即食肉制品中分離的科氏葡萄球菌科氏亞種HT-26及其快速檢測分子標(biāo)識篩選

錢澄倩 杜宇輝 紀(jì)耀勇 黃艷蒙 李賢信

摘要：科氏葡萄球菌是一種皮膚共生菌，但在一定條件下也可引起炎癥和疾病，常分布于人類、畜牧動物、食品等環(huán)境中。該研究從市售即食肉制品中分離得到一株科氏葡萄球菌HT-26，經(jīng)分析鑒定該菌株屬于科氏葡萄球菌科氏亞種（SCC）。由于SCC與其近源菌種的基因組序列相似度高，因此SCC的快速特異性檢測存在一定困難。該研究基于比較基因組學(xué)分析找到4段SCC特異性序列，并篩選和驗證得到一對高效特異性檢測引物，可實現(xiàn)最低27 CFU/mL濃度的SCC檢測，且可有效應(yīng)用于即食肉制品中，最低檢測限可達(dá)115 CFU/g。對即食肉制品或其他食品實行SCC的快速特異性檢測可加強(qiáng)調(diào)味品中微生物污染防治監(jiān)控，進(jìn)一步加強(qiáng)食品安全保障。

關(guān)鍵詞：科氏葡萄球菌；科氏葡萄球菌科氏亞種；SCC；qRT-PCR；即食肉制品

中圖分類號：TS251.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0157-05

Staphylococcus cohnii subsp. cohnii HT-26 Isolated from Instant Meat

Products and Screening of Its Rapid Detection Molecular Marker

QIAN Cheng-qian^{1，2，3}， DU Yu-hui¹， JI Yao-yong³，

HUANG Yan-meng³， LI Xian-xin^{2，3，4*}

（1.School of Biological Science and Engineering， South China University of Technology，

Guangzhou 511400， China; 2.Foshan Haitian Flavoring & Food Co.， Ltd.， Foshan 528000，

China; 3.Branch Office of Tianyan （Tianjin） High-Tech Co.， Ltd.， Foshan 528000，

China; 4.Foshan Haitian （Gaoming） Flavoring & Food Co.， Ltd.，

Foshan 528500， China）

Abstract： Staphylococcus cohnii is a kind of skin symbiotic bacterium， but it can also cause inflammation and diseases under certain conditions. It is commonly distributed in the environments such as humans， livestock and food. In this study， a strain of Staphylococcus cohnii HT-26 is isolated from commercially available instant meat products. After analysis， it is identified that the strain belongs to Staphylococcus cohnii subsp. cohnii （SCC）. Due to the high similarity of genomic sequences between SCC and its close-related species， there are certain difficulties in the rapid and spectific detection of SCC. In this study， based on comparative genomics analysis， four SCC specific sequences are found， and a pair of efficient specific detection primers is screened and verified， which can achieve SCC detection at the minimum concentration of 27 CFU/mL and can be effectively applied in instant meat products， with the minimum detection limit of 115 CFU/g. Implementing rapid and specific SCC detection on instant meat products or other foods can strengthen the prevention and monitoring of microbial contamination in seasonings and further enhance food safety assurance.

Key words： Staphylococcus cohnii； Staphylococcus cohnii subsp. cohnii； SCC； qRT-PCR； instant meat products

收稿日期：2023-12-30

基金項目：廣東省調(diào)味食品生物發(fā)酵先進(jìn)技術(shù)企業(yè)重點實驗室開放基金項目（2017B030302002）

作者簡介：錢澄倩（1992—），女，博士，研究方向：微生物檢測技術(shù)和分子機(jī)制。

*通信作者：李賢信（1984—），男，工程師，碩士，研究方向：食品安全檢測技術(shù)。

科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）是凝固酶陰性葡萄球菌中的一種革蘭氏陽性菌，于1975年被正式劃分并命名^[1]，廣泛分布于多種食品樣本，如豬肉、雞肉、魚類制品、芝士等^[2-4]中，在一定條件下可引起人體感染并引發(fā)腦膜炎、菌血癥等疾病^[5-6]，且具有多種耐藥性^[7-8]，已逐漸引起世界衛(wèi)生組織的關(guān)注。

科氏葡萄球菌根據(jù)表型特征差異又細(xì)分為兩個亞種：科氏亞種（Staphylococcus cohnii subsp.cohnii，SCC）和解脲亞種（Staphylococcus cohnii subsp.urealyticum，SCU）^[9]。隨著比較基因組學(xué)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析的發(fā)展，SCU被獨立劃分為解脲葡萄球菌（Staphylococcus urealyticus，SU），而科氏葡萄球菌重新細(xì)分為兩個亞種：科氏亞種（SCC）和巴氏亞種（Staphylococcus cohnii subsp. barensis，SCB）^[10]?？剖掀咸亚蚓鸀槲锓N復(fù)合群，其近源菌種SU和亞種SCC、SCB的全基因組序列具有高度相似性，為SCC的特異性快速檢測帶來較大困難。

隨著食品和調(diào)味品行業(yè)的發(fā)展，越來越多的即食型肉制品進(jìn)入消費者市場。生產(chǎn)過程中除常規(guī)優(yōu)勢生產(chǎn)菌株的參與之外，往往也會引入一些污染菌種。從市售的火腿、中式臘腸中曾分離出多種葡萄球菌^[11-13]，經(jīng)生化反應(yīng)鑒定為表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌等條件致病菌。本研究從市售即食肉制品中分離得到一株科氏葡萄球菌HT-26，經(jīng)分析鑒定該菌株屬于科氏葡萄球菌科氏亞種（SCC）。

目前，食品和調(diào)味品生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗局等單位通常按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法進(jìn)行菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌（包括志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）的通用型檢測^[14]，檢測耗時長且缺少對特定品類中特定微生物的檢測和風(fēng)險預(yù)警。本研究基于比較基因組學(xué)篩選得到了科氏葡萄球菌科氏亞種SCC的特異性分子標(biāo)識，并開發(fā)了針對SCC的快速檢測方法，可在4 h內(nèi)完成即食肉制品中SCC的快速檢測，有助于加強(qiáng)肉制品及相關(guān)調(diào)味品生產(chǎn)過程中的微生物安全監(jiān)控。

1 材料和方法

1.1 材料

即食肉制品樣本：購自佛山各大商超。

菌株：HT-26、HT-17、HT-23、HT-11、HT-13、HT-15、HT-24為實驗室保藏菌種；Staphylococcus urealyticus DSM 6718購自DSM菌種保藏中心。

1.2 試劑

平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；SYBR Green Mix：Bio-Rad Laboratories；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：西安天隆科技有限公司；無酶水：上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；引物：安升達(dá)（南京）生命科學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；全自動核酸提取儀 西安天隆科技有限公司；熒光定量PCR儀 Bio-Rad Laboratories。

1.4 方法

1.4.1 樣本收集和菌株分離純化

從佛山各大商超購買不同品牌及類型的即食肉制品共計65個，根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》中的方法對各樣本進(jìn)行菌落培養(yǎng)。逐一挑取培養(yǎng)皿上所有可見菌落并進(jìn)行平板劃線，將劃線后的平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，待形成可見菌落后繼續(xù)挑取1～2個單菌落進(jìn)行平板劃線。共重復(fù)3次平板劃線操作，在第3次劃線平板上各挑取1個單菌落進(jìn)行菌種鑒定、培養(yǎng)和保藏。

1.4.2 菌種測序和鑒定

分別取待鑒定菌株純培養(yǎng)液各10 mL，于12 000 r/min離心5 min，棄上清液后保留菌體沉淀，并將菌體沉淀樣本寄送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行細(xì)菌框架圖測序和分析。利用本地化BLAST對各分離株框架序列進(jìn)行比對分析，完成各分離株的初步菌種鑒定。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育分析和特異序列片段篩選

下載NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中科氏葡萄球菌和解脲葡萄球菌類別下的所有基因組，共計95個，與HT-26基因組序列一起進(jìn)行單拷貝直系同源核心基因分析。利用OrthoFinder 2軟件尋找96個基因組中的同源蛋白組，并提取出核心基因群、輔助基因群和菌株特異基因群序列。根據(jù)單拷貝核心基因中的單核苷酸多態(tài)性，利用MEGA 7軟件構(gòu)建最大似然樹。

對96個基因組中的蛋白編碼序列進(jìn)行TBLASTn比對檢索，篩選科氏葡萄球菌科氏亞種特異的編碼蛋白序列，一致性≥60%，E值＜1e-10。隨后將篩選得到的蛋白序列結(jié)果進(jìn)行TBLASTn在線比對驗證，剔除出現(xiàn)在其他菌種中的同源結(jié)果序列后得到科氏葡萄球菌科氏亞種的特異序列片段。

1.4.4 熒光定量PCR檢測

利用全自動核酸提取儀（GeneRotex 96）及其配套細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（西安天隆科技有限公司，貨號T031（XZHC））提取待檢樣本DNA，具體操作步驟和程序設(shè)置按照試劑盒說明書進(jìn)行，最后將提取的DNA轉(zhuǎn)移至無菌無酶離心管中備用。將提取的DNA與對應(yīng)檢測引物按比例混合后進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，每個檢測設(shè)置3個平行，體系配比：SYBR Green Mix：5μL；上游引物F：0.5μL；下游引物R：0.5μL；無酶水：1μL；DNA模板：3μL。

以96孔板為檢測載體，待體系加裝完畢后進(jìn)行封膜，并通過瞬時離心使孔壁上的溶液流至底部。隨后將待檢測的96孔板放入實時熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，檢測程序：95 ℃ 3 min

95 ℃ 10 s

65 ℃ 30 s循環(huán)40次。

2 結(jié)果與分析

2.1 HT-26菌株的分離鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

從65個即食肉制品樣本中共分離純化得到40株菌株?；蚪M框架圖測序和比對結(jié)果表明31株（75%）屬于芽孢桿菌屬，4株（10%）屬于葡萄球菌屬，其中HT-26初步比對鑒定結(jié)果為科氏葡萄球菌。

對NCBI公共數(shù)據(jù)庫中下載的50個包含HT-26在內(nèi)的科氏葡萄球菌（SC）基因組和46個解脲葡萄球菌（SU）基因組進(jìn)行比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。

由圖1可知，該系統(tǒng)發(fā)育樹中形成了3個主要進(jìn)化簇：SU、SCC、SCB?？蚓€標(biāo)注的為本研究分離純化得到的科氏葡萄球菌HT-26，在系統(tǒng)發(fā)育樹上位于SCC進(jìn)化簇中，表明HT-26屬于科氏葡萄球菌科氏亞種（SCC）。

2.2 SCC的特異性分子標(biāo)識篩選

通過生物信息學(xué)比對分析找到了SCC亞種的特異性基因序列，這些特異性序列保守存在于所有SCC基因組中，但不存在于其他菌種（亞種）基因組中。共篩選得到4段SCC特異性序列（見表1），可作為SCC特異性快速檢測分子標(biāo)識的候選基因片段?；赒1～Q4 4段序列，設(shè)計并合成了5對實時熒光定量PCR引物，引物序列見表2。

利用上述5對引物對HT-26的DNA及陰性對照樣本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表3和圖2。

由表3和圖2可知，引物對P2和P4在HT-26 DNA樣本中的檢測靈敏度低，雖然P5在HT-26 DNA樣本中的檢測靈敏度高，但是其在陰性對照中存在非特異性擴(kuò)增，因此以上3對引物不可用于SCC的快速檢測。P1和P3均可實現(xiàn)陽性樣本的靈敏檢測，且不存在非特異性擴(kuò)增，所以這兩對引物均可作為SCC快速檢測的候選引物。本研究選取檢測靈敏度更高的P3進(jìn)行后續(xù)檢測驗證。

2.4 SCC快速檢測引物的特異性驗證

用2.3中篩選得到的P3分別檢測HT-26、SU DSM 6718、HT-17、HT-23、HT-11、HT-13、HT-15、HT-24和陰性對照的過夜純培養(yǎng)液核酸提取物，檢測結(jié)果見表4和圖3，僅HT-26出現(xiàn)擴(kuò)增曲線和Ct值，其他非SCC菌均無檢出，表明P3具有良好的SCC特異性，可用于SCC的快速檢測。

2.5 SCC快速檢測引物的檢測限

對HT-26純培養(yǎng)菌液進(jìn)行十倍梯度稀釋并提取DNA作為檢測模板，利用P3進(jìn)行qRT-PCR檢測。各樣本菌液濃度和檢測Ct值見表5和圖4中A，檢測結(jié)果表明P3可有效檢測到27 CFU/mL及以上菌液濃度樣本，且Ct值與菌液濃度間存在較好的線性關(guān)系，R²＞0.99（見圖4中B），表明P3在SCC快速檢測中效果穩(wěn)定，最低檢測限可達(dá)27 CFU/mL。

2.6 即食肉制品中SCC的快速檢測

為驗證P3是否能夠在即食肉制品這類具有復(fù)雜背景干擾的樣本中實現(xiàn)SCC的準(zhǔn)確檢測，本研究將HT-26純培養(yǎng)稀釋液反添加于無菌即食肉制品均質(zhì)中并進(jìn)行平板菌落計數(shù)和qRT-PCR檢測，以無菌即食肉制品為陰性對照。平板菌落計數(shù)結(jié)果顯示即食肉制品中HT-26反添加后菌液濃度為115 CFU/g，對該陽性樣本進(jìn)行3次獨立重復(fù)取樣和qRT-PCR實驗，3次檢測均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線（見圖5），平均Ct值為33.70，SD=0.198，C.V.=0.59%，同時陰性對照樣本中無擴(kuò)增。以上結(jié)果表明，特異性引物P3可實現(xiàn)即食肉制品樣本中SCC的快速穩(wěn)定檢測，最低檢測限為115 CFU/g。

3 結(jié)論

本研究從65個市售即食肉制品樣本中分離得到一株科氏葡萄球菌并命名為HT-26，經(jīng)基因組測序和系統(tǒng)發(fā)育分析確定HT-26屬于科氏葡萄球菌科氏亞種（SCC）。通過生物信息學(xué)比對分析找到了4個SCC特異性序列片段，并設(shè)計和篩選出了一對可用于SCC特異性快速檢測的qRT-PCR引物（F：5′-GATGCTCC-AGGGGAAGAGTT-3′；R：5′-ACTTCTTCTGCGTCG-TTTTTGT-3′）。該對引物在SCC純菌培養(yǎng)液中最低可檢測到27 CFU/mL菌液濃度樣本，在即食肉制品中最低檢測限為115 CFU/g，且可在4 h內(nèi)完成檢測，所需時間僅為傳統(tǒng)培養(yǎng)法（48 h）的8%，有助于高效監(jiān)控肉制品生產(chǎn)過程中各環(huán)節(jié)、物料、環(huán)境、人員等的SCC污染風(fēng)險，加強(qiáng)食品安全檢測和監(jiān)督，保障產(chǎn)品安全。

除即食肉制品外，本研究開發(fā)的SCC快速特異性qRT-PCR檢測引物也可應(yīng)用于其他食品相關(guān)產(chǎn)品和場景。近幾年，國內(nèi)學(xué)者從豬、鴨、雞、貂等不同畜禽源中均分離得到科氏葡萄球菌^[15-20]，除貂以外，豬、鴨和雞均為日常肉源，源頭污染可能會引發(fā)科氏葡萄球菌的食源性感染。因此，本研究成果可應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖場，在幫助確認(rèn)病體禽畜微生物感染源的同時也可有效監(jiān)控食用肉源的微生物安全風(fēng)險，從源頭上降低科氏葡萄球菌的食品污染風(fēng)險。同時，隨著健康消費需求的升級，調(diào)味品行業(yè)也在不斷推陳出新。畜產(chǎn)動物風(fēng)味天然濃縮提取物在逐漸替代化學(xué)合成物，多類復(fù)合調(diào)味醬中直接添加肉顆粒以增加風(fēng)味和營養(yǎng)，魚肉熬制的魚露、魚醬等調(diào)味品也為消費者提供了更多選擇。此外，日漸火熱的預(yù)制菜行業(yè)也離不開禽畜類肉制品。因此，當(dāng)今與禽畜漁業(yè)聯(lián)系更為緊密的調(diào)味品行業(yè)和新興預(yù)制菜行業(yè)也可將本研究成果應(yīng)用于相關(guān)原料、生產(chǎn)環(huán)境及產(chǎn)品中的科氏葡萄球菌風(fēng)險監(jiān)控。

不同品類待測樣本的組分背景差異可能會對擴(kuò)增引物產(chǎn)生干擾，因此當(dāng)本研究所述的檢測引物不適用于某些待檢樣本時，亦可通過本研究所述的4個科氏葡萄球菌科氏亞種特異性片段篩選其他引物序列。

綜上所述，本研究通過比較基因組學(xué)分析和實驗驗證，篩選得到了科氏葡萄球菌科氏亞種的特異性檢測分子標(biāo)識，為食品和調(diào)味品行業(yè)中該風(fēng)險菌種的快速特異性檢測提供了可選方法和參考，有助于進(jìn)一步加強(qiáng)微生物風(fēng)險把控，保障食品安全。

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