高效降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選及其在臘肉中的應用

羅皓 付偉陽 曹敏 孫在興 何昌偉 李玉鋒

摘要：從四川傳統(tǒng)臘肉中分離出14株乳酸菌菌株，其中7株可高效降解亞硝酸鹽；對比其發(fā)酵特性，選取TrLb-4為目標菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定該菌株為短乳桿菌；通過分析接種短乳桿菌后臘肉的pH值、過氧化值、TBARS值、亞硝酸鹽殘留量、揮發(fā)性風味物質組成，探究其對臘肉品質和安全性的影響。結果表明，接種短乳桿菌后臘肉的pH值有所降低；試驗組的亞硝酸鹽殘留量顯著減少，僅為7%（P<0.05）；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析結果顯示：試驗組共檢出53種風味物質，與對照組主體風味成分存在差異，醛類物質占比降低，醇類、酯類和酮類物質占比有所增加。綜合分析可得，菌株TrLb-4可以有效降解亞硝酸鹽，抑制臘肉的脂肪氧化，促進特征風味物質的產(chǎn)生，對改善臘肉的品質、提高臘肉的食用安全性有顯著作用。

關鍵詞：臘肉；亞硝酸鹽；乳酸菌；風味物質

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1000-9973（2024）06-0091-06

Screening of Lactic Acid Bacteria for Efficient Degradation of

Nitrite and Their Application in Bacon

LUO Hao， FU Wei-yang， CAO Min， SUN Zai-xing， HE Chang-wei， LI Yu-feng^*

（School of Food and Bioengineering， Xihua University， Chengdu 610039， China）

Abstract： Fourteen strains of lactic acid bacteria are isolated from traditional Sichuan bacon， among which， 7 strains can efficiently degrade nitrite. Through comparing their fermentation characteristics， TrLb-4 is selected as the target strain， which is identified as Lactobacillus brevis by 16S rDNA. By analyzing the pH value， peroxide value， TBARS value， residual amount of nitrite and volatile flavor substance composition of bacon after inoculation with Lactobacillus brevis， its effects on the quality and safety of bacon are explored. The results show that the pH value of bacon decreases after inoculation with Lactobacillus brevis. The residual amount of nitrite in the experimental group significantly decreases， which is only 7% （P<0.05）. The analysis results of gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） show that a total of 53 flavor substances are detected in the experimental group， which are different from the main flavor components in the control group.The proportion of aldehydes decreases， while the proportion of alcohols， esters and ketones increases. Through comprehensive analysis， it can be concluded that strain TrLb-4 can effectively degrade nitrite， inhibit fat oxidation of bacon， and promote the production of characteristic flavor substances， which has a significant effect on improving the quality and edible safety of bacon.

Key words： bacon; nitrite; lactic acid bacteria; flavor substances

收稿日期：2024-01-12

基金項目：四川省科技廳重大項目成果轉化（17NZZH0026）

作者簡介：羅皓（1998—），男，碩士研究生，研究方向：食品科學。

*通信作者：李玉鋒（1965—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術。

四川臘肉作為傳統(tǒng)腌制類制品，主要以滋味咸香、色澤鮮亮為特點。為了提升臘肉的品質，多采用工業(yè)化生產(chǎn)，亞硝酸鹽作為工業(yè)化生產(chǎn)常用的食品添加劑，可以在腌制過程中促進脂質氧化，提高醛類物質的積累，從而帶來特有的腌制風味；同時可以很好地抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長^[1]。然而長期攝入亞硝酸鹽存在安全隱患，甚至會引發(fā)癌癥^[2]。由于亞硝酸鹽在肉制品發(fā)酵中作用較大，目前難以被替代。因此，控制臘肉中亞硝酸鹽的殘留量十分重要。

目前降解亞硝酸鹽的方法主要分為3種：物理降解法、化學降解法、生物降解法。研究指出，乳酸菌接種發(fā)酵可以有效降低泡菜中的亞硝酸鹽含量^[3]。張慶芳等^[4]研究表明，亞硝酸鹽的降解分為酶降解和酸降解兩個階段，在pH高于4.5時，主要以酶降解為主，當pH降低到4.0以下主要以酸降解為主；乳酸菌可以將碳水化合物分解成乳酸，降低pH，在發(fā)酵過程中構建酸性環(huán)境，抑制食品腐敗和致病微生物生長的同時，促進亞硝酸鹽的降解。葛芮瑄等^[5]研究表明，乳酸菌利用糖類分解成乳酸的同時伴隨著乙酸、丁酸、3-羥基-2-丁酮等小分子風味物質的形成，在抑制腐敗、降解亞硝酸鹽的同時賦予了風味。楊慧軒等^[6]指出不同乳酸菌之間的合理組合會提高產(chǎn)品質量和抑菌效果?？梢?，將乳酸菌發(fā)酵運用到肉制品加工中，可以起到改善產(chǎn)品風味、抑制氧化酸敗、降解亞硝酸鹽和生物胺、延長產(chǎn)品保質期等作用^[7]。因此，本研究旨在篩選出發(fā)酵特性優(yōu)良且具有工業(yè)發(fā)酵潛力的乳酸菌，為后續(xù)臘肉生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設備

1.1.1 材料試劑

臘肉：采集自四川成都、內(nèi)江傳統(tǒng)農(nóng)家臘肉樣品4份。

對氨基苯磺酸、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、吐溫80、牛肉浸粉、亞硝酸鈉：福晨（天津）化學試劑有限公司；氫氧化鈉、硼砂、亞鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、MnSO₄·H₂O：天津市津東天正精細化學試劑廠；所有試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設備

BSA423S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；BPG-9070A精密鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；GI54DWS全自動高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；GCMS-QP2020 NX氣相色譜-質譜（GC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 農(nóng)家臘肉中乳酸菌的分離與純化

稱取臘肉樣品各10 g，在無菌條件下加入90 mL無菌生理鹽水，使用破壁機將其打碎。將上述樣液分別加入MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h^[8]。

取上述發(fā)酵液樣品，稀釋3個梯度后，取0.2 mL涂布于添加3% 碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h^[9]，挑取具有溶鈣圈的單一菌落，在MRS培養(yǎng)基中重復分離純化培養(yǎng)3次，得到純化后的菌株，于-20 ℃甘油中保存^[10]。

1.2.2 降解亞硝酸鹽菌株的初篩

亞硝酸鹽培養(yǎng)基：配制150 mg/L的亞硝酸鹽溶液，按照1∶9的比例加入已滅菌的MRS培養(yǎng)基中混勻^[11]。

將各菌株按1%的接種量接種于10 mL亞硝酸鹽培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，采用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽殘留量^[12]。

1.2.3 菌株生長曲線的測定

將活化菌株以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，每隔2 h測定培養(yǎng)液的OD_{600 nm}值。

1.2.4 發(fā)酵液pH值的測定

將活化菌株以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h^[13]，每隔4 h測定發(fā)酵液的OD_{600 nm}值。

1.2.5 菌株耐鹽試驗

將活化菌株按照2%的接種量分別添加于含有6.5%、10% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中^[14]，于37 ℃培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液的OD_{600 nm}值。

1.2.6 乳酸菌分子生物學鑒定

采用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，作為模板，參考劉建利等^[15]的方法，PCR擴增16S rDNA基因序列，并委托上海凌恩生物科技有限公司進行測序。將測序序列提交至美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性對比鑒定。

1.2.7 制作工藝流程

材料：豬肉、乳酸菌、亞硝酸鈉、食鹽；組別設置：添加菌液組為試驗組，傳統(tǒng)發(fā)酵組為對照組。

原料肉處理：選擇新鮮的豬五花肉，切割成規(guī)則的形狀（長約20 cm，寬為5～7 cm），使用白酒洗凈。

輔料添加：加入輔料并充分揉搓，對照組和試驗組均采用傳統(tǒng)工藝，試驗組菌液采用注射器注射進肌肉。

腌制：將處理好的肉塊在腌缸中腌制72 h。

風干、發(fā)酵熟成：按照烘干加工條件，將肉塊置于烘干機內(nèi)，以50 ℃烘制32 h至肉塊呈半干狀態(tài)后移入室外懸掛、通風，使之繼續(xù)發(fā)酵成熟。

1.2.8 水分含量的測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》方法測定樣品中水分含量。

1.2.9 pH值的測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》方法，選取臘肉樣品中瘦肉部分測定pH值^[16]。

1.2.10 過氧化值的測定

參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》方法測定樣品的過氧化值。

1.2.11 TBARS值的測定

參照GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》，采用分光光度法測定樣品中TBARS值。

1.2.12 亞硝酸鹽殘留量的測定

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》方法測定樣品中亞硝酸鹽殘留量。

1.2.13 臘肉揮發(fā)性風味物質的測定

精確稱取肥瘦均勻的臘肉樣品5 g于頂空瓶中，于60 ℃水浴加熱40 min、吸附30 min、解吸5 min。

參考王衛(wèi)等^[17]的方法并做一定修改，氣相色譜（GC）條件：采用HP-5MS毛細管柱（30.0μm×250μm×0.25μm），載氣為He，恒定流速為1 mL/min，進樣口溫度為220 ℃，以不分流方式進樣。柱箱采用程序升溫，初始溫度50 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫到110 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫到250 ℃，保持5 min。

質譜（MS）條件：色譜、質譜的接口溫度為250 ℃，質譜電子方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，溶劑延遲2 min。電子倍增器電壓1 600 V，數(shù)據(jù)以30～300 amu的掃描范圍進行收集。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 9.5繪制柱狀圖、折線圖和雷達圖，使用SPSS 25.0進行顯著性檢驗，當P＜0.05時被認為具有統(tǒng)計學意義，結果以平均值±標準差（x±s）表示。

2 結果與分析

2.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離純化

從四川不同地區(qū)采集的4份臘肉樣品中共分離出18株革蘭氏染色陽性疑似菌落，菌落呈乳白色或黃色，菌落直徑在1～5 mm。其中14株菌落表面光滑濕潤，邊緣較規(guī)則，具有典型的乳酸菌特征^[18]，其余4株菌落結構差異較大且無溶鈣圈，故初篩出14株乳酸菌^[9]，見圖1。

由圖1可知，14株菌株均具有亞硝酸鹽降解能力，其中2，3，4，7，8，9，10號菌株的降解能力較強，其發(fā)酵液中亞硝酸鹽殘留量均低于5%，故選取這7株菌株進行后續(xù)試驗。

2.2 高效降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選鑒定

2.2.1 菌株發(fā)酵特性的測定

由圖2可知，對比發(fā)酵液的pH值，2，4，10號菌株的產(chǎn)酸能力更突出，發(fā)酵液的pH值較低，能在發(fā)酵過程中提供較好的酸性環(huán)境，抑制雜菌的生長，增加了菌株用于發(fā)酵的可能性^[10]。

由圖3可知，4號和2號菌株的總體耐受力較強，在6.5%和10%鹽濃度下4號菌株的耐受力均優(yōu)于2號菌株，10號菌株在10%鹽濃度下耐受力最強。如今臘肉多為低鹽臘肉^[11]，鹽分含量在6%以下，因此4號菌株更具有優(yōu)勢。

由圖4可知，對比7株具有高效降解亞硝酸鹽能力的菌株的產(chǎn)酸能力、生長曲線和鹽耐性指標，最終篩選出生長發(fā)酵特性最優(yōu)的4號菌株為目標菌株，將其編號為TrLb-4。

2.2.2 高效降解亞硝酸鹽菌株分子生物學鑒定

采用分子生物學技術對TrLb-4菌株進行分子生物學鑒定，提取其DNA，進行16S rDNA基因序列PCR擴增，得到測序結果后在NCBI進行BLAST同源性序列比對，測序結果顯示4號菌株為短乳桿菌，其生長發(fā)育樹見圖5。

2.3 高效降解亞硝酸鹽短乳桿菌發(fā)酵應用

2.3.1 短乳桿菌發(fā)酵對臘肉理化性質的影響

由表1可知，試驗組與對照組臘肉的含水量無顯著差異。短乳桿菌TrLb-4發(fā)酵過程中對水分含量的影響并不突出，對臘肉的保存和貨架期的影響不明顯；試驗組樣品pH值相比對照組有所降低（P<0.05），酸性環(huán)境可以抑制臘肉中雜菌的生長及輔助降解亞硝酸鹽，對提高臘肉的安全性具有積極作用^[19]，同時試驗組的POV值與TBARS值均顯著低于對照組（P<0.05），表明短乳桿菌TrLb-4發(fā)酵可以顯著減緩臘肉中脂肪的氧化酸敗^[20]，理論上可以減少不良氣味的產(chǎn)生，提升臘肉的品質。

發(fā)酵完成后，試驗組亞硝酸鹽殘留量顯著低于對照組（P<0.05）。在試驗中，為了模擬工廠臘肉生產(chǎn)條件，腌制過程中添加了15 mg/kg亞硝酸鹽，在臘肉自然發(fā)酵過程中，亞硝酸鹽分解速率緩慢，導致其大量殘留于臘肉中，而試驗組發(fā)酵后的亞硝酸鹽殘留量大幅降低，表明短乳桿菌TrLb-4可以高效降解臘肉中亞硝酸鹽，提高臘肉的安全性。

2.3.2 短乳桿菌發(fā)酵對臘肉揮發(fā)性風味物質的影響

臘肉中揮發(fā)性風味物質含量見表2。

兩組之間的主體風味物質存在差異，試驗組共檢測出揮發(fā)性風味物質53種，對照組共檢測出揮發(fā)性風味物質56種，各揮發(fā)性風味物質含量對比見圖6。

對照組風味物質主要為醛類物質，其占比達到56.24%，試驗組中醛類物質含量為41.29%，相比對照組有所下降。醛類物質是發(fā)酵肉制品中的主要特征風味物質^[21]，其風味閾值較低，多由脂肪氧化分解產(chǎn)生，對臘肉的風味有重要影響，但含量較多會生成油膩和酸敗的氣味^[22]。

醇類物質主要來源于脂質的降解和氧化^[23]，通常帶有果香、花香，閾值較高，對臘肉風味的整體影響較小，在發(fā)酵后期，醇類物質會與有機酸形成閾值較低、對風味貢獻較大的酯類物質^[24-25]。試驗組中醇類含量達到25.04%，其中桉葉油醇和芳樟醇含量較高，這兩類物質具有一定的抑菌作用^[26]，同時對臘肉的風味形成也有貢獻；對照組中酯類物質含量為11.14%，試驗組中酯類物質含量有所提高，占比為14.79%，其中檢出發(fā)酵肉制品特征風味物質丁酸乙酯^[27]。

酮類物質主要由發(fā)酵過程中不飽和脂肪氧化及氨基酸降解產(chǎn)生，含量相對較低，對臘肉風味起到增強作用^[28]；同樣，烴類物質也可以提供特征風味，對臘肉的風味具有一定影響。試驗組相比于對照組，酮類物質的種類和含量都有所增加；烴類物質含量差異較小，但種類不盡相同，其中具有刺激性氣味的物質含量降低。

總體而言，試驗組樣品揮發(fā)性風味成分更豐富，這是由于短乳桿菌的發(fā)酵促進了蛋白質、脂肪和糖類成分等的分解^[8]，進而促進風味物質的產(chǎn)生，同時抑制脂肪酸敗氧化，有效改善因醛類物質過多產(chǎn)生的負面影響。酯類、酮類和烴類物質的形成也進一步增強和改善了臘肉的風味^[5]。

3 結論

本研究從四川傳統(tǒng)臘肉中分離出14株乳酸菌，對比其亞硝酸鹽降解能力、鹽耐受性、產(chǎn)酸能力等發(fā)酵特性，最終篩選出目標菌TrLb-4，經(jīng)16S rDNA序列同源性分析，該菌株為短乳桿菌。發(fā)酵后，兩組臘肉樣品含水量無顯著差異；試驗組的pH值、過氧化值、TBARS值均有所降低（P<0.05），亞硝酸鹽殘留量顯著低于對照組（P<0.01）；全二維GC-MS分析結果顯示：試驗組中共檢測出53種揮發(fā)性風味物質，其中醛類物質占比減少，減輕了因大量醛類物質累積而帶來的油脂酸敗味；醇類、酯類和酮類物質占比增加，臘肉的特征風味得到增強；產(chǎn)生不悅氣味的烴類物質減少，風味物質組成更豐富。綜上所述，短乳桿菌TrLb-4可顯著降低臘肉中亞硝酸鹽殘留量，減緩脂肪的酸敗氧化，促進醇類、酯類和酮類物質產(chǎn)生，改善臘肉的風味，其在提高臘肉安全性的同時改善了臘肉的品質，可作為發(fā)酵臘肉的功能菌株應用到臘肉工業(yè)化生產(chǎn)中。

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