巖土高效溶蝕菌株Bt NL-11發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用效果分析

摘要：【目的】為科學(xué)治理廢棄礦山邊坡，探究土壤細(xì)菌永久綠化法在生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用與推廣，對(duì)分離篩選出的高效溶蝕菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化及應(yīng)用效果分析?！痉椒ā繌哪暇┠桓斤L(fēng)化巖壁土壤中分離出多種溶蝕微生物，并從中挑選出1種表現(xiàn)突出的溶蝕細(xì)菌菌株NL-11[經(jīng)16S rRNA鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）]進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，利用盆栽試驗(yàn)觀測(cè)其應(yīng)用效果。首先利用單因素和Plackett Burman（PB）試驗(yàn)篩選出影響菌株生長的3個(gè)主要因素，即裝液量、培養(yǎng)溫度和時(shí)間；在此基礎(chǔ)上使用最陡爬坡路徑逼近最大響應(yīng)區(qū)域；再利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析；最后通過比較預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值驗(yàn)證模型可靠性。利用優(yōu)化結(jié)果制備菌液，將制備好的菌液調(diào)節(jié)為低（10 cfu/mL）、中（1×10⁵ cfu/mL）和高（1×10⁹ cfu/mL）3種菌液濃度拌入基質(zhì)（分別為T1、T2、T3處理）進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，設(shè)置不加菌液的處理為空白對(duì)照（CK），研究不同濃度菌液對(duì)礦物風(fēng)化、植物和根系生長的促進(jìn)作用?！窘Y(jié)果】模型準(zhǔn)確可靠，菌株NL-11的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：裝液量19.51 mL，接種量2%（體積分?jǐn)?shù)），初始pH 7.0，培養(yǎng)溫度30.30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間22.07 h，在此優(yōu)化條件下發(fā)酵液中活菌數(shù)達(dá)到1.47×10¹⁰ cfu/mL，是未優(yōu)化前的2.03倍。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株NL-11能夠促進(jìn)礦物風(fēng)化，以高濃度菌液效果最顯著；NL-11能夠促進(jìn)礦質(zhì)養(yǎng)分溶解，以高濃度菌液效果最顯著；NL-11能夠促進(jìn)植物及根系生長，以中濃度效果最顯著。【結(jié)論】通過優(yōu)化試驗(yàn)顯著提高了菌株NL-11的發(fā)酵活菌產(chǎn)量，為菌株在邊坡治理中的應(yīng)用提供技術(shù)支持，綜合評(píng)價(jià)菌株的應(yīng)用效果并考慮生產(chǎn)成本等因素，噴播實(shí)踐中的合適菌液濃度為1×10⁵ cfu/mL。

關(guān)鍵詞：生態(tài)修復(fù)；蘇云金芽孢桿菌；發(fā)酵條件優(yōu)化；Box-Behnken設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)：X751;S732;Q89 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

文章編號(hào)：1000-2006（2024）03-0071-10

Optimization for fermentation conditions and analysis of application effect for high efficiency dissolution strain Bt NL-11 from Bacillus thuringiensis

WANG Lingjian^1，2， JIA Zhaohui¹， ZHANG Jinchi^1*， TANG Xinggang¹， SUN Xin¹， MENG Miaojing¹， LIU Xin^1，2

（1. Jiangsu Province Key Laboratory of Soil and Water Conservation and Ecological Restoration， College of Water and Soil Coservation， College of Forestry and Grassland， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China; 2. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China）

Abstract：【Objective】This study aimed to scientifically manage abandoned mine slopes， explore the application and promotion of the soil bacteria permanent greening method in restoration， optimize the fermentation conditions， and analyze the application effect of the isolated and screened high-efficiency solubilizing bacteria.【Method】A variety of solubilizing microorganisms were isolated from the weathered rock wall soil in Nanjing Mufu Mountain， and a prominent solubilizing strain， NL-11， identified as Bacillus thuringiensis by 16S rRNA， was selected to optimize fermentation conditions， and its application effect was observed with the potting test. The three main factors affecting the growth of the strain （liquid volume， temperature， and time）， were screened using the univariate and Plackett Burman tests; on this basis， the steepest climbing path was used to approximate the maximum response area; then， the Box-Behnken experimental design was used and the response surface analysis method was used for regression analysis. Finally， model reliability was verified by comparing the predicted values with the measured values. The optimized results were used to prepare the bacterial solution， and then adjusted to low （10 cfu/mL）， medium （1 × 10⁵ cfu/mL）， and high （1 × 10⁹ cfu/mL） concentrations and mixed into the substrate （T1， T2， and T3 treatments， respectively） for the pot experiments， and the treatment without the bacterial solution was set as a blank control （CK） to study the effects of the different bacterial solution concentrations on mineral weathering and plant and root growth.【Result】The model was accurate and reliable， and the optimal fermentation culture conditions for NL-11 were as follows： a liquid volume of 19.51 mL， an inoculum level of 2%， an initial pH of 7.0， a temperature of 30.30 ℃， and a time of 22.07 h. The number of viable bacteria in the fermentation broth under these optimized conditions reached 1.47 × 10¹⁰ cfu/mL， which was 2.03 times higher than that before optimization. The results of the pot tests showed that strain NL-11 could promote mineral weathering， and the effect of the high concentration of the bacterial solution was the most significant. Furthermore， strain NL-11 could promote the dissolution of mineral nutrients， and the effect of the high concentration of the bacterial solution was the most significant. Strain NL-11 could also promote plant and root growth， and the effect of the medium concentration was the most significant. 【Conclusion】The optimization test significantly improved the production of fermentation of the live bacteria of strain NL-11 and provided technical support for the application of the strain in the management of slopes. The suitable concentration of the bacterial solution in spraying practice is 1 × 10⁵ cfu/mL by the comprehensive evaluation of the application effect and consideration of the production cost and other factors.

Keywords：ecological restoration; Bacillus thuringiensis; fermentation process optimization; Box-Behnken design

開發(fā)利用礦產(chǎn)資源促進(jìn)了區(qū)域經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展，但同時(shí)也產(chǎn)生了一系列環(huán)境和社會(huì)問題^[1-4]，出現(xiàn)了大量的裸露石質(zhì)邊坡。國際上石質(zhì)邊坡復(fù)綠一直是礦山生態(tài)恢復(fù)的重點(diǎn)難題^[5-8]，噴播綠化法是石質(zhì)邊坡生態(tài)修復(fù)的一種重要方法^[9-10]，近年來，日本科學(xué)家通過在基質(zhì)中添加有效土壤菌的方式對(duì)其進(jìn)行改良，發(fā)明了一種新型護(hù)坡綠化技術(shù)——土壤菌永久綠化法，即利用有效土壤菌對(duì)巖石的風(fēng)化作用，加快巖石的土壤化進(jìn)程，人為制造出具高次團(tuán)粒結(jié)構(gòu)并可棲息各種小型土壤動(dòng)物與微生物的土壤，模擬自然生境，促進(jìn)植物繁育生長，克服了客土噴播技術(shù)綠化效果難以長期維持的缺陷^[11-13]。由于缺乏優(yōu)質(zhì)的土壤有效菌和專業(yè)的技術(shù)指導(dǎo)，土壤菌永久綠化法在我國的應(yīng)用還存在諸多困難^[14-15]。

目前，全世界被保藏的蘇云金芽孢桿菌估計(jì)有60 000株，分布于世界各地^[16]，在植物保護(hù)和害蟲防治等方面已得到廣泛應(yīng)用^[17-18]。關(guān)于其培養(yǎng)優(yōu)化已有很多研究報(bào)道，楊靜等^[19]為提高蘇云金芽孢桿菌菌株Ⅸ17的胞外多糖（EPS）產(chǎn)量，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件，優(yōu)化后的EPS產(chǎn)量與初始發(fā)酵工藝相比，提高了133.3%；宋健等^[20]利用單因素和響應(yīng)面法對(duì)蘇云金芽孢桿菌菌株JQD117發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高其芽孢產(chǎn)量。由于同種菌株的來源和發(fā)酵目的差異對(duì)營養(yǎng)的需求不同，最適發(fā)酵條件也有差異^{[2，21-23]}。因此，對(duì)菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化是獲得最佳生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益的基礎(chǔ)^[24]。

為獲得適應(yīng)性強(qiáng)且安全高效的土壤微生物，研究團(tuán)隊(duì)從南京幕府山風(fēng)化巖壁土壤中分離、挑選出1株高效溶蝕細(xì)菌NL-11[經(jīng)16S rRNA鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）]^[15]。此次試驗(yàn)利用單因素法、PB以及響應(yīng)面設(shè)計(jì)，對(duì)能夠高效溶蝕碳酸鹽巖的菌株NL-11進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化，以獲得高密度、低成本的菌液。利用優(yōu)化結(jié)果制備菌液進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，探究菌株對(duì)基質(zhì)養(yǎng)分及紫穗槐生長的影響，評(píng)估其在噴播實(shí)踐中作為土壤有效菌的應(yīng)用潛力，為形成并推廣具有中國特色的溶蝕菌種綠化法提供數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：蘇云金芽孢桿菌菌株NL-11 分離自南京幕府山風(fēng)化巖壁表層土壤，經(jīng)16S rRNA基因序列分析，鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）^[15]，現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC NO：M2012453）。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂18.0 g/L。

NB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L。

基質(zhì)：基礎(chǔ)基質(zhì)由土壤、泥炭土、木纖維、黏結(jié)劑、保水劑按比例配制（質(zhì)量比例為土壤75.82%，泥炭土10%、木纖維14%，保水劑1‰，黏合劑0.8‰），調(diào)節(jié)含水量至50%，攪拌均勻后，121 ℃滅菌40 min，保存?zhèn)溆??；|(zhì)土壤采自幕府山的林地；基質(zhì)泥炭土、木纖維、黏結(jié)劑、保水劑購自Eco工程綠化公司。

礦物：采自幕府山石質(zhì)邊坡，根據(jù)X射線衍射結(jié)果得出其礦物組成（化學(xué)成分及質(zhì)量占比為：CaO，62.34%；MgO，27.93%；K₂O，1.75%；Fe₂O₃，3%；Al₂O₃，0.61%；SiO₂，1.35%；Na₂O，0.04%；其他2.98%）。將礦物洗凈、粉碎過篩（孔徑0.282 mm），滅菌備用。

植物：紫穗槐（Amorpha fruticosa），購于德陽種業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子液制備

將保存良好的蘇云金芽孢桿菌菌株NL-11植于NA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，選擇發(fā)育較好的菌落，轉(zhuǎn)移至NB培養(yǎng)基，30 ℃震蕩（175 r/min）24 h制成種子液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株NL-11高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

1）發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)。將種子液接入NB培養(yǎng)基，在初始發(fā)酵條件（時(shí)間24 h、接種量5%、裝液量20 mL/150 mL、溫度30 ℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速175 r/min）基礎(chǔ)上，分別考察時(shí)間（14、16、18、20、22、24、26 h）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，均為體積分?jǐn)?shù)）、裝液量（10、20、30、40、50、60、70 mL，裝于150 mL三角瓶中）、培養(yǎng)溫度（26、28、30、32、34、36、38 ℃）、pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）等發(fā)酵參數(shù)對(duì)菌株NL-11生長狀況的影響。

2）Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0的PB法對(duì)裝液量、pH、時(shí)間、接種量、溫度等5個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素取兩個(gè)水平（試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1），以發(fā)酵液OD₆₀₀值作為響應(yīng)值篩選出影響菌株NL-11生長狀況的重要因素，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

3）最陡爬坡試驗(yàn)。

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果得出對(duì)菌株NL-11生長狀況影響最顯著的3個(gè)因素，即裝液量、時(shí)間和溫度，根據(jù)3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長，安排最陡爬坡試驗(yàn)來確定因素的中心點(diǎn)，從而逼近最大響應(yīng)值（發(fā)酵液OD₆₀₀值）。

4）響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。

在PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以發(fā)酵液OD₆₀₀值為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2），其中包括12個(gè)析因試驗(yàn)和5個(gè)中心試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過比較預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值驗(yàn)證模型的有效性。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)及處理

采用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝制備菌液，將100 mL菌液與基礎(chǔ)基質(zhì)（3.5 kg）充分混合裝盆（盆底放有100 g礦物），以未添加菌液處理作為對(duì)照。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，分別為T1（低濃度，菌液濃度為10 cfu/mL）、T2（中濃度，菌液濃度為1×10⁵ cfu/mL）、T3（高濃度，菌液濃度為1×10⁹ cfu/mL）、CK（未添加菌液），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)?；|(zhì)放置5 d后栽植紫穗槐，于溫室內(nèi)常規(guī)管理90 d后進(jìn)行樣品采集和指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 菌株生長曲線繪制

按照比濁法測(cè)定菌體密度，以O(shè)D₆₀₀值表示；稀釋瓊脂平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落總數(shù)，繪制菌株NL-11的生長曲線。

1.3.2 礦物表面形貌觀測(cè)

收集待測(cè)礦物，干燥處理，固定噴金，用掃描電鏡（Quanta 200，F(xiàn)EI公司）觀察表面形貌。

1.3.3 基質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

參考文獻(xiàn)[25]測(cè)定以下指標(biāo)：基質(zhì)全鈣、鎂采用消煮-原子吸收分光光度法測(cè)定；水溶性鈣、鎂采用振蕩-原子吸收分光光度法測(cè)定；交換性鈣、鎂采用乙酸銨振蕩-原子吸收分光光度法測(cè)定；基質(zhì)速效氮采用堿解擴(kuò)散吸收法測(cè)定；速效磷采用碳酸氫鈉法測(cè)定；速效鉀采用醋酸銨-火焰光度法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定。

1.3.4 植物生長指標(biāo)測(cè)定

分別利用皮尺、游標(biāo)卡尺和LI-3000C便攜式葉面積儀（哈量605系列，哈量工具有限公司）分別測(cè)定幼苗的苗高、地徑和整株葉面積指數(shù)；利用Epson perfection V 700根系掃描儀測(cè)定根系生長指標(biāo)（根長、根表面積、根直徑、根體積）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel、SPSS 20.0、Design-Expert 8.0、Origin 8.5，Photoshop CS6等軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和圖件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株 NL-11培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 菌株 NL-11培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)

菌株NL-11培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，初始裝液量為10～70 mL時(shí)，最終發(fā)酵液OD₆₀₀值隨初始裝液量的增加呈先增加后降低，當(dāng)初始裝液量為30 mL時(shí)，發(fā)酵液OD₆₀₀值達(dá)到最大值（發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到1.00×10¹⁰ cfu/mL）。初始pH為5.5～8.5時(shí)，隨著pH的增大，最終發(fā)酵液OD₆₀₀值呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH為6.5時(shí)，發(fā)酵液OD₆₀₀值達(dá)到最大，活菌數(shù)達(dá)到最大（8.46×10⁹ cfu/mL）。試驗(yàn)表明菌株NL-11在微酸性環(huán)境中長勢(shì)較好，過酸或偏堿性條件均不利于該菌的生長。在發(fā)酵初期，菌株快速生長，發(fā)酵液活菌數(shù)顯著增加；當(dāng)培養(yǎng)至20 h時(shí)，該菌液的OD₆₀₀值達(dá)到最大值，活菌數(shù)量達(dá)到9.87×10⁹ cfu/mL；隨著發(fā)酵時(shí)間延長，菌株生長進(jìn)入衰亡期，由于營養(yǎng)的匱乏，以及自身的生長周期限制，發(fā)酵液OD₆₀₀值顯著降低。當(dāng)接種量為1%～3%（體積分?jǐn)?shù)，下同）時(shí)，菌株的發(fā)酵液OD₆₀₀值隨著接種量的增加而升高，當(dāng)接種量為3%時(shí)，發(fā)酵液OD₆₀₀值達(dá)到最大值（活菌數(shù)達(dá)8.85×10⁹ cfu/mL）；接種量超過3%，隨著接種量的增加，最終發(fā)酵液OD₆₀₀值顯著降低。這可能是由于接種量過大，導(dǎo)致菌體前期生長較快，消耗營養(yǎng)物質(zhì)多，同時(shí)產(chǎn)生了大量代謝廢物^[26-27]，從而抑制了菌體的正常生長。隨著培養(yǎng)溫度的升高，發(fā)酵液OD₆₀₀值先增加后減少，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，發(fā)酵液OD₆₀₀值最大，活菌達(dá)到9.49×10⁹ cfu/mL；當(dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)顯著下降。因此，28 ℃為菌株生長的適宜溫度。

2.1.2 Plackett-Burman（PB）及爬坡試驗(yàn)

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與回歸分析見表3。對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可知，回歸模型Plt;0.05，回歸模型顯著。PB試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析表明，因素B、D的P值分別為0.488 8、0.055 1（Pgt;0.05），說明在測(cè)試范圍內(nèi)，這些因素對(duì)響應(yīng)值無顯著影響；因素A、C、E的P值分別為0.0345、lt;0.000 1、0.004 9（Plt;0.05或Plt;0.01），這3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值有極顯著或顯著影響。各因素對(duì)菌株生長狀況影響的重要性排序?yàn)椋篊gt;Egt;Agt;Dgt;B，因此應(yīng)選擇A、C、E進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

最陡爬坡試驗(yàn)可以快速確定最佳中心，根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果篩選出因素A、C、E作為最陡爬坡試驗(yàn)的考察對(duì)象，固定因素B為7.0，因素D為2%。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果可知，因素C和E對(duì)響應(yīng)值有顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加；因素A有顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減小。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示，3個(gè)因素的最佳組合因子在第3組試驗(yàn)附近，即當(dāng)因素A為20 mL，因素C為21 h，因素E為30 ℃時(shí)響應(yīng)值最大，故以試驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.1.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以因素A、C、E為變量，以發(fā)酵液OD₆₀₀值為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果構(gòu)建回歸模型，并進(jìn)行方差分析（表5）。由表5可知，響應(yīng)值對(duì)因素A、C、E的回歸方程為：Y=2.33-0.11A+0.12C+0.15E-0.053AC-0.048AE+0.031CE-0.3A²-0.25C²-0.16E²。模型具有極高的顯著性（Plt;0.01），擬合精度好，可以利用其進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化設(shè)計(jì)；失擬項(xiàng)不顯著，試驗(yàn)可信，誤差小。模型回歸方程決定系數(shù)為R²=0.996 5，且與R²_adj的值相近，說明模型擬合度較好，可以很好地模擬不同條件下發(fā)酵液OD₆₀₀值的理論預(yù)測(cè)；變異系數(shù)（C.V.）為1.26%lt;10%，說明二次回歸方程可以很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)，不需引入更高次項(xiàng)。方差分析結(jié)果表明：因素A、C、E的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均對(duì)響應(yīng)值的回歸模型影響極顯著（Plt;0.01）；因素A和E、A和C的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（Plt;0.01）；因素E和C的交互對(duì)響應(yīng)值影響顯著（Plt;0.05）。由F值可知，各因素對(duì)發(fā)酵液OD₆₀₀值的影響次序?yàn)镃gt;Egt;A，與PB試驗(yàn)結(jié)果相同。

各因素交互作用影響的顯著性可通過等高線圖的形狀來反映，當(dāng)?shù)雀呔€圖呈橢圓形時(shí)，交互作用顯著，而呈圓形時(shí)，表示不顯著。因此，可以通過響應(yīng)曲面和等高線圖直觀地觀察到各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響（圖2）。由圖2可知，因素A、C、E均對(duì)響應(yīng)指標(biāo)有顯著影響，其中AC、AE的交互作用相對(duì)更強(qiáng)，對(duì)響應(yīng)值的影響更大，響應(yīng)面坡度更陡，等高線呈現(xiàn)的橢圓形角度更大；CE響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩，等高線所呈橢圓角度相對(duì)較小，更趨近于圓形。

由Design-Expert 8.0軟件分析結(jié)果可知，菌株預(yù)測(cè)最佳發(fā)酵條件為：初始pH 7.0，接種量2%，裝液量19.51 mL，培養(yǎng)溫度30.30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間22.07 h，相應(yīng)的發(fā)酵液OD₆₀₀值為2.404，以此條件進(jìn)行了3組平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得發(fā)酵液OD₆₀₀值為2.401（活菌數(shù)為1.472×10¹⁰ cfu/mL），與預(yù)測(cè)值相接近，證實(shí)采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的發(fā)酵條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.2 菌株 NL-11對(duì)礦物表面形貌的影響

經(jīng)過細(xì)菌作用的礦石顆粒表面有明顯的溶蝕坑，與基質(zhì)接觸的表面積增加，結(jié)構(gòu)變得疏松；對(duì)照的礦石顆粒表面無明顯的溶蝕痕跡（圖3）。添加不同濃度的菌液對(duì)礦物表面的溶蝕效果差異明顯，其中T3處理中菌株對(duì)礦物的溶蝕作用最強(qiáng)，礦物表面大顆粒棱角磨平，數(shù)量減少，小顆粒增多，大顆粒的孔隙逐漸被風(fēng)化殘?bào)w或細(xì)小的礦粉顆粒填滿。

2.3 菌株 NL-11對(duì)基質(zhì)養(yǎng)分的影響

經(jīng)分析（表6）可知，在基質(zhì)中加入菌液，基質(zhì)的有機(jī)質(zhì)、速效氮、速效磷和速效鉀含量、有效鈣、鎂離子含量與對(duì)照相比均有增加，其中， T2、T3處理變化顯著（Plt;0.05），各處理的應(yīng)用效果表現(xiàn)為CKlt;T1lt;T2lt;T3；基質(zhì)的總鈣、鎂含量與對(duì)照相比均有減少，其中，T2、T3處理變化顯著（Plt;0.05），各處理應(yīng)用效果表現(xiàn)為T3lt;T2lt;T1lt;CK。綜上，在基質(zhì)中添加菌液有助于基質(zhì)養(yǎng)分的溶解釋放，提高土壤肥力，T3處理的綜合效果最佳。

2.4 菌株 NL-11對(duì)紫穗槐生長的影響

經(jīng)分析（表7）可知，在基質(zhì)中加入菌液，紫穗槐的苗高、地徑、葉面積均顯著高于對(duì)照（Plt;0.05）。各處理對(duì)紫穗槐植生長的促進(jìn)效果表現(xiàn)為T2gt;T3gt;T1gt;CK，且不同處理間各指標(biāo)差異顯著。T2處理促進(jìn)紫穗槐生長效果最佳，其苗高、地徑、葉面積與對(duì)照相比，分別提高了62.97%、52.78%、124.07%。在基質(zhì)中加入菌液，紫穗槐的根長、根平均直徑、根表面積、根體積均顯著高于對(duì)照（Plt;0.05）。各處理對(duì)紫穗槐根系生長的促進(jìn)效果表現(xiàn)為T2gt;T3gt;T1gt;CK。其中T2處理對(duì)紫穗槐根系生長的促進(jìn)效果最佳。

3 討 論

近年來，中國大力開展生態(tài)文明建設(shè)，為落實(shí)碳達(dá)峰、碳中和以及“1+N”的政策體系^[28-30]，不斷提高重要生態(tài)系統(tǒng)的科學(xué)治理水平。為了科學(xué)修復(fù)巖質(zhì)邊坡，解決邊坡綠化效果難以長期維持的問題，研究團(tuán)隊(duì)從南京幕府山巖質(zhì)邊坡風(fēng)化表層土壤中分離出多種微生物用以改良傳統(tǒng)噴播綠化技術(shù)，以期形成具有中國特色的溶蝕菌種綠化法。在之前的研究中，利用控制試驗(yàn)評(píng)估了不同菌株的增溶效果^[31-33]，并鑒定出16株表現(xiàn)較好的菌株，對(duì)其中4株申請(qǐng)了專利保護(hù)^{[15，34-36]}。此次研究挑選了表現(xiàn)突出且具有專利保護(hù)的蘇云金芽孢桿菌NL-11進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)，為溶蝕菌種綠化法在礦山修復(fù)中的應(yīng)用和推廣提供數(shù)據(jù)支撐和技術(shù)支持。單因素法、正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面優(yōu)化法是微生物發(fā)酵條件優(yōu)化中被廣泛應(yīng)用的方法^[37]。但傳統(tǒng)的單因素法試驗(yàn)次數(shù)多，試驗(yàn)周期長，且無法分析因素間的交互作用。正交試驗(yàn)法相較于單因素法有很多優(yōu)越性，但當(dāng)考慮因子的交互作用時(shí)，試驗(yàn)工作量會(huì)大大增加；且正交試驗(yàn)是對(duì)各個(gè)孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性較低。響應(yīng)面法（RSM）考慮了試驗(yàn)的隨機(jī)誤差以及因素間的交互作用，同時(shí)，其預(yù)測(cè)模型是連續(xù)的，可對(duì)試驗(yàn)各個(gè)水平進(jìn)行連續(xù)的分析以得到整個(gè)區(qū)域的最優(yōu)值^[38-39]。

響應(yīng)面法是近年來應(yīng)用最多的一種優(yōu)化技術(shù)，綜合了試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模，能夠快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件^{[37，38，40-43]}。因此，此次試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)菌株NL-11的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。裝液量是影響微生物生長和代謝的重要因素，裝液量較小，氧氣有余而營養(yǎng)不足；裝液量較大，則溶氧不足，菌株的生長以及產(chǎn)物的生成受到影響^[44-45]。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株NL-11為好氧細(xì)菌，在裝液量為10～30 mL時(shí)，生長狀況較好。發(fā)酵液的pH能夠通過影響酶活性進(jìn)而影響菌種的代謝、生長和繁殖，菌株NL-11表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐酸耐堿性，在偏酸至偏堿環(huán)境中都可存活，但在偏酸環(huán)境中長勢(shì)較好。發(fā)酵培養(yǎng)的溫度是影響菌種生長狀況的最重要的因素之一，對(duì)菌株體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)的影響極為明顯，溫度較低時(shí)，細(xì)胞的正常生長受到抑制，隨著發(fā)酵溫度升高，菌種生化反應(yīng)速率增大，代謝速度加快，但溫度過高時(shí)，酶易因過熱而變質(zhì)，菌種生長代謝受阻，甚至死亡^[46-48]，與相關(guān)研究相似^[49]，此次研究中，菌株NL-11表現(xiàn)出一定的耐熱性。

菌株NL-11通過風(fēng)化作用溶解釋放基質(zhì)及礦物中的礦質(zhì)養(yǎng)分。菌株對(duì)礦物的溶蝕和基質(zhì)養(yǎng)分的釋放作用隨著添加菌液濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，T3處理（高濃度，菌液濃度為1×10⁹ cfu/mL）的影響最顯著?；|(zhì)中速效氮含量隨著添加菌液濃度升高而顯著增加，T3處理下比對(duì)照分別增長了58.17%，這可能是由于菌種對(duì)基質(zhì)中氮素的活化作用，將氮元素轉(zhuǎn)化為可以植物吸收的形式，或菌種直接從環(huán)境中吸收氮元素以合成體內(nèi)的生命物質(zhì)、轉(zhuǎn)移給基質(zhì)及植物體^[50]；菌株能夠顯著促進(jìn)紫穗槐的生長，T2處理（中濃度，菌液濃度為1×10⁵ cfu/mL）的促生效果最佳。菌株能夠促進(jìn)紫穗槐及其根系的生長可能是由于菌株產(chǎn)生了某些植物激素^[51-53]、維生素^[54-56]，或菌株促進(jìn)了植物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收（溶蝕分解、固氮等作用）^{[53，57-58]}，亦或是菌株提高了植物的抗性（抗病性、抗逆性）等^[59-67]，這有待進(jìn)一步研究。

本研究明確了實(shí)際應(yīng)用中蘇云金芽孢桿菌NL-11菌液添加的大致范圍，為進(jìn)一步研究其噴播應(yīng)用中最適添加濃度提供了數(shù)據(jù)支持。微生物是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、傳輸過程中的重要一環(huán)，目前，菌株 NL-11作為有效溶蝕菌種在噴播應(yīng)用推廣中還存在如下問題：①菌株的穩(wěn)定性、保存及運(yùn)輸方式仍有待改進(jìn)；②菌株對(duì)植物的促生機(jī)制尚未明確；③菌株在噴播應(yīng)用中添加的合適濃度暫未確定等。因此，今后的研究中需深入探究菌株對(duì)基質(zhì)養(yǎng)分、結(jié)構(gòu)和植物形態(tài)、生理的影響及其機(jī)制，力求探索出植物-土壤-微生物間養(yǎng)分的動(dòng)態(tài)平衡以及互作機(jī)理，加強(qiáng)技術(shù)攻關(guān)，改進(jìn)工藝流程、優(yōu)化菌種保存及運(yùn)輸方式，在綜合考慮應(yīng)用效果和生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上確定合適的添加濃度，進(jìn)一步改進(jìn)土壤菌噴播綠化技術(shù)，推動(dòng)溶蝕菌種噴播綠化技術(shù)在中國的應(yīng)用和推廣。

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（責(zé)任編輯 王國棟）