蒸汽爆破對杜仲葉水提液活性成分、抗氧化活性及香氣組分的影響

摘要：【目的】通過分析蒸汽爆破（汽爆）后杜仲成熟葉片活性成分、抗氧化活性和香氣組分變化，探究汽爆輔助制備杜仲葉茶的可行性?！痉椒ā繉Ρ葍蓚€杜仲品種‘華仲8號’和‘華仲12號’成熟葉片的揉捻和不揉捻處理，采用2因素3水平完全試驗設(shè)計，以葉片總黃酮、多酚和多糖含量確定最佳汽爆參數(shù)；采用紫外分光法和高效液相色譜法（HPLC）測定葉片活性成分，測定DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）和ABTS[2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]自由基清除率并分析葉片抗氧化活性與活性成分間的相關(guān)性；采用頂空固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPME/GC-MS）測定三硝基苯香氣組分。【結(jié)果】依據(jù)總黃酮等含量確定最佳汽爆參數(shù)為：蒸汽壓強0.45 MPa，穩(wěn)壓時間300 s。該條件下‘華仲8號’不揉捻和‘華仲12號’揉捻葉片處理總黃酮和多酚含量較對照分別提高10.87和21.51倍，多酚含量較對照分別提高1.14和0.87倍，環(huán)烯醚萜類等6種活性成分含量均極顯著提高（P＜0.01）。其中‘華仲8號’不揉捻和‘華仲12號’揉捻處理葉片的京尼平苷酸較對照分別提高了0.88和1.23倍，綠原酸較對照分別提高0.45和0.31倍，沒食子酸甲酯較對照分別提高10.41和8.06倍。汽爆后杜仲葉抗氧化活性均極顯著提高，‘華仲8號’不揉捻強于‘華仲12號’揉捻處理；IC₅₀值與京尼平苷酸、車葉草苷、綠原酸等含量均呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。葉片揮發(fā)性化合物中產(chǎn)生了苯甲醇和β-環(huán)檸檬醛等芳香物質(zhì)，具有花香氣味的酮類占比最高，相對含量提高了1.93～3.38倍?！窘Y(jié)論】蒸汽爆破處理顯著提高了杜仲成熟葉水提液的活性成分水溶率和抗氧化活性，其芳香類物質(zhì)種類增加且含量提高。鑒于目前國內(nèi)綠葉杜仲資源量遠高于紅葉杜仲，本研究所提出的杜仲成熟葉片萎凋后直接蒸汽爆破簡化了制茶工藝步驟，有效降低了綠葉杜仲茶生產(chǎn)成本，為規(guī)?；亩胖偃~加工利用提供了新思路。

關(guān)鍵詞：杜仲；活性成分；抗氧化；香氣組分；蒸汽爆破

中圖分類號：TS272；TS201 文獻標志碼：A開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

文章編號：1000-2006（2024）03-0245-12

Steam explosion impact on the active ingredients， antioxidant activity and aroma components of the aqueous extract from Eucommia ulmoides leaves

ZHOU Yunfei^1，2，DU Qingxin^1，3，WANG Zhiyong^1，3， WANG Lu^1，3， WANG Yan^1，3， LIU Panfeng^1，3， SUN Zhiqiang^1，3*

（1. Research Institute of Non-timber Forestry， Chinese Academy of Forestry， Zhengzhou 450003， China; 2. College of Forestry and Grassland， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China; 3. Key Laboratory of Non-timber Forest Germplasm Enhancement amp; Utilization of State Forestry and Grassland Administration， Eucommia Engineering Research Center of State Forestry and Grassland Administration， Zhengzhou 450003， China）

Abstract：【Objective】 To evaluate the feasibility of manufacturing Eucommia ulmoides leaf tea via steam explosion （SE）， the changes of active ingredients， antioxidant activity and aroma components were compared between tea produced using E. ulmoides mature leaves with and without an SE. 【Method】Treatments based on physically rolling or not rolling the leaves were applied using E. ulmoides ‘Huazhong 8’ and ‘Huazhong 12’ mature leaves. A two-factor， three-level complete experimental design was used to determine the optimal SE parameters according to the contents of total flavonoids， polyphenols and polysaccharides， which were determined by UV spectroscopy. The active ingredients were detected by high-performance liquid chromatography （HPLC）. The antioxidant activity of the samples was assessed using 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and 2，2′-diazo-di（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diamine salt （ABTS） radical scavenging assays. Additionally， the correlation between the active ingredients of the samples and antioxidant activity was analyzed. The aroma components were determined by headspace solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry （HS-SPME/GC-MS）. 【Result】 The optimal SE parameters were a pressure of 0.45 MPa and retention time of 300 s. Under these conditions， the total flavonoid and polyphenol contents of ‘Huazhong 8’ and ‘Huazhong 12’ were increased by 10.87 and 21.51， and 1.14 and 0.87-fold compared with the control， respectively. The contents of six active ingredients increased significantly （P lt; 0.01）， with chlorogenic acid and gallic acid increased by 31.31% and 30.72%， respectively and methyl ester increased by 10.41 and 8.06-fold in non-twisted ‘Huazhong 8’ and twisted ‘Huazhong 12’ compared with the control， respectively. Overall， the antioxidant activity of mature E. ulmoides leaves was enhanced significantly with an SE， in which the antioxidant activity of non-twisted ‘Huazhong 8’ was greater than that of twisted ‘Huazhong 12’. The half-maximal inhibitory concentration （IC₅₀） was negatively correlated with the contents of kynurenine， carnoside， and chlorogenic acid （Plt;0.05）. Aromatic substances such as benzyl alcohol and β-cyclocitral were generated from the volatile compounds. 【Conclusion】An SE treatment significantly improved the water solubility and antioxidant activity of the active ingredients of the aqueous extract of mature E. ulmoides leaves， with an increase in the type and content of aromatic substances. Because the resource availability of green-leaved E. ulmoides is much greater than that of red-leaved E. ulmoides at present， our results suggest that mature E. ulmoides leaves without a physical twisting treatment prior to an SE would result in a simplified tea-making process and effectively reduce the production cost of E. ulmoides green leaf tea， providing novel ideas for the large-scale processing and utilization of E. ulmoides leaves.

Keywords：Eucommia ulmoides; active ingredients; antioxidant; aroma components; steam explosion

杜仲（Eucommia ulmoides）為杜仲科杜仲屬（Eucommia）多年生落葉喬木，雌雄異株，是我國傳統(tǒng)中藥材^[1]，其葉與皮有效成分基本一致，藥理作用相近^[2]，2005版中國藥典將杜仲葉收錄其中。杜仲葉片新近被列入“藥食同源”類原料，為有效利用杜仲資源、拓展杜仲葉片高附加值的綜合利用起到了推動作用^[3]。杜仲葉富含環(huán)烯醚萜類、木脂素類、苯丙素類、黃酮類、多糖類化合物，以及多種氨基酸、維生素和微量元素等活性成分^[3]，這些活性成分具有降血壓、降血脂、抗氧化、保護心血管系統(tǒng)、消炎、抗癌、保護神經(jīng)細胞、保護腸道系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等諸多保健功效^[4-5]。作為一種新的食品原料，杜仲葉常被制作成杜仲茶、杜仲發(fā)酵醋、杜仲膠囊、杜仲飲品和杜仲飼料等。其中，杜仲茶是發(fā)展最早且產(chǎn)品最多的一種杜仲食品，是目前研究的熱點^[6]。傳統(tǒng)意義上的杜仲茶是以杜仲葉片或雄花為原料，經(jīng)萎凋、揉捻、日曬、發(fā)酵、干燥等一系列工藝制成的保健飲品^[7]。

目前關(guān)于杜仲茶制作工藝的探索較多，例如：將杜仲嫩葉與傳統(tǒng)綠茶質(zhì)量比3∶7混合可以改善口感^[8]；對杜仲成熟葉片接種乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）發(fā)酵4 d時，總黃酮、總酚和綠原酸含量最高，抗氧化活性顯著增強^[9]；將杜仲葉片接種冠突散囊菌（Eurotium cristatum 2650），綠原酸含量為0.478 mg/g，且金花茂盛，顆粒飽滿^[10]；對杜仲葉進行殺青條件為125 ℃、3 min時，杜仲茶關(guān)鍵成分指標最佳^[11]；復(fù)火杜仲茶發(fā)現(xiàn)，溫度為110 ℃、時間 1～2 h時最有利于改善其湯色和口感^[12]?？傊?，杜仲茶通常的加工步驟是殺青→揉捻→揉切→烘干，必要時增加一個類似紅茶和烏龍茶的發(fā)酵步驟，在這一過程中，茶葉的活性成分和生物活性會發(fā)生不同程度的改變。其中，揉捻是傳統(tǒng)制茶的重要工序，通過撕扯、擠壓、摩擦等起到打破葉肉細胞原有結(jié)構(gòu)的作用^[13]，該過程促進了糖類物質(zhì)向糖胺化合物轉(zhuǎn)化，可提高總糖含量，催化多酚類物質(zhì)發(fā)生酶促氧化反應(yīng)，加快脂質(zhì)氧化以及類胡蘿卜素降解^[13]，亦是杜仲茶特殊風味形成的重要步驟。為提高杜仲茶的活性成分含量，優(yōu)化其感官品質(zhì)，需探索揉捻的力度、形狀、溫度、濕度、含氧量和時長，同時避免重度揉捻造成氨基酸、葉綠素、多酚類和黃酮類化合物流失^[14]。成形后可以進行渥堆發(fā)酵，促進酚類物質(zhì)氧化、揮發(fā)性化合物分解重組，渥堆時堆心較堆面的反應(yīng)更強烈，葉堆內(nèi)部容易產(chǎn)生“熟老菱氣”影響杜仲茶品質(zhì)，應(yīng)注意溫度上升時及時翻堆，使葉片均勻反應(yīng)，葉色由綠色轉(zhuǎn)暗褐色則渥堆完成^[15]。然而，傳統(tǒng)制茶工藝對技術(shù)要求較高，實際生產(chǎn)多是憑感官經(jīng)驗，可能導(dǎo)致茶品質(zhì)不穩(wěn)定，同時，杜仲葉片本身口感較澀且茶湯中存在著難以去除的青草氣，也限制著杜仲茶品質(zhì)和價值，而提高茶湯口感的關(guān)鍵在于解決杜仲葉中活性成分溶出率低的問題^[16-17]。

為提高杜仲葉水提液活性成分的溶出率，前人采用了超微粉碎物理破壁技術(shù)，通過適度打破其原本緊密結(jié)合的細胞壁，促使杜仲葉有效成分釋放^[18]。蒸汽爆破（汽爆）是近年來廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化、農(nóng)作物秸稈類再利用、膳食纖維改性等領(lǐng)域的一項技術(shù)^[19-20]。有學者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)汽爆后，松針中黃酮類化合物的提取率是未處理樣品的2.54倍^[21]；汽爆后杜仲皮中黃酮和綠原酸的醇提物得率較未處理樣品提高了1.65和2.30倍^[22]；杜仲葉片總黃酮得率提高了4倍^[23]，綠原酸產(chǎn)率提高62%，提取效率提高423%^[24]。蒸汽爆破條件可控，生產(chǎn)過程中僅使用水，環(huán)境友好、成本低廉、生產(chǎn)效率極高。然而，有關(guān)杜仲葉片汽爆后抗氧化活性及香氣組分的研究極少，鮮見對汽爆在杜仲茶的生產(chǎn)制作應(yīng)用上的報道。

采集杜仲成熟葉片進行揉捻和不揉捻兩種工藝處理，以葉片的多酚、總黃酮和多糖含量為依據(jù)確定蒸汽爆破最佳參數(shù)；采用高效液相色譜法（HPLC）測定最佳參數(shù)下不同處理的葉片7種活性成分含量，同時，結(jié)合葉片的DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）和ABTS[2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]自由基清除能力分析其抗氧化活性，采用頂空固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPME/GC-MS）測定分析和對比汽爆前后葉揮發(fā)性物質(zhì)種類及其含量，以期為蒸汽爆破輔助制作杜仲茶提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料：試驗材料為2021年6—7月在中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究所孟州試驗基地（112°42′58″E，34°51′38″N）采集的杜仲品種‘華仲8號’（E. ulmoides ‘Huazhong 8’）和‘華仲12號’（E. ulmoides ‘Huazhong 12’）成熟葉片。這兩個杜仲品種為中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究所選育的兩個高產(chǎn)杜仲良種，其中，‘華仲8號’葉片呈綠色，具有結(jié)果早、產(chǎn)量高，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性強的特點；‘華仲12號’葉片呈紫紅色或紅色，是葉片變異型品種，其葉片較其他綠葉杜仲的更厚，黃酮類物質(zhì)含量較高^[25-26]。

試劑：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），車葉草苷，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；ABTS [2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]，上海麥克林生化科技有限公司；蘆丁、沒食子酸、京尼平苷酸、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素、松脂醇二葡萄糖苷、沒食子酸甲酯均購自索萊寶科技有限公司，純度 ≥ 98%；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS-80GB蒸汽爆破試驗臺，鶴壁正道生物能源有限公司；多功能煮茶器，小熊電器股份有限公司；ACQUITY Arc 型高效液相色譜儀（配置2998 PDA 型二極管陣列檢測器），美國Waters公司；6890N-G5795B氣相色譜儀質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；HT-300 BQ 超聲波清洗機，濟寧天華超聲電子儀器有限公司；5430 R 高速冷凍離心機，德國 Eppendorf 公司；XS204 萬分之一電子天平，梅特勒-托利多上海儀器有限公司；Milli-Q Integral 超純水機，美國 Merck Millipore公司。

1.3 蒸汽爆破處理及樣品溶液制備

采集的葉片萎凋至形成自然蜷曲后，分作2份：一份輕度揉捻3～5 min，制做形為圓筒狀；另一份不作處理。得到‘華仲8號’揉捻（A1）和不揉捻（A2），及‘華仲12號’揉捻（B1）和不揉捻（B2），共4個處理的樣品。將處理后的葉片55 ℃烘干至質(zhì)量恒定，進行蒸汽爆破處理。CK1和CK2分別為不揉捻且不作汽爆處理的‘華仲8號’和‘華仲12號’杜仲葉片。

按照表1參數(shù)設(shè)置采用2因素3水平完全試驗設(shè)計進行汽爆處理。杜仲葉片汽爆處理的蒸汽壓強選擇0.30、0.45、0.60 MPa，穩(wěn)壓時間選擇100、200、300 s。汽爆前12～24 h，將杜仲葉均勻噴濕，密封保存使原料充分浸潤至含水率為25%～30%。汽爆后的葉片適當切碎后，于55 ℃烘干至質(zhì)量恒定，隨后蒸汽熏蒸30～40 s回軟，制成茶餅，再次于55 ℃烘干至恒定質(zhì)量，得到杜仲茶成品。

稱?。?.00±0.02）g杜仲茶成品，放入裝有500 mL超純水的多功能煮茶器中，加熱水溫至100 ℃后持續(xù)3 min，過濾，待其冷卻至室溫，離心取上清液。

1.4 總黃酮、總多酚和多糖含量的測定

1）總黃酮含量。參照肖作為等^[27]的方法，精確稱取蘆丁標準品18 mg置于燒杯中，用60%乙醇溶解后定容至20 mL容量瓶中，搖勻，即可得0.9 mg/mL的蘆丁標準溶液。精確吸取蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至相同體積。分別取1 mL于試管中各加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL搖勻，放置6 min后，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻，再放置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，再用60%乙醇溶液稀釋至20 mL，放置15 min后，510 nm處測定后，吸光度作為縱坐標，濃度作為橫坐標，繪制標準曲線。按蘆丁標準曲線的步驟加入試劑。根據(jù)公式（1）計算杜仲葉水提液中黃酮類化合物的含量。

C₁ =c₁×n₁×V₁/m₁。 （1）

式中：C₁為杜仲葉水提液中黃酮類化合物含量，mg/g；c₁為總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；n₁為稀釋倍數(shù)；V₁為待測杜仲水提液定容后的體積，20 mL;m₁為杜仲茶樣品干質(zhì)量，g。

2）總多酚含量。參照LI等^[28]的方法，精確吸取沒食子酸標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容至相同體積。分別取1.0 mL于試管中各加入0.5 mL福林酚試劑搖勻，放置3～8 min后，加入15%碳酸鈉溶液4.0 mL搖勻，避光放置30 min，765 nm處測定后，吸光度A作為縱坐標，濃度作為橫坐標，繪制標準曲線。按照沒食子酸標準曲線的步驟加入試劑。根據(jù)公式（2）計算杜仲茶中多酚類化合物的含量，結(jié)果以每克杜仲茶干品中總多酚質(zhì)量濃度（mg/g）表示。

C₂ =c₂×n₂×V₂/m₂。（2）

式中：C₂為杜仲葉水提液中多酚類化合物含量，mg/g；c₂為多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；n₂為稀釋倍數(shù)；V₂為待測杜仲水提液定容后的體積，25 mL;m₂為杜仲茶樣品干質(zhì)量，g。

3）多糖含量。參照王黎明等^[29]的方法，精確稱量半乳糖標準品50 mg，在50 mL容量瓶中定容，精確吸取半乳糖標準溶液各0.0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8、2.0 mL于試管中，加蒸餾水稀釋至2.0 mL，樣品中加入4.0 mL質(zhì)量分數(shù)為 0.05%的蒽酮-硫酸試劑，振蕩混勻后置于冰水冷卻，沸水浴5 min，定容至25 mL。使用蒸餾水做空白對照，在675 nm處測定后，吸光度作為縱坐標，濃度作為橫坐標，繪制標準曲線。按照半乳糖標準曲線的步驟加入試劑。根據(jù)公式（3）計算杜仲葉水提液中多糖類化合物的含量。

C₃ =c₃×n₃×V₃/m₃。（3）

式中：C₃為杜仲葉水提液中多糖類化合物含量，mg/g；c₃為多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；n₃為稀釋倍數(shù)；V₃為配制樣品溶液的體積，25 mL；m₃為杜仲茶樣品干質(zhì)量，g。

1.5 7種活性成分含量測定

參照孟益德等^[30]的方法，通過高效液相色譜法同時測定杜仲葉水提液中7種活性成分（京尼平苷酸、車葉草苷、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、松脂醇二葡萄糖苷和綠原酸）含量。HPLC的色譜條件如下：色譜柱采用賽默飛 Syncronis C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；梯度洗脫程序：0～7min，5% 乙腈；7～10 min，5%→17%乙腈；10～25 min，17%乙腈；25～26 min，17%→20%乙腈；26～33 min，20%乙腈；33～34 min，20%→5%乙腈；檢測波長：239 nm（京尼平苷酸，14.5～15.0 min；車葉草苷，31.5～32.2 min）、247 nm（原兒茶酸，13.5～14.0 min）、264 nm（沒食子酸甲酯，16.2～17.0 min）、276 nm（兒茶素，15.5～16.5 min；松脂醇二葡萄糖苷，23.8～24.5 min）、325 nm（綠原酸，14.0～14.5 min）。

將京尼平苷酸、車葉草苷、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、松脂醇二葡萄糖苷和綠原酸7種標準品混合，配制成質(zhì)量濃度梯度為0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L的混合標準工作液，以吸光度為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（x），按上述方法得到HPLC圖。7種活性成分的回歸方程分別為Y₁=9.220 5×10⁵x-7.406 7×10⁵，Y₂=9.605 7×10⁵x-5.892 4×10⁵，Y₃=3.739 2×10⁵ x-1.776 6×10⁵，Y₄=3.899 4×10⁶x-4.064 3×10⁶，Y₅=4.394 7×10⁶x-4.184 9×10⁶，Y₆=3.974 5×10⁵x-2.715 9×10⁵，Y₇=3.227 5×10⁵x-2.828 1×10⁵，標準曲線決定系數(shù)R²均大于0.999。

1.6 抗氧化活性測定

參照肖作為等^[27]的方法，稱取DPPH粉末適量，加入體積分數(shù)75%乙醇稀釋成0.1 mmol/L的DPPH工作液。將待測樣品用蒸餾水稀釋成1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 g/L的樣品溶液，分別取上述溶液各2 mL于試管中，各加入DPPH工作液2 mL，混勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處得到吸光度A_s1；取樣品溶液2 mL，加入75%乙醇2 mL，得到吸光度A_b1；取DPPH工作液2 mL，加入75%乙醇2 mL，得到吸光度A_c1。平行3次，代入公式（4）計算DPPH自由基清除率P_DPPH：

P_DPPH =1-（A_s1-A_b1）A_c1×100%。（4）

參照唐思頡等^[31]的方法，稱取ABTS粉末適量，加入75%乙醇稀釋成7.0 mmol/L的ABTS水溶液，稱取過硫酸鉀粉末適量，加入超純水溶解成2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液，兩者等體積比混合，制備得ABTS工作液，置于4 ℃冰箱，避光保存10～16 h備用。將待測樣品用蒸餾水稀釋成1.3、1.9、2.5、3.1、3.8、4.4、5.0 g/L的樣品溶液，分別取上述溶液各1 mL于試管中，各加入ABTS工作液2 mL，混勻，避光反應(yīng)6 min，于517 nm處得到吸光度A_s2；取樣品溶液2 mL，加入75%乙醇2 mL，得到吸光度A_b2；取ABTS工作液2 mL，加入75%乙醇2 mL，得到吸光度A_c2。平行3次，代入公式（5）計算ABTS自由基清除率P_ABTS：

P_ABTS =1-（A_s2-A_b2）A_c2×100%。（5）

1.7 HS-SPME/GC-MS分析

參照Gay等^[32]的方法，采用頂空固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPME/GC-MS）測定杜仲葉水提液香氣組分。稱取適量樣品于頂空瓶中，加入飽和氯化鈉，壓蓋，置于80 ℃水浴中平衡20 min，再將固相微萃取針扎進頂空中，繼續(xù)放入80 ℃水浴中30 min，250 ℃進樣口解析5 min。儀器方法如下：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫為初溫50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；進樣口溫度為250 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；載氣流速為1.0 mL/min；分流比為不分流；質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，質(zhì)譜為EI源，模式為全掃（m/z）40～600。

1.8 數(shù)據(jù)分析

每個處理作3次重復(fù)，采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)處理和分析，試驗結(jié)果以平均值±標準差（means±SD）表示。其中抗氧化活性以50%的清除率/質(zhì)量濃度（IC₅₀）表示，IC₅₀值越小，代表抗氧化能力越強，反之亦然。采用雙因素方差分析蒸汽壓強和穩(wěn)壓時間對主要活性成分的影響，以及t檢驗比較對照間的差異，并對各指標進行方差齊性檢驗，若P＞0.05，采用最小顯著差異法（LSD）進行多重比較，否則采用Tamhane’s T2法；采用Pearson法進行活性成分和抗氧化活性的相關(guān)性分析。利用Excel 2008和Origin 2021軟件作圖。從http：//www.thegoodscentscompany.com/上查詢香氣閾值及氣味描述，將氣味活度值（OAV）＞1的揮發(fā)性化合物篩選為主要香氣物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 汽爆對杜仲葉水提液中總黃酮、多酚和多糖含量的影響

雙因素方差分析結(jié)果見表2。由表2可知，蒸汽壓強、穩(wěn)壓時間對總黃酮、多酚和多糖的影響均

達極顯著水平（P＜0.01），且兩者之間存在極顯著交互作用（P＜0.01），說明蒸汽爆破過程中蒸汽壓強和穩(wěn)壓時間的改變對杜仲葉水提液活性成分含量的影響起重要作用。t檢驗結(jié)果顯示，兩種杜仲成熟葉片對照處理的總黃酮（t=-30.337，F(xiàn)=3.273，P＜0.001）和多酚（t=-25.773，F(xiàn)=4.589，P＜0.001）含量存在顯著性差異，且‘華仲8號’的含量顯著高于‘華仲12號’；多糖（t=3.881，F(xiàn)=10.214，P=0.056）含量差異不顯著。

蒸汽爆破處理中，除了P₂T₂處理的B1中多酚含量高于P₂T₃處理，P₃T₁處理的A1中總黃酮和多糖含量及B₂中多酚含量高于P₂T₃處理，P₃T₃處理的A2中多糖含量個別高于P₂T₃處理外，其他均以P₂T₃處理為最高（表3）。因此，蒸汽壓強為0.45 MPa，穩(wěn)壓時間為300 s時，最有利于杜仲茶中黃酮類、酚類和多糖類物質(zhì)的溶出。由表3可知，P₂T₃處理中，A2處理的總黃酮含量較對照提高了10.87倍，B1處理的總黃酮含量較對照提高了21.51倍。A2多酚比對照提高了1.14倍；B1比對照提高了0.87倍。多糖含量以B1最高，A2次之。

2.2 杜仲葉水提液中7種活性成分和抗氧化活性分析

2.2.1 活性成分

HPLC法測定結(jié)果如表4所示。A2的7種活性成分含量均顯著高于A1，發(fā)現(xiàn)除原兒茶酸外， A1和A2的其他6種成分含量均極顯著高于CK1（P＜0.01）；B1的7種活性成分含量均顯著高于B2，且均極顯著高于CK2?？梢钥闯?，除原兒茶酸B1顯著低于A2外，其他6種成分的B1含量均極顯著高于A2（P＜0.01），且在所有處理中為最高，排序均為：B1＞A2＞B2＞A1＞CK1＞CK2，各處理間差異均達極顯著水平。B1處理的京尼平苷酸、車葉草苷、綠原酸、兒茶素、松脂醇二葡萄糖苷和沒食子酸甲酯含量較CK2分別提高122.79%、81.83%、44.50%、124.01%、51.69%和1 040.85%，A2處理較CK2分別提高87.98%、48.46%、31.31%、85.52%、25.17%和806.00%。

2.2.2 抗氧化活性

1）DPPH自由基清除能力。半抑制濃度（IC₅₀值）越低，對應(yīng)自由基的清除能力越強。在杜仲葉水提液質(zhì)量濃度為1.0～5.0 g/L范圍內(nèi)，DPPH自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度增大而增大（圖1）。IC₅₀值顯著分析表明，除了A2與B1無顯著差異外，其他處理間均存在顯著性差異。DPPH自由基清除能力（以IC₅₀值為參考）由強到弱排序為B1＞A2＞A1＞B2＞CK1＞CK2。其中，對照組CK1和CK2的IC₅₀值分別是6.033和8.079 g/L，即汽爆前DPPH自由基清除能力‘華仲8號’顯著強于‘華仲12號’；B1和A2處理的DPPH自由基清除能力IC₅₀值最小，為2.119 和2.428 g/L，分別是汽爆前（8.079 g/L）的26.23%和30.05%，其次是A1和B2處理的IC₅₀值，為2.781和3.207 g/L，分別是汽爆前的34.42%和39.70%，以IC₅₀值為參考，即經(jīng)汽爆后兩種杜仲成熟葉的抗氧化活性揉捻處理分別提升了1.91和1.85倍，不揉捻處理分別提升了2.33和0.88倍。與杜仲商品茶相比，A2和B1處理的IC₅₀值分別是CK2的40.25%、35.12%，其次是A1和B2處理的IC₅₀值分別是CK2的46.10%、53.16%，即汽爆茶揉捻處理抗氧化活性分別提升了 1.17和1.09倍，不揉捻處理分別提升了1.20和0.88倍。

2）ABTS自由基清除能力。在杜仲葉水提液質(zhì)量濃度為1.3～5.0 g/L范圍內(nèi)，ABTS自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度增大而增大（圖1）。IC₅₀值顯著性分析表明，所有處理間均存在顯著性差異。ABTS自由基清除能力（以IC₅₀值為參考）由強到弱排序為A2＞B1＞A1＞B2＞CK1＞CK2。其中，對照組CK1和CK2的IC₅₀值分別是5.924和7.190 g/L，即汽爆前ABTS自由基清除能力‘華仲8號’顯著強于‘華仲12號’；A2和B1處理的ABTS自由基清除能力IC₅₀值最小，為2.688和3.448 g/L，分別是汽爆前（5.924 g/L）的45.37%和58.20%，其次是A1和B2處理的IC₅₀值，為3.754和4.583 g/L，分別是汽爆前的63.37%和77.36%。即經(jīng)汽爆處理，兩種杜仲成熟葉的抗氧化活性揉捻處理分別提升了0.58和1.09倍，不揉捻處理分別提升了1.20和0.57倍。與杜仲商品茶相比，A2和B1處理的IC₅₀值分別是CK2（7.190 g/L）的37.39%、47.96%，其次是A1和B2處理的IC₅₀值分別是CK2的52.21%、62.35%，即汽爆茶揉捻處理分別提升了 0.92和1.09倍，不揉捻處理分別提升了1.20和0.29倍。

2.2.3 活性成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

活性成分與DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的相關(guān)性分析顯示，總黃酮、多酚、京尼平苷酸、車葉草苷、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素和松脂醇二葡萄糖苷與DPPH自由基和ABTS自由基清除能力均呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），而多糖與沒食子酸甲酯對DPPH自由基和ABTS自由基清除能力無顯著影響（表5）。

結(jié)果顯示汽爆后總黃酮、多酚、京尼平苷酸、車葉草苷、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素和松脂醇二葡萄糖苷這些活性成分的釋放是杜仲葉水提液抗氧化能力顯著性增強的主要原因。

2.2.4 HS-SPME/GC-MS初步分析香氣組分

HS-SPME/GC-MS從A2、B1和CK1中共鑒定出145種揮發(fā)性化合物，A2、B1和CK1中可鑒定的峰面積分別占比為100.00%、93.48%和94.89%，根據(jù)化合物類型將其分為碳氫化合物、雜環(huán)類化合物、醇類化合物、醛類化合物、酮類化合物、酯類化合物、酚類化合物和其他類化合物（表6）。

由表6可見，CK1揮發(fā)物相對含量最高的是酯類，占41.71%； A2和B1的揮發(fā)物相對含量最高均為酮類，分別占29.05%和23.32%。CK1的揮發(fā)性化合物成分共鑒定出52種，而A2和B1的揮發(fā)性化合物種類為68和69種，分別增加了16和17種。汽爆后的醛類、酮類和酚類化合物均有增加，其中，A2的醛類、酮類和酚類分別增加了3、10和3種，B1分別增加了4、7和5種。

根據(jù)查詢揮發(fā)性化合物的嗅聞閾值及香氣描述，從A2、B1和CK1的揮發(fā)性化合物中初步篩選出11種呈香物質(zhì)（表7）。其中A2處理中壬醛、大馬士酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯5種芳香物質(zhì)相對含量分別比對照增加了1.37、0.09、2.34、1.85和6.49倍，并產(chǎn)生了苯甲醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-環(huán)檸檬醛和香蘭素，相對含量分別達8.70%、5.29%、0.89%和0.81%；B1處理中壬醛、癸醛、大馬士酮、香葉基丙酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯5種芳香物質(zhì)相對含量分別比對照增加了1.29、0.97、0.73、2.51和3.73倍，并產(chǎn)生了（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-環(huán)檸檬醛、香蘭素和α-紫羅蘭酮4種新的芳香物質(zhì)，相對含量分別達3.78%、0.99%、0.45%和0.64%?；跉馕痘疃戎担∣AV）分析結(jié)果，CK1主要呈香物質(zhì)有大馬士酮、β-紫羅蘭酮、香葉基丙酮、癸醛和二氫獼猴桃內(nèi)酯等5種，OAV值分別為330.00、192.86、74.00、3.50和2.66，呈現(xiàn)玫瑰香、花香和紫羅蘭香；A2呈香物質(zhì)有α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、大馬士酮、香葉基丙酮、（E，E）-2，4-庚二烯醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯、香蘭素、苯甲醇和壬醛等9種，OAV值分別為810.00、550.00、360.00、247.00、103.73、19.92、1.62、1.58和1.27，呈現(xiàn)木香、花香、紫羅蘭香、玫瑰香、木蘭香氣； B1呈香物質(zhì)有大馬士酮、香葉基丙酮、α-紫羅蘭酮、（E，E）-2，4-庚二烯醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯、癸醛和壬醛等7種，OAV值分別為570.00、260.00、160.00、74.12、12.58、6.90和1.23，呈現(xiàn)玫瑰香、木蘭香氣、木香、花香等。

3 討 論

盡管有研究顯示，‘華仲12號’（亦被稱為紅葉杜仲）的黃酮含量高于其他綠葉杜仲^[34]，但是本研究中對照組‘華仲8號’總黃酮和多酚含量顯著高于‘華仲12號’，汽爆后兩者含量均極顯著增加。由此表明，杜仲葉片不經(jīng)加工時，活性成分水溶解率極低；雖然杜仲葉片都屬于薄革質(zhì)，但紅葉杜仲比其他綠葉杜仲更厚^[35]，不經(jīng)揉捻處理可能使活性成分難以被溶出。

通過比較9個不同汽爆條件下總黃酮、多酚和多糖含量發(fā)現(xiàn)，汽爆后的總黃酮和多酚含量較對照均有顯著提高（P＜0.05），蒸汽壓強、穩(wěn)壓時間對總黃酮、多酚和多糖影響均達到極顯著水平（P＜0.01），且兩者間存在極顯著交互作用（P＜0.01），說明汽爆處理對杜仲葉片活性成分的水溶解率提高起關(guān)鍵作用。依據(jù)總黃酮、多酚和多糖含量確定最佳處理為蒸汽壓強0.45 MPa，穩(wěn)壓時間300 s，其中，A1、A2、B1和B2的總黃酮含量較對照分別提高了1.93、10.87、21.51和21.71倍，多酚含量較對照分別提高了0.43、1.14、0.87和0.67倍。前期研究發(fā)現(xiàn)，汽爆過程中蒸汽在高壓下瞬時釋放打破了葉片細胞壁結(jié)構(gòu)，使物料比表面積成倍增加，溶劑可及性增強，因而活性成分溶出率顯著提高^[26，36]。研究發(fā)現(xiàn)，利用汽爆和酸提取相結(jié)合的技術(shù)來處理桔皮，顯著提高了可溶性食物纖維的產(chǎn)量^[37]；汽爆后，漆樹（Toxicodendron vernicifluum）果實出油率增加了16.04%，比未處理樣品的出油率增加約4倍^[38]；對番茄（Solanum lycopersicum）皮汽爆后，皮渣中的螯合可溶性果膠、水溶性果膠和可溶性膳食纖維總量分別提高了5.00、1.95和0.26倍，持油力、體外抗氧化能力等有所改善^[39]。此外，汽爆條件不同，目標產(chǎn)物得率也不同，這主要由于物料中各種結(jié)構(gòu)組織對汽爆處理響應(yīng)程度不一樣。例如，蘆葦（Phragmites communis）在汽爆壓強為1.2 MPa時比1.5 MPa生成的細纖維更多，能更好地改善纖維質(zhì)量^[40]；汽爆過程中，豆渣中可溶性膳食纖維含量隨壓強的增加先升后降^[41]；Fu等^[23]發(fā)現(xiàn)，汽爆時，杜仲葉片比表面積隨蒸汽壓強的增加呈先升后降的趨勢，Ding等^[42]也有類似發(fā)現(xiàn)。

揉捻處理一般在凋萎之后進行，也是發(fā)酵的前過程，該處理破壞了杜仲葉細胞組織，使葉內(nèi)多酚類化合物與多酚氧化酶充分接觸；揉捻得宜則茶湯色澤紅亮，揉捻過度則有大量氧化物質(zhì)，導(dǎo)致茶湯色澤偏深，葉底紅暗等情況出現(xiàn)^[41]。對比兩種工藝處理， P₂T₃處理下，A2比A1的總黃酮、多酚及7種活性成分含量顯著提高，表明‘華仲8號’葉片揉捻后，黃酮類和多酚類等活性成分與葉中多種氧化酶接觸充分反應(yīng)后被氧化，其含量均不同程度降低，與前人結(jié)論一致^[43-45]；‘華仲12號’揉捻后多酚和多糖含量顯著高于不揉捻處理，即揉捻能促進‘華仲12號’葉片中活性成分釋放，這很可能與‘華仲12號’葉片較厚有關(guān)。 汽爆后，‘華仲12號’總黃酮含量顯著高于‘華仲8號’，與前人結(jié)論相符^{[34-35，46]}。

作為杜仲次生代謝產(chǎn)物，多酚類和環(huán)烯醚萜類化合物是杜仲飲品的重要成分，既對杜仲葉水提液的抗氧化活性起到關(guān)鍵作用，也是影響杜仲茶口感的主要風味物質(zhì)（如綠原酸、沒食子酸甲酯等）^[19]。P₂T₃條件下，京尼平苷酸、車葉草苷、綠原酸、兒茶素、松脂醇二葡萄糖苷和沒食子酸甲酯6種成分含量均極顯著提高，以A2和B1最佳，其中，A2較對照提高了87.98%、48.46%、31.31%、85.52%、25.17%和806.00%，B1較對照提高了122.79%、81.83%、44.50%、124.01%、51.69%和1 040.85%。與幾種市售商品杜仲茶相比，A2比杜仲黑茶^[36]中綠原酸（2.81 mg/g）和原兒茶酸（0.29 mg/g）含量分別提高了3.54和3.38倍，B1分別提高2.63和2.48倍；A2和B1較殺青工藝生產(chǎn)的杜仲茶^[13] 綠原酸含量（4.2 mg/g）分別提高了2.02和1.91倍，比杜仲金花茶^[12] 綠原酸含量（0.478 mg/g）提高了25.72和24.98倍。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，總黃酮、多酚、京尼平苷酸、車葉草苷、原兒茶酸、綠原酸、兒茶素和松脂醇二葡萄糖苷與DPPH自由基和ABTS自由基清除能力均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與前人發(fā)現(xiàn)總黃酮、多酚、綠原酸和原兒茶酸等含量與杜仲葉片抗氧化能力密切相關(guān)的結(jié)論一致^[47]。抗氧化活性表現(xiàn)最佳為A2和B1，DPPH自由基清除能力IC₅₀值分別是杜仲商品茶的40.25%、35.12%，ABTS自由基清除能力IC₅₀分別是杜仲商品茶的37.39%、47.96%。由于汽爆后杜仲葉活性成分溶出率顯著提高^[42]，而這些活性成分與DPPH自由基和ABTS自由基清除率顯著相關(guān)，因此在低濃度下依然表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。

為改善杜仲茶香氣，前人進行了諸多嘗試。采用4種乳酸菌發(fā)酵后，揮發(fā)性成分增加了7～20種，以酮類、醇類和雜環(huán)類居多，相對含量分別為18.8%、18.3%和25.7%，提高了2.10、1.90和3.99倍^[48]；采用涇陽茯磚茶加工工藝制備的杜仲葉茯磚茶，6個階段共鑒定出 152 種揮發(fā)性物質(zhì)，酸類（19.06%～30.59%）、酯類（15.58%～21.87%）、酮類（11.84%～14.30%）和醇類（10.52%～20.07%）為各樣本中總體含量較高的揮發(fā)性成分^[49]；以杜仲等3 種中草藥為原料，加棗汁、蔗糖等調(diào)節(jié)風味后，檢測出杜仲飲品中揮發(fā)性化合物有27種，醛類和醇類化合物居多，相對含量分別為38.89%和6.79%^[50]。本研究發(fā)現(xiàn)，A2 和B1揮發(fā)性化合物分別為68和69種，增加了16和17種，其中酮類化合物占比最高，相對含量分別為29.05%和23.32%，比對照增加了3.38和3.52倍，酮類物質(zhì)在茶湯中多為花香氣味，性質(zhì)穩(wěn)定，且花香持久，例如，大馬士酮為類似玫瑰的芳香氣味，β-紫羅蘭酮為紫羅蘭香氣等^[48]。其中，A2的主要呈香物質(zhì)為壬醛、大馬士酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯，其含量比對照顯著增加，并產(chǎn)生了苯甲醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-環(huán)檸檬醛和香蘭素4種新的芳香物質(zhì)；B1的主要呈香物質(zhì)是壬醛、癸醛、大馬士酮、香葉基丙酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯，其含量比對照顯著增加，并產(chǎn)生了（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-環(huán)檸檬醛、香蘭素和α-紫羅蘭酮4種新的芳香物質(zhì)。由于當前綠葉杜仲的資源量遠遠大于紅葉杜仲，因此本研究選擇‘華仲8號’杜仲葉作為揮發(fā)性化合物分析的對照，使其更具代表性。后續(xù)將采用電子鼻和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)，基于OAV值、主成分分析以及正交偏最小二乘法深入解析汽爆前后揮發(fā)性化合物的差異情況。杜仲茶整體品質(zhì)不僅受活性成分及香氣組分的影響，色、味也是評價茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵因素^[42]，杜仲葉片汽爆后由暗綠色轉(zhuǎn)為暗褐色，葉色一致，茶湯有類似紅茶的色澤，同時，因活性成分含量高，茶湯口感醇厚。本研究所探索的方法徹底改變了杜仲發(fā)酵茶制作時，渥堆過程憑感觀經(jīng)驗操作可能造成的 “熟老菱氣”和葉色不均的問題。

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（責任編輯 李燕文）