外源IAA對核桃內(nèi)果皮生長發(fā)育的影響

李義霞 魚尚奇 郭眾仲 付嘉智 鹿宏麗 王紅霞 張銳 木塔力甫

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230524

摘??? 要：【目的】探究生長素（IAA）對核桃內(nèi)果皮發(fā)育的影響?！痉椒ā坎捎貌煌|(zhì)量濃度的IAA處理核桃，通過Wiesner法觀察核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素的沉積變化，并測定內(nèi)果皮中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素和IAA含量，同時對IAA處理后第12天的樣本進行高通量測序?！窘Y(jié)果】與對照相比，低質(zhì)量濃度IAA處理和高質(zhì)量濃度IAA處理后內(nèi)果皮木質(zhì)素的積累存在顯著差異，在處理后期，核桃內(nèi)果皮部分硬化，仍存在內(nèi)果皮缺失或不完整現(xiàn)象。木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量整體呈上升趨勢，最高分別可達30.55%、16.49%和17.23%，IAA含量整體呈上升趨勢；通過RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成途徑中，且隨著IAA質(zhì)量濃度的升高，部分與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成相關(guān)的差異表達基因逐漸下調(diào)表達或不表達?！窘Y(jié)論】IAA參與調(diào)控核桃內(nèi)果皮的發(fā)育，影響內(nèi)果皮木質(zhì)素的積累，為后期研究核桃內(nèi)果皮對外源生長素的響應(yīng)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：核桃；內(nèi)果皮；IAA；木質(zhì)素；高通量測序

中圖分類號：S664.1?????????? 文獻標志碼：A??????????? 文章編號：1009-9980（2024）05-0941-15

收稿日期：2023-12-13??????? 接受日期：2024-01-31

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32160689）；南疆重點產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展支撐計劃（2022DB022）；“天山英才”培養(yǎng)計劃

作者簡介：李義霞，在讀碩士研究生，研究方向為果樹種質(zhì)資源與品種選育。E-mail：1542236952@qq.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：zhrgsh@163.com

果 樹 學(xué) 報 2024，41（5）： 941-955

Journal of Fruit Science

Effect of exogenous IAA on the growth and development of walnut endocarp

LI Yixia1， 2， 3， YU Shangqi1， 2， GUO Zhongzhong1， 2， 3， FU Jiazhi1， 2， 3， LU Hongli1， 2， 3， WANG Hongxia4， ZHANG Rui1， 2， 3*， Mutellip1， 2， 3

（1The National-Local Joint Engineering Laboratory of High Efficiency and Superior-Quality Cultivation and Fruit Deep Processing Technology on Characteristic Fruit Trees， Alar 843300， Xinjiang， China; 2Key Laboratory for the Protection and Utilization of Biological Resources in the Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps， Alar 843300， Xinjiang， China; 3College of Horticulture and Forestry， Tarim University， Alar 843300， Xinjiang， China; 4Hebei Institute of Mountain Research， Hebei Agricultural University， Baoding 071033， Hebei， China）

Abstract： 【Objective】 The accumulation of lignin is the main events of walnut endocarp development， and plant hormones regulate the formation of thick-walled tissues and the synthesis of lignin， which involves in xylem development， through the expression of related genes， thus affecting the development of the secondary wall. The study was carried out in order to understand the effect of the growth hormone IAA on the development of endocarp in walnuts. 【Methods】 In the present study， we selected the 16 year old trees with robust and consistent growth and consistent levels of water and fertilizer management. At about 50 d after flowering， bearing spurs were wrapped and treated with different concentrations of growth regulators. Changes in lignin deposition in the endocarp of walnuts after the treatments with different concentrations of IAA was observed by resorcinol staining， and the contents of lignin， cellulose， hemicellulose， and IAA in the endocarp were determined. At the same time， samples at 12 d after IAA treatment were subjected to high-throughput sequencing and analysis. 【Results】 The results showed that at the early stage of treatment there was a significant difference in the accumulation of endocarp lignin between the treatments with differential IAA concentrations. Lignin deposition started from tissues near the vascular bundles， and the color shifted from light red to dark red and from localized staining to overall staining. At the late stage， the endocarp of the late walnuts was partially hardened and significantly thickened， but the development of the endocarp was incomplete， and the dewy kernel was still present. Lignin content in the endocarp increased significantly after the treatments with 50 mg·L-1 IAA and 100 mg·L-1 IAA at the 12th d after treatment， and the difference in lignin content was not significant between the control and the treatment with 200 mg·L-1. In the late stages， low concentration IAA treatment promoted lignin accumulation and lignin content increased slowly， but lignin content in treatments high concentrations was lower than that in the control. The overall endocarp cellulose content showed an increasing trend， compared with the control. The pre-cellulose content in the treatments was higher than in the control. Compared with the control， the overall endocarp hemicellulose content showed an increasing trend. The endogenous IAA content in walnut endocarp after different concentrations of IAA treatments showed an overall increasing trend. On the 12th d after treatment， the endogenous IAA content in the treatments with 50 mg·L-1 IAA and 100 mg·L-1 IAA was significantly higher than that in the control. It was 37.77 ng·g-1 in the treatment with 50 mg·L-1 IAA， which was 24.2% higher than that of the control， and 100 mg·L-1 IAA treatment had a IAA content 21.5% higher than that in the control. Treatments with 150 mg·L-1 IAA and 200 mg·L-1 IAA were lower than the control. Therefore， with the increase in concentration exogenous IAA， the endogenous IAA content showed a decreasing trend. The number of differentially expressed genes between 50 mg·L-1 IAA treatment and the control was the largest， with 3292 genes， of which 1922 were up-regulated and 1370 down-regulated， and the number of common differential genes among the treatments with different concentrations were 591 based on the Veen diagram. GO enrichment and KEGG enrichment analyses revealed that the phytohormone signaling pathway was the common metabolic pathway， and the phenylpropane biosynthesis pathway was significantly altered with the increase in IAA concentration， but it was not enriched in the treatments with 150 mg·L-1 IAA and 200 mg·L-1 IAA. It was initially hypothesized that there were significant differences in the phytohormone signaling and phenylpropane biosynthesis metabolic pathways in the endocarp of walnuts after exogenous application of IAA. The genes related to the two pathways， which were differentially expressed， were gradually down-regulated or non-expressed with the increase in IAA concentration. 【Conclusion】 The results showed that IAA affected the accumulation of lignin in the endocarp as well as the expression of genes in the lignin synthesis pathway. The results provided reference for the later study to explore the mechanism of the effect.

Key words： Walnuts; Endocarp; IAA; Lignin; High throughput sequencing

隨著核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，受品種特性及外界環(huán)境的影響，一些核桃品種出現(xiàn)了內(nèi)果皮發(fā)育不完整、局部組織缺失的現(xiàn)象，導(dǎo)致核仁裸露，影響采后運輸、加工和儲藏等，進而影響種仁的品質(zhì)與營養(yǎng)，其中新露核桃露仁特性較為突出（圖1-A），果實形狀近橢圓形，平均堅果殼厚度為1.28 mm，種仁易分離。

木質(zhì)素的積累是核桃內(nèi)果皮生長發(fā)育的重要過程，也是植物細胞壁中發(fā)揮較強機械支撐作用的結(jié)構(gòu)因子之一[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，影響細胞壁形成的因素眾多，其中激素起突出作用[2-3]，能夠通過參與木質(zhì)部發(fā)育對相應(yīng)的基因進行表達和調(diào)節(jié)，進而影響到次生壁的形成[4-5]。乙烯和生長素可促進棉花胚珠細胞壁的沉積，此外，乙烯和生長素反應(yīng)減少，會促進纖維素生物合成，促使細胞壁形成[6]。菊花莖節(jié)間中CmHLB基因的表達量與木質(zhì)素含量、莖稈強度的增加趨勢相一致[7]。AP2/ERF可以調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成和木質(zhì)部細胞分化，改變白楊木質(zhì)素和纖維素的組成[8]，轉(zhuǎn)錄因子ARF3、ARF6結(jié)合編碼4CL、CCoAOMT2基因的啟動子區(qū)域激活其轉(zhuǎn)錄水平，促進木質(zhì)素的合成。不同濃度的生長素對細胞壁形成的影響程度不同，例如，在擬南芥和百日草中，生長素刺激葉肉細胞分化為木質(zhì)部管狀細胞，同時抑制花粉細胞壁的增厚[9]；外源IAA取代頂端莖誘導(dǎo)向日葵形成層細胞分裂和次生木質(zhì)部分化；此外，生長素的濃度梯度在發(fā)育中的木材組織中保持不變，為分生組織的發(fā)育提供位置信息[10]，已在擬南芥根和莖分生組織的發(fā)育中證實[11]。維管形成層是運輸生長素的主要腔室[12]，PttPIN1和PttPIN2基因表達位于形成層分生組織和擴張的木質(zhì)部衍生物，而其在楊樹莖生長素的極地運輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。蔣旭等[14]通過試驗證明MsNS能夠調(diào)控植物木質(zhì)素和纖維素的合成，對于白樺，外源GA3通過上調(diào)NAC和MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控CESA、PAL和GA氧化酶等基因的表達，從而促進木質(zhì)部的發(fā)育[15]，噴施適宜濃度的MeJA和茉莉酸甲酯可提高根系內(nèi)源激素和木質(zhì)素含量，增強植株的抗逆性和PAL活性，PAL、C4H、CCR1和CAD2基因在煙葉木質(zhì)素的合成和積累中起關(guān)鍵調(diào)控作用[16-17]；葉面噴施適宜濃度的多效唑[18]，可通過阻抑IAA合成，從而抑制幼苗縱向生長，使植株變矮，并增強抗性。IAA可提高臨滄云煙和菜豆豆莢中木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶的活性從而促進木質(zhì)素合成[19-20]。

前期研究表明，在早期新露核桃內(nèi)果皮殼質(zhì)態(tài)中IAA濃度遠低于肉質(zhì)態(tài)中的濃度，硬化的后期又開始升高[21]，且木質(zhì)素對核桃內(nèi)果皮的形成、核桃品質(zhì)的改善起至關(guān)重要的作用，不同的外源激素處理對木質(zhì)素積累作用不同。因此，筆者在本研究中探討IAA與核桃內(nèi)果皮形成的關(guān)系，為減少露仁的發(fā)生提供理論依據(jù)，制定合理的生產(chǎn)措施。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料新露（露仁品種）采自于阿克蘇地區(qū)溫宿縣實驗林場。選取樹齡均為16 a（年），株行距為5 m×6 m，生長健壯一致、水肥管理水平一致的樹體。于花后約50 d（2022年6月3日）硬化期剛開始時，使用不同質(zhì)量濃度（0、50、100、150、200 mg·L-1 IAA）的生長素，選取果實大小基本一致的短結(jié)果枝，在靠近果實的短果枝頂部上側(cè)，用手術(shù)刀刮去約0.5 cm×2.0 cm大小的外表皮。用棉棒蘸取適量激素均勻涂抹在傷口上，并用浸泡過激素的脫脂棉將傷口填充，用封口膜包裹傷口，使傷口與外界環(huán)境隔離。從首次激素處理開始，每隔12 d采摘1次果實，直至硬化期結(jié)束，共采樣4次。采集的果實全部在低溫?zé)o菌條件下分離出內(nèi)果皮硬化組織作為試驗樣本，將各樣本材料迅速切至顆粒狀，液氮速凍后放至超低溫冰箱保存，將部分樣本送至深圳微科盟科技集團有限公司進行測序，并對所得的數(shù)據(jù)進行分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 木質(zhì)素沉積變化分析 采用間苯三酚染色法[21]觀察內(nèi)果皮木質(zhì)素沉積變化。

1.2.2 木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量測定 分別取經(jīng)不同質(zhì)量濃度生長素IAA處理后的內(nèi)果皮硬化組織樣本，參考趙玉雪等[22]的方法測定木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量。

1.2.3 內(nèi)源IAA含量測定 參考燕雪蒙[23]的方法，測定IAA含量。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序 委托深圳微科盟科技集團有限公司對經(jīng)50、100、150、200 mg·L-1 IAA處理后的12 d核桃內(nèi)果皮樣品和對照組核桃內(nèi)果皮進行轉(zhuǎn)錄組測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 IAA對核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素沉積變化的影響

采用間苯三酚染色法觀察核桃硬化期內(nèi)果皮木質(zhì)素沉積的變化，如圖1-B所示，核桃內(nèi)果皮在硬化過程中，木質(zhì)素的沉積發(fā)生了顯著變化。硬化初期，木質(zhì)素從靠近維管束的位置先開始沉積，顏色從淺紅轉(zhuǎn)為深紅，從局部染色轉(zhuǎn)為整體染色，直到硬化期結(jié)束核桃的硬殼完全形成。在經(jīng)過IAA處理12 d之后，低質(zhì)量濃度IAA處理和高質(zhì)量濃度IAA處理的效果存在明顯差異，特別是在接近縫合線的區(qū)域，首次呈現(xiàn)出粉紅色，而且這種顏色的深淺不一，這表明內(nèi)果皮已經(jīng)開始沉淀木質(zhì)素。在24 d時，木質(zhì)素還未大量積累，僅在內(nèi)果皮和中果皮的交界處呈現(xiàn)。相較于對照組，50 mg·L-1 IAA和100 mg·L-1 IAA處理后的核桃內(nèi)果皮的木質(zhì)素沉積染色區(qū)域明顯增加，而高濃度IAA處理效果不顯著，染色區(qū)域的面積較小。IAA處理36 d，核桃的內(nèi)部果皮已經(jīng)大致呈現(xiàn)出粉紅色，這表明此刻已經(jīng)積累了大量的木質(zhì)素，并且與對照組相比，在低質(zhì)量濃度IAA處理后，木質(zhì)素的積累不明顯。處理后48 d，核桃內(nèi)果皮完全硬化，并且明顯變厚，顏色也更深。雖然核桃內(nèi)果皮中有大量木質(zhì)素沉積，但是發(fā)育并不完整，存在露仁的情況，表明50 mg·L-1 IAA處理后，前期可促進核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素的積累，150 mg·L-1 IAA和200 mg·L-1 IAA處理后不同程度地抑制木質(zhì)素的積累，后期作用并不明顯。

2.2 IAA對核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量的影響

核桃內(nèi)果皮的生長發(fā)育主要包括細胞的分裂、木質(zhì)化，以及木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等物質(zhì)含量積累，最終形成厚壁組織。如圖2所示，處理后12 d，與對照相比，50 mg·L-1 IAA和100 mg·L-1 IAA處理后內(nèi)果皮木質(zhì)素含量顯著增加，200 mg·L-1 IAA處理后，木質(zhì)素含量與對照差異不明顯。處理后期，低質(zhì)量濃度IAA處理促進木質(zhì)素積累，木質(zhì)素含量緩慢增加，高質(zhì)量濃度IAA處理后內(nèi)果皮木質(zhì)素含量低于對照。內(nèi)果皮中纖維素含量整體呈上升趨勢，與對照相比，不同質(zhì)量濃度的IAA處理后，前期纖維素含量均高于對照；24 d時，50 mg·L-1 IAA處理纖維素含量（w，后同）最高，達到12.49%，36 d時，50 mg·L-1 IAA、100 mg·L-1 IAA處理纖維素含量呈上升趨勢，150 mg·L-1 IAA和200 mg·L-1 IAA處理纖維素含量顯著低于對照；48 d時，IAA處理纖維素含量均低于對照。內(nèi)果皮中半纖維素含量整體呈上升趨勢，與對照相比，不同質(zhì)量濃度的IAA處理后半纖維素含量高于對照，在36 d時，200 mg·L-1 IAA處理半纖維素含量變化上升速率最大且含量最高，之后速率有所降低，在48 d時，50 mg·L-1 IAA處理＞100 mg·L-1 IAA處理＞150 mg·L-1 IAA處理＞200 mg·L-1 IAA處理＞對照，半纖維素含量在13%～16%范圍內(nèi)變化。

2.3 IAA對核桃內(nèi)果皮內(nèi)源IAA含量的影響

不同質(zhì)量濃度IAA處理后核桃內(nèi)果皮的內(nèi)源IAA含量整體呈上升趨勢（圖3）。處理后12 d，50 mg·L-1 IAA和100 mg·L-1 IAA處理后的核桃內(nèi)果皮內(nèi)源IAA含量顯著高于對照，50 mg·L-1 IAA處理后內(nèi)果皮中IAA含量達到37.77 ng·g-1，比對照高24.2%，100 mg·L-1 IAA處理后比對照高21.5%，150 mg·L-1 IAA和 200 mg·L-1 IAA較對照低，且隨著質(zhì)量濃度的升高，IAA含量呈下降趨勢；處理后24 d，50 mg·L-1 IAA處理后，內(nèi)果皮中IAA含量顯著高于對照，比對照高8.4%；處理后期，各處理間與對照差異小，但均高于對照?？傮w來說，各處理間與對照差異小，表明外源激素對內(nèi)源IAA含量在處理后前期有一定的作用，后期作用減弱。

2.4 內(nèi)果皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

為了解經(jīng)IAA處理后核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程中基因的表達情況，以外源激素處理后12 d的核桃內(nèi)果皮為樣品構(gòu)建cDNA文庫，對3個生物重復(fù)（總共15個樣本）進行RNA-Seq分析，用fastp軟件對每一個樣本的測序數(shù)據(jù)rawdata做質(zhì)控處理，將測序得到的raw reads中的接頭序列和低質(zhì)量的reads去除后，獲得clean reads，測序結(jié)果如表1所示，Q30的堿基比均大于93%，GC含量在45.23%～45.76%，表明所獲得的測序數(shù)據(jù)具有高品質(zhì)和高可靠性。

2.5 差異表達基因分析

分別以不同質(zhì)量濃度的生長素IAA與對照（清水）處理兩兩之間進行相互比較篩選差異基因，分別為50 mg·L-1 vs 對照、100 mg·L-1 vs 對照、150 mg·L-1 vs 對照、200 mg·L-1 vs 對照4組。如圖4所示，50 mg·L-1 IAA vs 對照處理后差異表達基因數(shù)量最多，為3292個，其中上調(diào)表達的基因有1922個，下調(diào)表達的基因有1370個；200 mg·L-1 IAA處理后差異表達基因總數(shù)最少，為2263個，且上調(diào)表達的基因有1198個，下調(diào)表達的基因有1265個；通過Veen圖進一步比較4個不同質(zhì)量濃度的IAA處理間的核心差異基因組，發(fā)現(xiàn)不同濃度間的共同差異表達基因有591個。

2.6 差異基因富集分析

2.6.1 差異表達基因GO富集分析 對差異基因進行GO富集分析，如圖5所示，每個IAA處理主要展示顯著富集的15個條目，通過對比發(fā)現(xiàn)，4種處理后細胞組分均富集在膜的錨定成分。隨著IAA質(zhì)量濃度的增加，生物過程富集條目發(fā)生了顯著變化，50 mg·L-1 IAA和100 mg·L-1 IAA處理共同包含5個功能組分，分別是次生代謝產(chǎn)物生物合成過程、細胞壁生物生成、植物型細胞壁生物生成、木質(zhì)素代謝和木質(zhì)素生物合成過程；150 mg·L-1 IAA處理包含有機陰離子轉(zhuǎn)運、線粒體轉(zhuǎn)運、側(cè)根發(fā)育、碳水化合物衍生物轉(zhuǎn)運、碳水化合物跨膜轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)定位、有機磷酸酯轉(zhuǎn)運、線粒體跨膜運輸、種子成熟和線粒體蛋白質(zhì)定位的建立；200 mg·L-1 IAA處理包含碳水化合物生物合成過程、次生代謝過程、對光的反應(yīng)、線粒體運輸、碳水化合物衍生物運輸、類固醇生物合成過程、細胞生長、線粒體跨膜轉(zhuǎn)運和線粒體蛋白質(zhì)定位的建立。50 mg·L-1 IAA處理后分子功能富集在單氧化酶活性和氧化還原酶活性，100 mg·L-1 IAA處理包含轉(zhuǎn)移糖基和轉(zhuǎn)移己糖基功能，150 mg·L-1 IAA處理包含羧酸跨膜轉(zhuǎn)運體活性、碳水化合物衍生物跨膜轉(zhuǎn)運體活性、核堿基跨膜轉(zhuǎn)運體活性功能中，200 mg·L-1 IAA處理后包含單氧化酶活性、碳水化合物衍生物結(jié)合和多糖結(jié)合功能組分。

2.6.2 KEGG富集分析 如圖6所示，不同質(zhì)量濃度生長素IAA處理后，核桃內(nèi)果皮發(fā)育過程代謝途徑發(fā)生了變化，隨著質(zhì)量濃度的升高，50 mg·L-1 IAA處理后，差異基因較多富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、MAPK信號通路—植物、淀粉和蔗糖代謝、ABC轉(zhuǎn)運體、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等其他代謝途徑；100 mg·L-1 IAA處理后富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代謝、MAPK信號通路—植物和氨基酸糖和核苷酸糖代謝核苷酸糖的生物合成、黃酮類化合物的生物合成等其他代謝途徑；150 mg·L-1 IAA處理后，富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、核苷酸糖生物合成、類黃酮生物合成和光合作用等其他途徑中；200 mg·L-1 IAA處理后，富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、碳代謝、淀粉和蔗糖代謝、MAPK信號通路-植物和糖代謝等多個代謝途徑中。

綜上所述，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是共同代謝通路，隨著質(zhì)量濃度的增加，苯丙烷生物合成途徑發(fā)生了顯著改變，150 mg·L-1 IAA和200 mg·L-1 IAA處理中未富集，說明苯丙烷生物合成途徑也是主要的代謝通路。

2.7 外源激素調(diào)控苯丙烷生物合成與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因篩選

根據(jù)前期的試驗結(jié)果初步推測核桃內(nèi)果皮經(jīng)外源施加生長素后在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和苯丙烷生物合成表達上存在明顯的差異，因此對上述兩條途徑的相關(guān)基因進行統(tǒng)計分析。以log2FC的絕對值≥ 1且q值＜0.05作為標準，如圖7-A所示，50 mg·L-1 IAA處理后，有60個差異表達基因參與苯丙烷生物合成途徑，48個差異基因參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖7-B）；在參與苯丙烷生物合成途徑的主要酶類基因（23個）中，有2個4-香豆素-CoA連接酶基因（4CL）、2個咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）基因和6個苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因在不同質(zhì)量濃度IAA處理下均上調(diào)，且隨著質(zhì)量濃度的升高，基因表達逐漸下調(diào)，其中COMT（LOC108984894）基因僅在50 mg·L-1 IAA處理后顯著上調(diào)表達，高質(zhì)量濃度處理下不表達（圖8-A）。4-單加氧酶樣反式肉桂酸酯（LOC108996947）基因僅在50 mg·L-1 IAA處理中下調(diào)表達，另一個C4H基因在低質(zhì)量濃度中不表達，高質(zhì)量濃度中上調(diào)表達。所有參與苯丙烷代謝途徑的差異基因中，有4個過氧化物酶基因（LOC109007078、LOC109013790、LOC109011944和LOC108981442）和1個咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（LOC109019627）在4種處理中均表達（圖8-B）。

在生長素信號通路中，施加IAA后，2個生長素轉(zhuǎn)運蛋白（PIN）、生長素誘導(dǎo)蛋白（AUX）、生長素反應(yīng)因子（IAA）和1個SAUR上調(diào)，2個PIN、4個AUX、12個IAA和5個SAUR基因下調(diào)（圖8-E）。在ABA信號通路中，5個蛋白磷酸酶基因（PP2C-24、PP2C-75、PP2C-37、PP2C-51和PP2C-56）在4種質(zhì)量濃度處理中均上調(diào)表達；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BSK7基因在50 mg·L-1 IAA處理、100 mg·L-1 IAA處理和150 mg·L-1 IAA處理中均上調(diào)表達，200 mg·L-1 IAA處理中不表達，另一個基因LOC109011144僅在50 mg·L-1 IAA處理中上調(diào)（圖8-D）。赤霉素受體GID1B在4個處理中均下調(diào)表達，3個蛋白質(zhì)TIFY、1個MYC轉(zhuǎn)錄因子、9個水楊酸PR蛋白和1個乙烯反應(yīng)因子ERF僅在50 mg·L-1 IAA處理中表達（圖8-F）。

3 討 論

生長素是一種在低濃度時促進植物生長發(fā)育的有機物質(zhì)，調(diào)節(jié)植物的許多發(fā)育過程，包括細胞的擴張、根的起始、維管組織的分化、芽和花的生長；生長素也是控制根生長、根向地性和維管分化的主要植物激素[24]。核桃內(nèi)果皮在堅果的生長發(fā)育、加工、運輸及貯藏中起著重要的作用。鄭志鋒等[25]對核桃內(nèi)果皮的化學(xué)成分檢測結(jié)果表明，在核桃的內(nèi)果皮中存在大量的木質(zhì)素，同時說明木質(zhì)素是構(gòu)成核桃內(nèi)果皮的重要成分；李夕勃等[26]根據(jù)對各個核桃品種的硬殼構(gòu)造及硬殼中木質(zhì)素濃度的檢測數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素濃度越高，核桃堅果的縫合線越嚴密、硬殼越硬、硬殼就越厚，筆者在本研究中通過間苯三酚染液對核桃切片進行染色后，發(fā)現(xiàn)前期與對照相比，經(jīng)低質(zhì)量濃度IAA處理后內(nèi)果皮著色部位及顏色均增加，在靠近縫合線的地方開始出現(xiàn)粉紅色，且程度不同，說明內(nèi)果皮中木質(zhì)素開始沉積；處理后24 d，可觀察到在內(nèi)果皮與中果皮交接位置出現(xiàn)淡黃色果殼，但木質(zhì)素尚未出現(xiàn)大量沉積，僅在堅果頂部和底端沉積，而高質(zhì)量濃度IAA處理后效果并不明顯，相比之下，染色部位較少。生長素可以刺激木質(zhì)部組織分化，外源IAA誘導(dǎo)形成層分裂，從而促進木質(zhì)部組織分化。在辣椒和茄屬植物中，生長素促進了次生木質(zhì)部的生長，而生長素抑制劑則完全或部分表現(xiàn)出相反的特征。本研究中，通過測定內(nèi)果皮中木質(zhì)素的含量，所得結(jié)果與間苯三酚染色結(jié)果基本一致。不同的激素處理對木質(zhì)素含量有不同的影響，先前的研究表明，低質(zhì)量濃度IAA處理會增加木質(zhì)素含量。木質(zhì)素沉積主要存在于增厚細胞壁，是植物細胞壁的重要組成部分，它的主要功能是提供機械支持和水的運輸[27]。高沉積量阻礙了胡蘿卜主根的味道、質(zhì)地和質(zhì)量，而木質(zhì)素含量的下降可能會影響植物的生長和發(fā)育[28]，IBA處理降低了胡蘿卜的木質(zhì)素含量。當用NAA處理大豆下胚軸時，也觀察到了類似的結(jié)果，此外，經(jīng)IBA處理的肉桂扦插植株的木質(zhì)素含量有所下降。在核桃內(nèi)果皮生長發(fā)育過程中，纖維素也是構(gòu)成次生壁的因子之一，在馬尾松木質(zhì)部組織中顯著上調(diào)表達，外源IAA可顯著增加纖維素含量和木質(zhì)素含量[29]。在本研究中，內(nèi)果皮中纖維素含量整體呈上升趨勢，與對照相比，不同質(zhì)量濃度IAA處理后，前期纖維素含量均高于對照；24 d時，50 mg·L-1 IAA處理纖維素含量最高。且筆者課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn)，薄殼品種溫185和新新2核桃在經(jīng)不同濃度IAA處理后，核桃果殼厚度和硬殼機械強度均增加，其中50 mg·L-1 IAA處理效果最佳[30]。經(jīng)高質(zhì)量濃度的IAA處理后核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素含量增加趨勢減緩，且根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，低質(zhì)量濃度IAA處理后，篩選出的與木質(zhì)素途徑相關(guān)的差異基因數(shù)量較高質(zhì)量濃度多，推測IAA處理對木質(zhì)素的含量有一定的影響，但是IAA在核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素相關(guān)基因表達和木質(zhì)素積累中的機制尚不清楚。

生長素對植物次生生長有重要的影響，且與植物生長發(fā)育過程密切相關(guān)[31]，外源施加IAA，短時間內(nèi)顯著影響高粱內(nèi)源激素的含量。低質(zhì)量濃度IAA處理促進杉木苗高生長，高質(zhì)量濃度IAA抑制苗高生長[32]；噴施低質(zhì)量濃度IAA使葉用萵苣植株內(nèi)源IAA含量顯著增加，高質(zhì)量濃度IAA處理后，作用并不明顯，但促進IAA含量達到峰值[33]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同質(zhì)量濃度IAA處理12 d后，核桃內(nèi)果皮中內(nèi)源IAA含量發(fā)生顯著變化，其中50 mg·L-1 IAA和100 mg·L-1 IAA處理后，內(nèi)源激素IAA含量顯著增加，150 mg·L-1 IAA處理后與對照相比無明顯作用，但200 mg·L-1 IAA處理后，內(nèi)源IAA含量比對照低，推測可能是通過影響其他的內(nèi)源激素含量來調(diào)控核桃內(nèi)果皮的生長發(fā)育。處理36 d開始，不同質(zhì)量濃度IAA處理核桃內(nèi)果皮中內(nèi)源IAA含量均呈上升趨勢，推測外源IAA影響內(nèi)源IAA含量的變化，進而影響內(nèi)果皮的發(fā)育。

通過前期的研究可知PAL、C4H、4CL、CAD是木質(zhì)素合成過程中的關(guān)鍵酶基因，筆者在本研究中找到74個差異顯著基因，大部分基因編碼參與苯丙烷生物合成途徑的幾個主要酶，從log2倍變化值熱圖可看出，4CL、COMT和PAL基因在不同質(zhì)量濃度IAA處理下均上調(diào)，且隨著濃度的升高，基因的表達量呈下降趨勢；在這些主要的酶基因中有4個COMT（LOC108996985、LOC109007527、LOC108984504、LOC108984894）基因、4個PAL（LOC108988497、LOC108995854、LOC109017562、LOC118349731）基因、1個C4H（LOC108996947）基因和1個CAD（LOC109014223）基因僅在50 mg·L-1 IAA處理后顯著表達，高質(zhì)量濃度處理下不表達，其中COMT（LOC108984894）基因在50 mg·L-1 IAA處理后極顯著高表達；推測這些在低質(zhì)量濃度IAA處理后表達，在高質(zhì)量濃度IAA處理后低表達或不表達的基因，可能就是調(diào)控木質(zhì)素合成的主要基因。在所有參與該途徑的差異基因中，有4個POD基因和COMT基因在4種處理中均參與調(diào)節(jié)。在對臨滄云煙以及菜豆豆莢等試驗中發(fā)現(xiàn)，赤霉素和生長素等激素能夠提高木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶POD和PAL活性，從而促進木質(zhì)素合成，休眠期噴灑IAA使花芽中PAL活性增強[34]。通過抑制C4H的表達，降低橄欖[35]、毛竹[36]等植物中S型與G型木質(zhì)素單體比例，從而影響木質(zhì)素含量。不同濃度烯效唑和赤霉素處理通過調(diào)控EjCAD5的表達，延緩枇杷采后冷害木質(zhì)化，導(dǎo)致木質(zhì)素含量減少[37]。

植物生長調(diào)節(jié)劑可調(diào)控植物細胞和細胞壁的生長過程，影響植物的形態(tài)建成。許多植物基因組中的轉(zhuǎn)錄因子均參與多種生長發(fā)育過程，包括次生細胞壁的形成、生物和非生物脅迫反應(yīng)等[38]。研究表明，生長素響應(yīng)蛋白基因（IAA、ARF和SAUR）、生長素反應(yīng)蛋白基因（AUX1）、生長素反應(yīng)阻遏子（AUX/IAA）是IAA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因[39]。筆者在本研究中通過分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與生長素相關(guān)的19個基因，被注釋在Auxin transporter-like protein、auxin-induced protein、auxin-responsive protein、auxin-responsive protein SAUR等上，低質(zhì)量濃度IAA處理后，與生長素相關(guān)的大部分基因下調(diào)表達，隨著質(zhì)量濃度的升高，部分基因表達量降低或不表達。在擬南芥中，生長素通過“AtARF8.4-AtMYB26”途徑調(diào)控內(nèi)生植物的木質(zhì)化[40]。AtARF17通過在花藥開裂過程中直接激活A(yù)tMYB108來調(diào)控內(nèi)皮質(zhì)的木質(zhì)化[41]。在楊樹中，“PtoARF5-PtoHB7/8”信號級聯(lián)介導(dǎo)了早期木材發(fā)育過程中生長素觸發(fā)的木質(zhì)部細胞分化[42]；而AtARF2的同源物PtrARF2.1則影響木質(zhì)素的生物合成[43]。在水稻中，OsARF6/17通過調(diào)節(jié)葉片關(guān)節(jié)中次生細胞壁的生物合成來控制旗葉角[44]。

綜上所述，筆者在本研究中明確了外源施用IAA對核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素積累的影響，并引起木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量和內(nèi)源激素含量的變化，促進內(nèi)果皮的發(fā)育。在轉(zhuǎn)錄水平上，低質(zhì)量濃度IAA處理下，誘導(dǎo)相關(guān)基因進行物質(zhì)交流和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使得積累大量木質(zhì)素，并引起MYC、PIF等轉(zhuǎn)錄因子的變化。外源施用IAA后，主要引起了植物激素信號途徑和木質(zhì)素合成途徑的變化，誘導(dǎo)了相關(guān)基因的表達，但具體影響機制還有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

通過對新露核桃進行不同質(zhì)量濃度生長素IAA處理，與對照相比，發(fā)現(xiàn)50 mg·L-1 IAA和100 mg·L-1 IAA對核桃內(nèi)果皮木質(zhì)素的積累起顯著促進作用，150 mg·L-1 IAA和200 mg·L-1 IAA抑制木質(zhì)素的合成，主要表現(xiàn)在木質(zhì)素沉積、木質(zhì)素、纖維素和內(nèi)源IAA含量等方面，表明外源IAA對核桃內(nèi)果皮的發(fā)育不完整有一定的作用。通過轉(zhuǎn)錄組測序，差異基因主要富集在苯丙烷生物合成途徑和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，且隨著質(zhì)量濃度的增加，與木質(zhì)素合成和生長素相關(guān)的部分差異基因表達量降低或不表達。

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