基于差分脈沖伏安法快速檢測花椒油樹脂中的麻味物質

白春暉 蔣茜 趙志峰 谷學權 幸勇 莫小燕 何強

摘要：麻味物質含量是花椒油樹脂的重要品質指標，文章基于電化學原理中的差分脈沖伏安法首次建立了一種采用未修飾的絲網(wǎng)印刷電極測定花椒油樹脂中麻味物質的快速檢測方法，通過優(yōu)化電化學工作站中的富集時間、電壓以及待測液中的甲醇占比、pH值，并以紫外分光光度計檢測法為對照構建出了該方法。結果表明，以未修飾的絲網(wǎng)印刷電極檢測花椒油樹脂中麻味物質的適宜條件：富集時間為120 s，富集電壓為0.2 V，甲醇在待測液中占比小于5%，pH值為1，2，3，山椒素的電流值與其濃度在2～50 mg/L范圍內呈良好的線性關系（R²=0.999），加標回收率在97.60%～108.40%之間，檢出限為0.22 mg/L。經(jīng)驗證，該方法與行業(yè)標準GH/T 1290—2020方法具有良好的檢測一致性（RSD=4.75%），建立的快速檢測方法既具有操作簡單、方便快速的優(yōu)點，又兼具傳統(tǒng)方法的準確性與重復性，因此可以作為花椒及其制品中麻味物質的快速檢測方法進行科學研究與企業(yè)生產(chǎn)實踐，且有望基于該方法開發(fā)出便攜式麻味物質快速檢測儀器。

關鍵詞：花椒；山椒素；差分脈沖伏安法（DPV）；絲網(wǎng)印刷電極；紫外分光光度法

中圖分類號：TS225.1

文獻標志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0162-06

Rapid Detection of Numb-Taste Substances in Zanthoxylum bungeanum

Oleoresin Based on Differential Pulse Voltammetry

BAI Chun-hui¹， JIANG Xi¹， ZHAO Zhi-feng¹， GU Xue-quan²，

XING Yong²， MO Xiao-yan²， HE Qiang^1*

（1.College of Biomass Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065， China;

2.Sichuan Wufeng Lihong Food Co.， Ltd.， Ya'an 625302， China）

Abstract： The content of numb-taste substances is an important quality index of Zanthoxylum bungeanum oleoresin. Based on differential pulse voltammetry in electrochemistry principles， a rapid detection method for the determination of numb-taste substances in Zanthoxylum bungeanum oleoresin with unmodified screen-printed electrode is established for the first time. By optimizing the enrichment time， voltage in the electrochemical workstation， the proportion of methanol in the tested solution and pH value， the method is constructed with ultraviolet spectrophotometer detection method as the control. The results show that the optimum conditions for the detection of numb-taste substances in Zanthoxylum bungeanum oleoresin with unmodified screen-printed electrode are as follows： enrichment time is 120 s， enrichment voltage is 0.2 V， the proportion of methanol in the tested solution is less than 5% and pH value is 1， 2， 3， the current value of sanshool shows a good linear relationship with its concentration in the range of 2～50 mg/L （R²=0.999）， the spiked recovery rates are 97.60%～108.40% and the limit of detection is 0.22 mg/L. It is verified that this method has good detection consistency with the industry standard GH/T 1290—2020 method （RSD=4.75%）. The established rapid detection method not only has the advantages? of simple， convenient and fast operation， but also has the accuracy and repeatability of the traditional method. Therefore， it can be used as a rapid detection method of numb-taste substances in Zanthoxylum bungeanum and its products for scientific research and enterprise production practice， and it is expected to develop a portable rapid detection instrument of numb-taste substances based on this method.

Key words： Zanthoxylum bungeanum; sanshool; differential pulse voltammetry （DPV）; screen-printed electrode; ultraviolet spetrophotometry

收稿日期：2024-01-05

作者簡介：白春暉（1999—），男，碩士，研究方向：健康食品工程。

*通信作者：何強（1971—），男，教授，博士后，研究方向：農產(chǎn)品加工及質量安全。

花椒（Zanthoxylum bungeanum）系蕓香科花椒屬植物，花椒油樹脂是通過萃取工藝制得的具有高濃縮風味物質的半固態(tài)萃取物，目前作為椒麻味香精香料已經(jīng)廣泛應用于食品行業(yè)中^[1]。在花椒領域，以花椒油樹脂為代表的花椒制品中麻味物質的檢測方法主要有GH/T 1290—2020《花椒及花椒加工產(chǎn)品 花椒酰胺總含量的測定 紫外分光光度法》、GH/T 1291—2020《花椒及花椒加工產(chǎn)品 花椒酰胺總含量的測定 高效液相色譜法》^[2-3]。然而，紫外分光光度法和高效液相色譜法因所需要的儀器設備價格較高且操作相對復雜、人員需要培訓等而無法滿足中小型企業(yè)的實際需求。為解決大型儀器的檢測弊端，近年來電化學方法因具有操作簡單、檢測效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點而被廣泛應用于各類物質的快速檢測^[4]。例如關于使用電化學方法檢測辣椒中辣椒素的文章已經(jīng)被大量報道^[5]。陸超群等^[6]研究了使用玻碳電極檢測辣椒素時，辣椒素的電流值與其濃度在5～80μmol/L范圍內呈較好的線性關系，檢測限為2.30μmol/L；Sun等^[7]使用玻碳電極通過電化學方法對花椒中山椒素進行檢測，結果表明基于電化學原理新構建的檢測方法與傳統(tǒng)方法具有良好的一致性，同時新方法具有操作簡單、不需要大型儀器等優(yōu)點。而在已經(jīng)建立的多種電化學方法中，起到傳感作用的電極材料是其核心配件，與廣泛使用的玻碳電極相比，絲網(wǎng)印刷電極（screen-printed electrode）是一類靈敏度高、性能穩(wěn)定、體積小、易攜帶、成本相對較高的新一代電極片，是目前最有潛力開發(fā)成快速檢測儀器的關鍵配件^[8]。Jiménez等^[9]研究表明使用未修飾的絲網(wǎng)印刷電極檢測辣椒素時，辣椒素的電流值與其濃度在4.7～150.3μmol/L范圍內呈良好的線性關系，檢測限為1.4μmol/L。然而，在花椒及其制品中麻味物質的定量檢測中，還未見基于絲網(wǎng)印刷電極進行電化學快速檢測方法開發(fā)的文獻報道。

因此，本研究采用未修飾的絲網(wǎng)印刷電極，基于差分脈沖伏安法建立了一種定量測定花椒油樹脂中麻味物質的方法，以6種商品化花椒油樹脂的實證數(shù)據(jù)與行業(yè)標準GH/T 1290—2020方法相比較，證明該方法具有操作簡單、方便快速、準確性與重復性良好、檢測限低的優(yōu)點。本文為花椒及其制品中麻味物質含量的檢測提供了一種新的便捷、快速的現(xiàn)場檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗原料

花椒油樹脂：由四川五豐黎紅食品有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

羥基-α-山椒素（純度≥98.00%）：成都麥德生科技有限公司；甲醇（色譜純）、鹽酸（分析純）等其他化學品：成都市科隆化學品有限公司。

1.1.3 主要儀器與耗材

UV-1900I型紫外分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；PalmSens4便攜式電化學工作站 雷迪美特（中國）有限公司；No.TE100-SB Three Electrode SPE（絲網(wǎng)印刷電極） 禪譜科技股份有限公司；PHS-3電子精密 pH 計 上海雷磁儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 電化學待測液的制備

花椒油樹脂提取液的制備：參考蒲升惠等^[10]的方法并加以修改，稱取0.2 g花椒油樹脂于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇后超聲處理30 min，超聲后將混合物全部轉移到100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，即得提取液。

電化學待測液的制備：用移液槍準確移取0～0.5 mL提取液于10 mL容量瓶中，使用pH為1的鹽酸作為緩沖液定容至刻度線，搖勻，即得電化學待測液。

1.2.2 電化學測定過程

按照圖1中流程，以羥基-α-山椒素標準品為溶質，制備麻味物質濃度為20 mg/L的電化學待測液，甲醇占比為5%，以pH為1的鹽酸溶液作為緩沖液。測定前，將絲網(wǎng)印刷電極片連接在電化學工作站上，用移液槍移取200μL電化學待測液，將其準確滴加在未修飾的絲網(wǎng)印刷電極片中心，設置實驗參數(shù)后，即可開始測定。

1.2.3 電化學測定條件的優(yōu)化

1.2.3.1 富集時間和富集電壓的優(yōu)化

在實驗過程中，待測液與絲網(wǎng)印刷電極接觸時間的長短會影響最終所測電流值的大小，而電流值的大小對于檢測限和檢測范圍的影響較大^[11]。因此，選擇麻味物質含量為20 mg/L的電化學待測液，甲醇占比為5%，pH值為1，采用DPV法研究了富集電壓均為0 V、富集時間分別為0，30，60，90，120，150，180 s對未修飾的絲網(wǎng)印刷電極測定麻味物質的影響，以及富集時間均為120 s、富集電壓分別為－0.3，－0.2，－0.1，0，0.1，0.2，0.3 V對未修飾的絲網(wǎng)印刷電極測定麻味物質的影響。

1.2.3.2 甲醇占比的優(yōu)化

電化學實驗中的待測液主要由麻味物質提取液與鹽酸溶液混合制成，麻味物質提取液的主要成分為甲醇，過多的甲醇占比會影響待測液的pH值，從而影響待測液中麻味物質含量的檢測^[7]。因此，需要控制甲醇在待測液中的占比。

選擇麻味物質濃度為20 mg/L的電化學待測液，甲醇占比為5%，以pH為1的鹽酸溶液作為緩沖液，采用DPV法研究了甲醇在待測液中占比分別為1%、2%、3%、4%、5%對未修飾的絲網(wǎng)印刷電極測定麻味物質的影響。

1.2.3.3 緩沖液pH的優(yōu)化

麻味物質的氧化峰電流與配制待測液的鹽酸溶液的pH值密切相關^[12]。選擇麻味物質濃度為20 mg/L的電化學待測液，甲醇占比為5%，采用DPV法研究了緩沖液pH值分別為1，2，3，4，5，6，7對未修飾的絲網(wǎng)印刷電極測定麻味物質的影響。

1.2.4 電化學檢測方法的構建

1.2.4.1 確定電化學檢測標準曲線與檢測限

將羥基-α-山椒素標準品配制成濃度為1 000 mg/L的母液，分別移取0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL至10 mL容量瓶中，再用pH為1的鹽酸溶液定容至刻度線，得到麻味物質濃度分別為2，5，10，20，30，40，50 mg/L的電化學待測液。采用差分脈沖伏安法（DPV）測定山椒素氧化峰電流值，以麻味物質濃度為橫坐標、氧化峰電流值為縱坐標繪制麻味物質的電化學檢測標準曲線，通過標準曲線的斜率（k）和空白樣測定的標準偏差（standard deviation，SD）計算得出檢出限（LOD=3SD/k）。

1.2.4.2 加標回收率的測定

取已知麻味物質含量的樣品12份，分別加入等體積不同濃度（2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L）的羥基-α-山椒素標準溶液，每個濃度制備3個平行樣品，采用DPV法檢測3次。將測得的響應電流值代入標準曲線中，計算得出麻味物質含量和加標回收率。加標回收率按照公式（1）進行計算：

加標回收率（%）=實際測得的山椒素濃度（mg/L）-本底值（mg/L）加入的山椒素濃度（mg/L）×100%。（1）

1.2.5 紫外分光光度法測定麻味物質

紫外分光光度法標準曲線的構建：配制質量濃度分別為0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L的羥基-α-山椒素標準溶液，采用紫外分光光度法對各濃度標準溶液進行測定。以山椒素濃度為橫坐標、溶液在270 nm處的吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

花椒油樹脂的檢測：參考GH/T 1290—2020《花椒及花椒加工產(chǎn)品 花椒酰胺總含量的測定 紫外分光光度法》中的方法^[2]，精密稱取0.2 g花椒油樹脂樣品置于具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇，超聲萃取0.5 h，冷卻至室溫，轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后于270 nm波長處測定吸光度。

1.3 統(tǒng)計分析

文中涉及實驗的結果均測定3次，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析進行顯著性差異分析，P＜0.05表明具有顯著性，利用Origin 2021軟件繪制實驗數(shù)據(jù)圖。

2 結果與分析

2.1 氧化還原電位的確定

由于循環(huán)伏安法（CV）操作簡單且耗時短，因此基于該方法在未富集的條件下研究了絲網(wǎng)印刷電極上山椒素的電化學行為。確定羥基-α-山椒素的還原電位，以此確定實驗的檢測范圍。而差分脈沖伏安法（DPV）較循環(huán)伏安法（CV）更靈敏，因此基于該方法進行山椒素中麻味物質的定量檢測。CV模式下的掃描條件：電位范圍0.6～1.2 V，掃描速度0.1 V/s。DPV模式下的掃描條件：電位范圍0.6～1.2 V，階躍電位0.005 V，脈沖電位0.05 V，脈沖時間0.02 s，掃描速度0.05 V/s。

20 mg/L的電化學待測液在循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法下的實驗結果見圖2。

由圖2中a可知，在循環(huán)伏安法（CV）的檢測過程中，羥基-α-山椒素在0.927 V處顯示出明顯的氧化，且陽極峰不可逆。由圖2中b可知，在差分脈沖伏安法（DPV）的檢測過程中，羥基-α-山椒素在0.872 V處顯示出明顯的氧化。兩種電化學方法的檢測結果類似，均表明羥基-α-山椒素的出峰范圍在0.8～1.0 V附近。因此，確定在兩種模式下麻味物質的檢測范圍為0.6～1.2 V。

2.2 富集時間和富集電壓的優(yōu)化

富集時間的長短和富集電壓的大小對麻味物質檢測的靈敏度具有一定的影響^[13]。不同的富集時間和富集電壓對DPV法測定的山椒素的影響見圖3。DPV法測定麻味物質檢測實驗固定參數(shù)設置：掃描電位范圍0.6～1.2 V，階躍電位0.005 V，脈沖電位0.05 V，脈沖時間0.02 s，掃描速度 0.05 V/s。圖3中a的富集電壓為0 V，圖3中b的富集時間為0 s。

由圖3中a可知，當富集時間為0～120 s時，實驗產(chǎn)生的電流值先隨著富集時間的增加而增大，當富集時間達到120 s時，實驗產(chǎn)生的電流值最大，當富集時間超過120 s后，實驗產(chǎn)生的電流值隨著富集時間的增加而減小。由圖3中b可知，當富集電壓為 －0.3～－0.1 V時，實驗產(chǎn)生的電流值先隨著富集電壓的升高而增大，當富集電壓為0 V時，實驗產(chǎn)生的電流值最小。當富集電壓為0～0.3 V時，實驗產(chǎn)生的電流值隨著富集電壓的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當富集電壓為0.2 V時，實驗產(chǎn)生的電流值最大。因此，選擇富集時間120 s、富集電壓0.2 V作為適宜的測定條件。

2.3 甲醇占比的確定

待測液中甲醇占比不同對DPV 法測定山椒素的影響見表1。

由表1可知，當甲醇占比小于5%時，平行測定的同一花椒油樹脂（21.48 mg/g）的氧化峰電流值的RSD為2.10%，此時測定具有較好的穩(wěn)定性。因此，選擇甲醇在待測液中占比小于5%作為適宜的測定條件。

2.4 pH值的優(yōu)化

由圖4中a和b可知，當 pH值為1，2，3時，山椒素的檢測電流值處于較高的水平。當pH值為2～7時，檢測到的電流值逐漸降低，這與pH值對玻碳電極測定山椒素的影響一致^[7]。因此，pH值為1，2，3可以視為較優(yōu)的實驗條件，用于后續(xù)研究。

2.5 電化學標準曲線和檢出限的測定

圖5 麻味物質的電化學標準曲線

Fig.5 Electrochemical standard curve of numb-taste substances

為了實現(xiàn)在電化學方法中定量檢測花椒油樹脂中麻味物質的含量，通過上述實驗，確定了實驗條件的最佳范圍。在優(yōu)化后的檢測條件下，研究了氧化峰電流值與羥基-α-山椒素標準溶液濃度之間的關系。由圖5可知，羥基-α-山椒素的氧化峰電流值y與其濃度x在2～50 mg/L范圍內呈良好的線性關系，線性方程為y=0.121 88x－0.163 08（R²=0.999）。根據(jù)標準曲線的斜率（k）和空白樣測定的標準偏差（standard deviation，SD），求得其檢測限（LOD=3SD/k）為0.22 mg/L。

2.6 方法加標回收率的測定

由表2可知，2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L 4個不同濃度的麻味物質樣品的加標回收率在97.60%～108.40%之間。結果表明，通過未修飾的絲網(wǎng)印刷電極測定麻味物質的結果準確可靠，可以應用于花椒及其制品中麻味物質含量的檢測。

2.7 電化學方法與行業(yè)標準方法的結果比較

為了驗證電化學檢測中DPV法的準確性，依據(jù)GH/T 1290—2020《花椒及花椒加工產(chǎn)品 花椒酰胺總含量的測定 紫外分光光度法》建立了標準曲線，見圖6。

由圖6可知，線性方程為y=0.234 8x+0.053 87（R²=0.999）。其中吸光度值y與羥基-α-山椒素標準溶液濃度x在0～3.0 mg/L范圍內呈良好的線性關系。6種商品化花椒油樹脂的電化學檢測方法和紫外分光光度法測定結果見表3。

由表3和圖7中a、b可知，6種花椒油樹脂的電化學測定結果與紫外分光光度法測定結果基本一致，圖7中a曲線A的斜率為1.002 04，體現(xiàn)了檢測的一致性。同時分析了兩種方法所測得的6個實際樣品的RSD在0.54%～4.75%之間（<5%），證明本文建立的基于DPV模式采用未修飾的絲網(wǎng)印刷電極的電化學快速檢測方法具有較高的準確性，可以作為傳統(tǒng)檢測方法的一種新型替代法，能夠證明電化學法可以用于花椒及其制品中麻味物質含量的實際檢測。

3 結論

本文將未修飾的絲網(wǎng)印刷電極應用于麻味物質的測定，并對測定條件進行了優(yōu)化，建立了一種快速檢測花椒及其制品中麻味物質含量的電化學檢測方法。該方法檢測花椒油樹脂中麻味物質含量的適宜條件：在0.6～1.2 V下進行檢測，富集時間為120 s，富集電壓為0.2 V，甲醇在待測液中的占比小于5%，緩沖液的pH值為1，2，3。麻味物質的電流值與其濃度在2～50 mg/L范圍內呈良好的線性關系，具有較好的檢出限、穩(wěn)定性和加標回收率。此外，與標準方法中的紫外分光光度法進行對比，該方法具有良好的檢測一致性。因此，該方法可代替行業(yè)標準中的紫外分光光度法對麻味物質進行定量檢測，具有操作簡單、成本低廉、檢測效率高等優(yōu)點。未來結合新的電極修飾手段將是該研究領域的趨勢。

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