魚源β-防御素均為疏水性陽離子型抗菌肽。β-防御素抗菌肽通過C端親水作用與細菌膜結合，引導N端氨基酸的疏水作用插入膜磷酸二酯鍵中改變細胞膜的通透性使細菌生物膜破裂而死亡，其中AJA33388.1（紅牙鱗鲀）破膜殺菌能力最強。經檢測發(fā)現β-防御素耐熱性，穩(wěn)定性相對較好，尤其是ACO88907.1（鱖魚）和QNV47918.1（條石鯛）具有極高耐熱性，可將其應用于殺菌以外的多方面領域。其二級結構以α螺旋為主，具有一定的剛性結構，且均具有3～4個磷酸化位點，分布于細胞外，具有19～20個氨基酸的信號肽序列，指導其在胞外蛋白產物的分泌等。通過預測分析結構，可為β-防御素的深入研究和應用以及多領域的抗菌肽衍生物設計提供思路。

關鍵詞：β-防御素；生物信息學；理化性質；二級結構

中圖分類號：R978" " " " "文獻標志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）02-0136-10

Bioinformatics Analysis of Fish-Derived β-Defensin

Qiu Zi-ying，" "Ma Yun-qi

（School of Pharmacy Binzhou Medical University，" "Yantai" "Shandong" "264003）

Abstrat：" Fish-derived β-defensin is an important member of the antimicrobial peptide family. It has the characteristics of broad-spectrum antibacterial， does not damage eukaryotic cells， and is not easy to express drug resistance. It can be applied to fishery breeding， human clinical and other aspects. Nevertheless， it now faces issues with a difficult extraction procedure， poor yield， high manufacturing costs， and a high demand for the proteases needed for the extraction. Thus， it is crucial to examine its physicochemical characteristics， structure， and bactericidal action as well as to create practical and affordable derived peptides. In this study， the physicochemical properties， secondary structure， phosphorylation and glycosylation sites， hydrophobicity， intracellular localization and signal peptide were predicted and analyzed by bioinformatics tools. The results showed that fish β-defensins were hydrophobic cationic antimicrobial peptides. The β-defensin antimicrobial peptide binds to the bacterial membrane through the C-terminal hydrophilic effect， and guides the hydrophobic action of the N-terminal amino acid to insert into the membrane lipid bond to change the permeability of the cell membrane and cause the bacterial biofilm to rupture and die. It was found that β-defensins were heat-resistant and relatively stable， especially ACO88907.1 （mandarin fish） and QNV47918.1 （ striped sea bream） had extremely high heat resistance， which could be applied to many fields other than sterilization. Alpha helices make up the majority of its secondary structure， which has a rather rigid shape. All of its phosphorylation sites， which are dispersed outside of cells， have a signal peptide sequence consisting of 19–20 amino acids that directs the secretion of protein products into an extracellular region. By predicting and analyzing the structure， it can provide ideas for the in-depth study and application of β-defensins and antimicrobial peptide derivatives designs in many fields.

Key words ：" β-defensin;" "bioinformatics;" "physicochemical properties;" "secondary structure

隨著臨床抗菌藥物不斷應用和發(fā)展，生物體受到感染時的耐藥性的迅速增加對抗菌治療提出了嚴峻挑戰(zhàn)。目前科學家們正在努力研發(fā)出更加有效的抗菌抑制生物分子，使其在臨床或農業(yè)方面發(fā)揮更大作用。抗菌肽（Antibacterial peptide，AMP）又稱抗微生物肽，是機體免疫系統在受到外源性病原體或惡性細胞侵襲時產生的一種陽離子短肽[1]。其具有廣譜抗菌、抗腫瘤[2]和抗病毒[3]特性，不易產生耐藥性，不會損傷真核細胞[4]等諸多性質而被大眾所關注，成為一種新型的抗菌藥物。隨著技術的發(fā)展，魚類抗菌肽也走入大家的視野。其大多分布于魚類皮膚黏膜[5]上，構成外在屏障作為免疫系統第一道防線[6]起化學防護罩作用。

防御素（Defensin）是抗菌肽家族中的重要成員，根據其二硫鍵位置的不同可分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素三大類[7]。目前直接從魚類[8]體內提取抗菌肽面臨著工藝復雜、含量較低[9]、提取所用蛋白酶需求量大[10]和生產成本高等問題，且β-防御素相關理化性質結構等生物信息學分析較為欠缺。目前有學者將魚類相關基因特定位點進行了優(yōu)化改造設計，通過相關實驗檢測也成功獲得了更優(yōu)的抗菌活性[11]，這為后續(xù)抗菌肽的研發(fā)設計提供了新思路。因此本文將對魚源β-防御素抗菌肽進行生物信息學分析，運用多種信息學工具對其理化性質、二級結構、磷酸化和糖基化位點、信號肽和亞細胞定位等進行分析，初步獲得β-防御素對其殺菌能力具有關鍵作用的氨基酸位點及結構。在此基礎上對其進行氨基酸序列設計，獲得殺菌能力強，成本低廉的新型衍生肽。并為β-防御素的深入研究和應用提供更多的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取收集NCBI 官方數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中10種親緣相近的魚源 β-defensin 氨基酸序列，其氨基酸序列如表1所示。所選取的10條親緣關系相近的氨基酸的魚類目前基本上可以實現人工大規(guī)模飼養(yǎng)，但是均對水質范圍要求相對較窄，且易受菌類的侵襲感染導致人工飼養(yǎng)生產過程中的成本隨之提升。因此通過對其進行多方面生物信息學分析，獲得結構中對殺菌能力和結構維持具有重要作用的關鍵氨基酸和可變氨基酸，為接下來的序列改造和質粒構建提供原始材料。

1.2 生物信息學分析方法

利用BLAST工具和MEGA7工具進行多序列比對，分別分析獲得β-defensin的保守序列和親緣關系構建分子進化樹；通過ProtParam（http： //web.Expasy.org /protparam/）對10個氨基酸序列進行理化性質的分析；通過HNN（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行二級結構的預測和分析；通過NetPhos3.1Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）進行磷酸化位點分析；通過NetOGlyc 4.0 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetOGlyc-4.0）進行糖基化分析；通過HeliQuest（https：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/）進行疏水力矩分析、ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）進行疏水性分析；通過TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進行跨膜區(qū)域分析；通過TargetP－2. 0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TargetP-1.1）進行細胞內定位；通過SignalP－5. 0 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）進行信號肽分析[12]。

2 結果與分析

2. 1 魚源防御素的理化性質分析

利用BLAST工具和MEGA7工具對上述10種抗菌肽進行多序列比對和親緣關系分子進化樹，結果見圖1和圖2。通過對比圖1抗菌肽序列氨基酸的顏色，可以獲得不同氨基酸序列的不同之處。結合下文二級結構，可對相對應氨基酸位點進行定點突變改造，增強α螺旋結構的占比，提高剛性能力，同時減少磷酸化等結構，從而獲得更有效，更便捷的新型抗菌肽。

通過構建圖2分子進化樹，可以獲得10個β抗菌肽分子之間的親緣關系。以標尺標準為0.0100，得到AMR43367.1（貢氏假鰓鳉）和其他9條抗菌肽之前親緣關系最遠，QWB49506.1（大菱鲆）進化程度最高。但10條防御素親緣差異仍相差不大，結合圖1，他們之間的保守序列占比較大，可變氨基酸位點大都相似。可利于后續(xù)基因改造等相關基因工程實驗。

通過ProtParam工具對10條蛋白質的理化性質進行預測分析，結果見表2～4。表2可得出其10條β-防御素均由63～64個氨基酸殘基構成，除AMR43367.1（貢氏假鰓鳉）和ASW20415.1（大西洋白姑魚）相對分子量較大，其余防御素均在7 200～7 300之間。10條防御素的等電點均在8～9之間，由此在pH7的生態(tài)環(huán)境下這些β-防御素全部攜帶正電荷。并且通過對帶電荷氨基酸數目進行分析發(fā)現攜帶的正電荷氨基酸數目均大于攜帶負電荷的氨基酸數目，符合上述預測結果。綜上得出，所選取的10條魚源防御素均為陽離子型抗菌肽，普遍認為陽離子抗菌肽抑菌活性強于陰離子抗菌肽[13]。

分析表3可得，所選魚源β-防御素抗菌肽均具有紫外分光特性，紫外檢測均呈現陽性；半衰期的檢測分析得到，10條β-防御素在三種不同細胞內外的半衰期基本一致且時間較長，最長可達30 h，可通過改變氨基酸序列延長半衰期，增長抗菌作用時間；所有的β-防御素的不穩(wěn)定性均小于40，為穩(wěn)定性多肽。來源于鱖魚和條石鯛的β-防御素穩(wěn)定性最高，提示其序列可以構建穩(wěn)定性較高的新型抗菌肽；通過比較脂溶性分析，AMR43367.1（貢氏假鰓鳉）的指數值最高（＞90），耐熱性最強。其他防御素次之但也具較好的耐熱性，提示可應用于其他領域，如食品和工業(yè)方面[14]。通過對親水性觀察分析，可得出10條防御素的親水性平均系數除AJA33388.1（紅牙鱗純）外均大于0，盡管AJA33388.1呈極小親水性，但結合高脂溶性性質仍可得出此10條防御素均為疏水性抗菌肽，利于插入微生物膜形成孔洞結構[15]。

并且通過ProtScale工具，滑窗大小為 9，線性加權模型將再次對β-防御素疏水性/親水性比值進行圖譜分析，結果見圖3。幾乎所有防御素的1～18號位點以及之后個別幾位氨基酸位點的比值為＞0，呈現疏水性的特性，且在10～11位點的疏水性達到最高值。而其他氨基酸位點疏水性/親水性比值均＜0，呈現親水性的特性，于53位氨基酸呈現親水性最強。可推斷10條防御素的N-端大部分位于正值區(qū)域，為疏水區(qū)。C-端幾乎位于負值區(qū)域，為親水端。數據結果得出圖譜正值絕對值明顯大于負值絕對值，內在疏水性強于內在親水性，可證明此10條防御素抗菌肽均為疏水性氨基酸，與理化性質檢測結果相符。結合表1，可得出此10條β-防御素抗菌肽為疏水性陽離子多肽，根據現有研究可知，微生物膜表面通常呈現陰離子性[16]，富含磷脂酰甘油[17]等脂質，因此陽離子疏水性抗菌肽更利于與微生物結合作用，破壞其生物膜，從而達到抑菌效應。

通過表4可見，除了AMR43367.1（貢氏假鰓鳉）、QVU02406.1（曳絲鉆嘴魚）和QWB49506.1（大菱鲆）是由19種不同氨基酸殘基構成，其余均由20種不同的氨基酸殘基構成。其中AMR43367.1與QVU02406.1均不具有Asn （N）天冬氨酸，而QWB49506.1不具有Trp （W）色氨酸。

2. 2 魚源防御素的二級結構

運用HNN工具（參數：構象狀態(tài)數4；相似度閾值8；窗口寬度17）對魚源防御素抗菌肽進行二級結構的預測，結果見表5。通過表5，可以得出10條魚源防御素抗菌肽均具有多種不同的折疊方式：α螺旋、延伸鏈（β折疊）、β轉角和無規(guī)卷曲。除AJA33388.1（紅牙鱗鲀）無規(guī)卷曲占比最大外，其余抗菌肽的二級結構均由α螺旋占據主導地位。α螺旋結構具有一定的剛性性質[18]，占比越大，蛋白質的支撐力越強。在以下10條抗菌肽中，QWB49506.1（大菱鲆）的α螺旋含量最高，ASW20415.1（大西洋白姑魚）的延伸鏈（β折疊）含量最高，QVU02406.1（曳絲鉆嘴魚）的β轉角含量最高，AJA33388.1（紅牙鱗鲀）的無規(guī)卷曲含量最高。因此可構建α螺旋占比較多的新型抗菌肽，增強其支撐和穩(wěn)定性。

2. 3 魚源防御素的磷酸化與糖基化

蛋白質磷酸化是控制和調節(jié)蛋白質活力和功能的基礎，是細胞信號傳導過程中重要的機制[19]。通過NetPhos3.1Server在線工具對所有防御素抗菌肽進行磷酸化位點的檢測，結果見表6。結果可見，絕大部分防御素抗菌肽具有3個磷酸位點，僅QNV47918.1（條石鯛）、QWB49506.1（大菱鲆）和AJA33388.1（紅牙鱗鲀）具有4個磷酸化位點。磷酸化位點的氨基酸殘基均為絲氨酸（S）、酪氨酸（Y）和蘇氨酸（T）。甚至有的位點可以被多種磷酸激酶激化，如QVU02406.1（曳絲鉆嘴魚）和AMR43367.1（貢氏假鰓鳉）分別的16、17號位點絲氨酸，可以被unsp和CKII激化；QNV47918.1（條石鯛）和AJA333888.1（紅牙鱗鲀）的25號位點蘇氨酸可以被DNAPK和unsp激化；QWB49506.1（大菱鲆）28號位點的酪氨酸可以被INSR和unsp所激化。

蛋白質的N-糖基化修飾是一種翻譯后修飾，其在細胞中的定位，活性壽命乃至功能方面有著巨大的影響[20]。但通過NetNGlyc-1.0 - redirect對所有防御素進行預測，均并未發(fā)現N-糖基化位點。O-糖鏈能維持所連接蛋白質部分的空間構象，通過NetOGlyc 4.0 Server對所有O-糖基化位點進行預測，見表7。如圖所示，除ASW20415.1外其余抗菌肽5、29、63位點處均檢測出陽性。此外AMR43367.1的17號位點、ASW20415.1的30號位點、AJA33388.1和AJA33388.1的25和61號位點也呈現O-糖基化陽性。

2.4 魚源防御素的跨膜區(qū)和信號肽分析

跨膜區(qū)是蛋白質序列中跨越細胞膜的區(qū)域，通常為α-螺旋結構[21]，由20～25個氨基酸殘基構成[22]。通過TMHMM-2.0對抗菌肽的跨膜區(qū)進行在線分析，見表8。發(fā)現此10條氨基酸均不含跨膜螺旋數量，N端信號肽位于細胞質的概率均小于0.2。因此可以推斷10條防御素抗菌肽均為膜外蛋白，通過與細菌細胞膜相互作用而發(fā)揮殺菌作用[23]。

信號肽是引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的短（長度5～30個氨基酸）肽鏈[24]。對應的mRNA序列，在起始密碼子后，有一段編碼疏水性氨基酸序列的RNA區(qū)域，該氨基酸序列即為信號肽序列，它負責把蛋白質引導到細胞含不同膜結構的亞細胞器內來指導蛋白質的跨膜運輸[25]，為驗證所測防御素中是否含有信號肽，本文采用SignalP-5. 0工具來進行預測（圖4），發(fā)現除AMR43367.1在18～19號位發(fā)生斷裂，證明AMR43367.1的信號肽區(qū)域為1～18號氨基酸的位置。剩下的10條防御素均在20～21號氨基酸位置斷裂，1～20號氨基酸序列為其信號肽序列。同時表9也可以證明此10條β-防御素抗菌肽均為分泌性蛋白。通過核糖體在細胞質內合成后，在信號肽的引導下穿過細胞膜在細胞外發(fā)揮其殺傷作用。

2.5 魚源防御素的亞細胞定位分析

通過亞細胞定位可以推測生物大分子基因表達產物在細胞內具體存在的位置。本文通過TargetP 1.1預測真核蛋白的亞細胞位置，見表10。線粒體靶向肽（mTP）值接近1確定線粒體SP近于1.0就預測有信號肽，而根據數據得出其信號肽不在線粒體，而均位于細胞外，與跨膜區(qū)驗證結果相符。

2. 6 魚源防御素的疏水力矩分析

結合圖3結果分析，可得到所選10條抗菌肽序列中N端為疏水端，C端為親水端。結合抗菌肽殺菌機制文獻可知，抗菌肽C端親水端首先與微生物膜表面結合，引導N端疏水端接觸生物膜，對其進行破壞。而疏水力矩越強，其疏水端破膜能力越強[26]。因此運用HeliQuest分析工具分析其N端疏水力矩，分析10條防御素抗菌肽的破膜能力。結果如表11和圖5所示，AJA33388.1（紅牙鱗鲀）的N端螺旋結構異于其他9條，其疏水力矩明顯大于其他β-防御素抗菌肽，因此紅牙鱗鲀殺菌能力最強。

3 總結

利用生物信息學方法對10條魚源β-防御素抗菌肽進行預測分析，預測結果表明10條均為陽離子型抗菌肽，相較于傳統抗生素應用更具廣泛性，既有抗革蘭陽性菌和革蘭陰性菌作用[27]，又有抗真菌和抗病毒作用。其均為疏水性氨基酸，可在蛋白質的三級結構中發(fā)揮重要作用。這些β-防御素抗菌肽通過C端親水作用與細菌膜結合，引導N端氨基酸的疏水作用插入膜磷酸二酯鍵中改變細胞膜的通透性使細菌生物膜破裂而死亡[28]，其中AJA33388.1（紅牙鱗鲀）破膜殺菌能力最強。經檢測發(fā)現10條抗菌肽耐熱性，穩(wěn)定性相對較好，尤其是ACO88907.1（鱖魚）和QNV47918.1（條石鯛）具有極高耐熱性，可將其應用于殺菌以外的多方面領域。魚源β-防御素的二級結構以α螺旋以及無規(guī)卷曲結構占比相對較高，其中α螺旋占主導地位使防御素抗菌肽具有一定的剛性結構，維持其結構穩(wěn)定性。并且均具有3～4個磷酸化位點，分布于細胞外，具有19～20個氨基酸的信號肽序列，指導其在胞外蛋白產物的分泌等。

本實驗通過多種生物信息學方法，分析β-防御素抗菌肽的理化、結構、定位及功能等多種性質，為接下來的實驗探究提供基礎材料。現有國內外多位學者均已經證明β-防御素可以在真核畢赤酵母中表達并且分泌出體外[29]，產生有活性可以起抑菌作用的抗菌肽。也有學者通過對鱖魚和斑馬魚的某個特定β-防御素基因進行了優(yōu)化設計[30]，在不改變該基因氨基酸序列的條件下，改善增加畢赤酵母的偏愛密碼子，促進其表達，通過抗菌相關實驗可以得到進行過優(yōu)化的基因序列與原基因表達產物間抗菌能力得到了明顯的提升。證明通過對基因密碼子的改造可以改善表達產物的產物效果，并且經濟成本低廉，相關實驗操作也相對容易。這為后續(xù)的抗菌肽相關改造提供了大量的借鑒思路，因此可通過改變氨基酸的序列，來為制備相關抗菌肽提供基礎?？梢栽讷@得的結果基礎上結合生物化學和分子生物學等實驗技術，設計研發(fā)出殺菌能力更加優(yōu)越的防御素衍生肽，減少漁業(yè)養(yǎng)殖和人體臨床應用成本。同時為更多新型衍生肽的結構設計提供思路，實現其應用價值。

參 考 文 獻

Hou Z， Shankar Y V， Liu Y， et al. Nanoparticles of short cationic peptidopolysaccharide self-assembled by hydrogen bonding with antibacterial effect against multidrug-resistant bacteria[J]. ACS Appl Mater Interfaces， 2017， 9（44）：38288-38303.

Lehmann N J， Retz M， Sidhu S S， et al. Antitumor activity of the antimicrobial peptide magainin Ⅱ against bladder cancer cell lines [J]. European Urology， 2006， 50（1）： 141-147.

Feng M， Fei S， Xia J， et al. Antimicrobial peptides as potential antiviral factors in insect antiviral immune response [J]. Front Immunol， 2020， 11： 2030.

Onime L A， Oyama L B， Thomas B J， et al. The rumen eukaryotome is a source of novel antimicrobial peptides with therapeutic potential [J]. BMC Microbiol， 2021， 21（1）： 105.

Sinner M P， Masurat F， Ewbank J J， et al. Innate immunity promotes sleep through epidermal antimicrobial peptides [J]. Curr Biol， 2021， 31（3）： 564-77e12.

Clausen M L， Agner T. Antimicrobial peptides， infections and the skin barrier [J]. Curr Probl Dermatol， 2016， 49： 38-46.

Greco S， Gerdol M， Edomi P， et al. Molecular diversity of mytilin-like defense peptides in mytilidae （Mollusca， Bivalvia） [J]. Antibiotics （Basel）， 2020， 9（1）：37.

郭洪燕， 楊桂文， 安利國.魚類β-防御素的研究進展[J].生命科學， 2012， 24（04）：321-327.

張冉令， 潘宇政， 黃文川， 等.基于β-防御素-2的中藥骨碎補對氣管切開留置氣管套大鼠肺部免疫功能的干預作用[J].時珍國醫(yī)國藥， 2016， 27（10）：2365-2368.

Migon D， Neubauer D， Kamysz W. Hydrocarbon stapled antimicrobial peptides [J]. Protein J， 2018， 37（1）： 2-12.

胡媛媛， 劉子琦， 喬子祺， 等. 斑馬魚Hepcidin-2基因結構的生物信息學分析與抗菌活性優(yōu)化設計[J].中國生物制品學雜志， 2022， 35（02）：150-158.

楊紅艷， 盧奎， 杜蘅， 等. 天蠶素抗菌肽的生物信息學分析 [J]. 河南工業(yè)大學學報（自然科學版）， 2021， 42（04）： 58-67.

Li S， Yajiexue ， Zihanjia， et al. The structure-mechanism relationship and mode of actions of antimicrobial peptides： A review [J]. Trends in Food Science amp; Technology， 2021， 109： 103-115.

Egan K， Field D， Rea M C， et al. Bacteriocins： Novel solutions to age old spore-related problems？ [J]. Front Microbiol， 2016， 7： 461.

He S， Stone T A， Deber C M. Uncoupling amphipathicity and hydrophobicity： Role of charge clustering in membrane interactions of cationic antimicrobial peptides [J]. Biochemistry， 2021， 60（34）： 2586-2592.

王奇， 李軍， 趙敏， 等. 生物膜反應器的生物膜胞外聚合物的提取和分級分析方法： CN103272404B[P].2014-10-29.

Teo A C K， Lee S C， Pollock N L， et al. Analysis of SMALP co-extracted phospholipids shows distinct membrane environments for three classes of bacterial membrane protein [J]. Sci Rep， 2019， 9（1）： 1813.

Barnes C A， Shen Y， Ying J， et al. Remarkable rigidity of the single alpha-helical domain of myosin-Ⅵ as revealed by NMR spectroscopy [J]. J Am Chem Soc，" 2019， 141（22）： 9004-9017.

劉奇， 尹磊淼， 魏穎， 等.蛋白質磷酸化檢測方法及原理[J].中國醫(yī)藥生物技術， 2013， 8（02）：134-138.

馬振平. N-糖基轉移酶（NGT）的克隆表達及與多肽底物特異性研究 [D]. 天津：南開大學， 2015.

Beytur S. Marker residue types at the structural regions of transmembrane alpha-helical and beta-barrel interfaces [J]. Proteins， 2021， 89（9）： 1145-1157.

Foct D， Neumann C， Lyons J， et al. A non-helical region in transmembrane helix 6 of hydrophobic amino acid transporter MhsT mediates substrate recognition [J]. EMBO J， 2021， 40（1）： e105164.

Xing K， Xing Y， Liu Y， et al. Fungicidal effect of chitosan via inducing membrane disturbance against Ceratocystis fimbriata [J]. Carbohydr Polym， 2018， 192： 95-103.

張以澤. 基于層次混合模型的蛋白質信號肽預測研究[D].上海：上海交通大學， 2017.

彭佳師， 龔繼明. 信號肽與蛋白質的分選轉運[J].植物生理學報， 2011， 47（01）：9-17.

Islam R M， Permousa M， Gordon S， et al. Abstract 564： structure-function studies of apoA-I mimetic peptides for ABCA1-dependent cholesterol efflux and HDL formation [J]. Arterioscler Thromb Vasc Bio， 2017， 37（suppl_1）： A564-A564.

劉倚帆， 徐良， 朱海燕， 等.抗菌肽與抗生素對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的體外協同抗菌效果研究[J].動物營養(yǎng)學報， 2010， 22（05）：1457-1463.

De Souza de Azevedo P O， Converti A， Gierus M， et al. Application of nisin as biopreservative of pork meat by dipping and spraying methods [J]. Braz J Microbiol， 2019， 50（2）： 523-526.

Wang S， Lü X， Zhao Z， et al. Expression of ietalurus punetaus β-defensin based on recombinant pichia pastoris [J]. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao， 2020， 36（8）： 1590-1599.

陶妍， 宋長豐， 李雯. 斑馬魚防御素defbl3的優(yōu)化基因及其重組蛋白的制備方法： CN105400791B[P]. 2019-03-05.