不同破眠處理對(duì)陽(yáng)光玫瑰葡萄冬芽萌發(fā)的影響

饒余倩 黃亞倩 夏龍騰 楊國(guó)順 王美軍 劉昆玉 許延帥

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230456

摘??? 要：【目的】尋找陽(yáng)光玫瑰葡萄理想安全的破眠方法以及探究其破眠機(jī)制?！痉椒ā恳躁?yáng)光玫瑰葡萄冬芽為試材，通過(guò)研究類休眠階段和生理休眠階段不同破眠處理對(duì)葡萄萌芽率、成花率和花穗質(zhì)量的影響，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選可能影響葡萄冬芽萌發(fā)的關(guān)鍵基因?！窘Y(jié)果】在萌芽前1個(gè)月對(duì)陽(yáng)光玫瑰葡萄冬芽進(jìn)行單氰胺處理、石硫合劑+1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）處理，均能使萌芽提前，顯著提高萌芽率，不影響成花率及花穗質(zhì)量。通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選了PYL4、PP2C24、PP2C8、PP2C37、PP2C25、SAPK2等差異表達(dá)基因，這些基因可能通過(guò)參與激素信號(hào)傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激等途徑影響葡萄芽的萌發(fā)?！窘Y(jié)論】5 °Bé石硫合劑+0.25 mg·mL-1ACC是陽(yáng)光玫瑰葡萄打破休眠的一種安全、有效的處理方法。

關(guān)鍵詞：葡萄；休眠；萌芽；轉(zhuǎn)錄組

中圖分類號(hào)：S663.1?????????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??????????? 文章編號(hào)：1009-9980（2024）05-0897-14

收稿日期：2023-11-02??????? 接受日期：2024-02-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32172519）；湖南省自然科學(xué)區(qū)域聯(lián)合基金（2023JJ50063）

作者簡(jiǎn)介：饒余倩，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡?shù)生理與栽培。E-mail：1248780906@qq.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：yx56@hunau.edu.cn

果 樹(shù) 學(xué) 報(bào) 2024，41（5）： 897-910

Journal of Fruit Science

Effects of different bud dormancy breaking treatments on winter bud germination in Shine Muscat grapevines

RAO Yuqian1， HUANG Yaqian1， XIA Longteng2， YANG Guoshun1， WANG Meijun1， LIU Kunyu1*， XU Yanshuai1*

（1College of Horticulture， Hunan Agricultural University/Hunan Engineering and Technology Research Center for Grapes， Changsha 410128， Hunan， China; 2Yongzhou Citrus Scientific Research Institute， Yongzhou 425045， Hunan， China）

Abstract： 【Objective】 This study aimed to find an ideal and effective bud dormancy break method for Shine Muscat grapevines and to explore the gene expression level of bud dormancy break by using H2CN2 and “l(fā)ime sulfur mixture+ACC”. 【Methods】 By using the winter buds on Shine Muscat grapevines as materials， we studied the effects of different bud dormancy breaking treatments in the endodormancy stage and paradormancy stage on germination rate， flowering rate and inflorescence quality， and examined the possible effects on grape winter buds through transcriptome sequencing， and the key genes that may affect grape winter bud germination were screened through transcriptome sequencing. 【Results】 The winter buds on the isolated canes of the Shine Muscat grape at the endodormancy stage were treated with cyanamide （T1） and “l(fā)ime sulfur mixture+ACC” （T2） at one month before germination stage. The results showed that with T1 treatment grapevines sprouted earliest， followed by T2 treatment， and finally was the control （CK）. The overall germination speed of each treatment showed a trend of “first-slow-and-then-fast”. In terms of germination rate， the germination rate with T2 treatment was the highest at 85.80%， followed by T1 treatment and CK， with germination rates being 81.48% and 66.05%， respectively. And the germination rates after T1 treatment and T2 treatment were significantly higher than those of the CK. The growth and development dynamics of winter buds on isolated canes were observed， and it was found that the winter buds treated with T1 and T2 all grew 2 to 3 new leaves on March 21， 2022. T1 treatment sprouted the earliest， and T1 and T2 sprouted more neatly; In the Control group， 2 to 3 new leaves grew on April 2， 2022， and the growth was relatively slow and the sprouts were irregular. In August 2022， cyanamide treatment （H2CN2， T1） and “l(fā)ime sulfur mixture+ACC” treatment （T2） was carried out on the winter buds of Shine Muscat grapevines at the paradormancy stage， and the results showed that with T1 treatment， grapevines sprouted earliest， followed by the CK and T2 treatment. The germination speed with each treatment showed a trend of “first-slow-and-then-fast” as well. The germination rate of T2 treatment was the highest， which was 69.70%， followed by T1 treatment and CK group， with germination rates being 65.66% and 41.41%， respectively. The germination rate of T1 and T2 treatment was significantly higher than that of the CK group. In February 2023， by treating the winter buds of Shine Muscat grapevines at the endodormancy stage with cyanamide （T1） and “l(fā)ime sulfur mixture+ACC” （T2）， the results showed that the T2 treatment had the highest germination rate of 97.22%， followed by T1 treatment and CK group， with the germination rates being 96.43% and 76.19%， respectively. From 25 days after treatment to the end of counts， the germination rate of T1 and T2 treatments showed significantly higher level than the CK. There was no significant difference in the inflorescence rate between T1 and T2 treatments， and CK. Simultaneously， the length of inflorescence was not influenced as well. The growth status of the canes was observed， and the results showed that， compared with the CK， the leaves grew fastest after the T1 treatment on April 3， 2023， followed by T2 treatment. On April 29， 2023， the leaf growth rate， leaf size， and internode length after T1 and T2 treatments had no significant impact compared with the CK. Six samples at the endodormancy stage （winter buds were collected at 24 h and 72 h after CK， T1 treatment and T2 treatment） and six samples at the paradormancy stage （CK， T1 treatment and T2 treatment were collected at 24 h and 72 h after winter bud） for transcriptome analysis， a total of 4399 differentially expressed genes were obtained by using |log2fold changes|≥1， FDR＜0.01 as the filtering parameters， and 4399 significantly different genes （DEGs） can be divided into 8 clustering groups. Among all the DEGs， in W-CK-72 samples and W-HC-72 samples at the endodormancy stage， 10 genes were annotated as transcription factor coding genes， which were all related to bud germination. The transcription factors of them were up-regulated and 7 transcription factors were up-regulated. In addition， 10 genes were annotated as being involved in the biosynthesis or signal transduction processes of hormones such as auxin， gibberellins， abscisic acid and brassinosteroids. Five genes were related to the ABA signaling pathway， and among them， PYL4 and PP2C25 genes showed up-regulated expression， while PP2C24， PP2C8 and PP2C37 genes had down-regulated expression. The SAPK2 gene that related to the Snrk2 family was down regulated. The remaining differential genes screened were related to oxidative stress， glutathione S-transferase， etc. These candidate genes may affect grape bud germination by participating in hormone signaling， oxidative stress and other pathways. 【Conclusion】 The mixed solution of “l(fā)ime sulfur mixture+ACC” is a safe and effective agent for breaking the bud dormancy of Shine Muscat grapevines. Genes involved in hormone signaling and oxidative stress may respond to the dormancy release process.

Key words： Grape; Dormancy; Bud break; Transcriptome

葡萄（Vitis vinifera spp.）是多年生落葉藤本植物，栽培歷史悠久。中國(guó)是葡萄生產(chǎn)大國(guó)，2020年我國(guó)葡萄產(chǎn)量為1 431.4萬(wàn)t，居世界前列[1]。休眠是落葉果樹(shù)的典型特征，是植物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化和季節(jié)變化的一種生物適應(yīng)性，是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)周期性時(shí)期[2]。葡萄作為一種典型的落葉果樹(shù)，萌芽整齊度與產(chǎn)量密切相關(guān)[3]。南方地區(qū)是近年來(lái)發(fā)展最快的葡萄產(chǎn)區(qū)之一，但在南方地區(qū)，由于樹(shù)形培養(yǎng)管理（1年生枝條的培養(yǎng)）不當(dāng)和需冷量積累不足，導(dǎo)致萌芽不整齊，造成在后期冬季修剪和盛花期花果管理上更加費(fèi)時(shí)費(fèi)工等問(wèn)題。目前，單氰胺雖廣泛應(yīng)用于打破葡萄休眠，但其本身具有很強(qiáng)的毒性，使用過(guò)程中需要戴口罩、手套等，操作不便。因此，尋找一種可以有效打破休眠且理想安全的破眠方法尤為重要。

多年生落葉植物芽休眠是一種十分復(fù)雜的過(guò)程，受到多個(gè)通路基因的綜合調(diào)控[4]。當(dāng)植物芽開(kāi)始進(jìn)入休眠階段時(shí)，可以抵御外界不良的環(huán)境條件，暫時(shí)停止生長(zhǎng)，當(dāng)外界環(huán)境適宜時(shí)，植物可恢復(fù)正常生長(zhǎng)，是一種對(duì)植物有利的生物學(xué)特征。1987年，Lang[2]等根據(jù)休眠的誘因把芽休眠分為內(nèi)休眠、類休眠和生態(tài)休眠三大類，并將休眠的整個(gè)過(guò)程分為五個(gè)階段：類休眠、類休眠-內(nèi)休眠、內(nèi)休眠、內(nèi)休眠-生態(tài)休眠和生態(tài)休眠。內(nèi)休眠（生理休眠，endodormancy）發(fā)生在冬季，是由植物內(nèi)部原發(fā)性反應(yīng)引起的生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象，這種原發(fā)性反應(yīng)由休眠組織內(nèi)部信號(hào)獨(dú)自誘導(dǎo)引發(fā)[5]。處于內(nèi)休眠階段的芽，即使在有利的環(huán)境條件下，且沒(méi)有附近器官的限制，也不能萌動(dòng)，只有達(dá)到一定的低溫積累后才能解除休眠。類休眠（paradormancy）是由分生組織外的因子引起的植物生長(zhǎng)暫?，F(xiàn)象，本質(zhì)上是一個(gè)器官對(duì)另一個(gè)器官的影響，如芽的頂端優(yōu)勢(shì)[6]。處于類休眠階段的芽，即使在環(huán)境條件有利時(shí)仍保持休眠，但若除去相鄰器官的限制，則休眠結(jié)構(gòu)會(huì)迅速恢復(fù)生長(zhǎng)。生態(tài)休眠（ecodormancy）是指冬芽從生理休眠中釋放后，由于環(huán)境因子限制暫未萌發(fā)，環(huán)境條件適宜時(shí)即可迅速恢復(fù)生長(zhǎng)的現(xiàn)象[5]。

休眠和萌發(fā)是兩個(gè)連續(xù)的生物學(xué)過(guò)程，芽休眠是溫帶落葉果樹(shù)的一種適應(yīng)機(jī)制[5]。葡萄的內(nèi)休眠需要在經(jīng)歷一定的低溫積累后才能自然打破，這種特性稱為“需冷量”（chilling requirement），葡萄的需冷量一般需要0～7.2 ℃的低溫積累600～1000 h。為使落葉果樹(shù)能夠在低緯度地區(qū)正常生長(zhǎng)發(fā)育，人們通常通過(guò)使用氰氨類、硝酸鹽類、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（GA3、6-BA、TDZ等）、大蒜汁、乙烯、破眠劑1號(hào)等化學(xué)物質(zhì)來(lái)代替部分低溫的作用，提早打破休眠，使休眠芽提前萌發(fā)。

植物激素在芽休眠的形成與解除過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，不同的植物激素以不同的作用方式來(lái)誘導(dǎo)和解除芽休眠。ABA對(duì)萌芽有顯著的抑制作用。在梨[7]、藍(lán)莓[8]等多年生落葉果樹(shù)中，外源ABA可以促進(jìn)芽的休眠而抑制芽的萌發(fā)。在桃花芽的休眠過(guò)程中，ABA含量在生態(tài)休眠期逐漸降低并達(dá)到最低水平[9]。楊博等[10]研究表明，由PpyERF060、PpyABF3和PpyMADS71構(gòu)成的互作網(wǎng)絡(luò)可整合乙烯與脫落酸的信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控梨芽休眠進(jìn)程。玉米分蘗芽發(fā)生過(guò)程中，葉片與基部莖節(jié)中ABA含量較低且呈下降的趨勢(shì)，當(dāng)生長(zhǎng)停止時(shí)，ABA含量上升[11]。在楊樹(shù)上，轉(zhuǎn)錄因子SVL可以通過(guò)促進(jìn)CALS1（胼胝質(zhì)合酶基因）的表達(dá)，抑制赤霉素的合成，控制自然休眠[12]。在桃中，外施GA可以促進(jìn)桃葉內(nèi)休眠的解除[13]。梨花芽可能通過(guò)下調(diào)miR159表達(dá)，提高GA含量，促進(jìn)花芽冬季休眠解除[14]。乙烯對(duì)葡萄芽休眠解除起一定的促進(jìn)作用。在葡萄的研究中發(fā)現(xiàn)，外源乙烯處理使葡萄芽的萌發(fā)率顯著提高，而抑制乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，葡萄芽的萌發(fā)受到抑制，推測(cè)乙烯可以作為刺激信號(hào)，促進(jìn)葡萄芽休眠提前解除[15]。Khalil-Ur-Rehman等[16]的研究結(jié)果表明，ABA、乙烯、赤霉素、生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素均參與了葡萄芽類休眠和內(nèi)休眠的調(diào)控。

筆者對(duì)處于兩種冬芽休眠階段（類休眠階段和內(nèi)休眠階段）的陽(yáng)光玫瑰葡萄冬芽進(jìn)行不同破眠處理，以未處理作為對(duì)照，進(jìn)行單氰胺涂芽處理和石硫合劑+1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）涂芽處理。記錄和觀察處理后陽(yáng)光玫瑰葡萄冬芽的生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)，并統(tǒng)計(jì)其萌芽率、成花率及花穗質(zhì)量?；赗NA-seq分析，篩選不同休眠階段陽(yáng)光玫瑰葡萄冬芽破眠的相關(guān)基因，通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路分析，探索不同休眠階段陽(yáng)光玫瑰葡萄冬芽休眠解除的關(guān)鍵影響基因。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022—2023年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)基地內(nèi)進(jìn)行，供試品種為4年生陽(yáng)光玫瑰葡萄。栽培方式為起高壟式根域限制栽培，噴灌方式為微噴。試驗(yàn)所用試劑：石硫合劑（有效成分含量29%，山東東信生物農(nóng)藥有限公司）；單氰胺（有效成分含量50%，寧夏大榮化工冶金有限公司）；1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC，純度98%，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 冬季（內(nèi)休眠階段）冬芽破眠處理與樣品采集 2022年1月16日，對(duì)陽(yáng)光玫瑰基部留2芽修剪，收集基部起第3節(jié)位以上的枝條78根在室外進(jìn)行埋沙貯藏。于2022年2月28日選取3～11節(jié)位（9個(gè)冬芽）的枝條在自然條件下進(jìn)行涂芽處理（表1），每個(gè)處理26根枝條。分別在0 h、處理后24 h和72 h收集冬芽。樣品收集標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)處理隨機(jī)取4根枝條，收集每根枝條全部的冬芽，并迅速放入液氮中速凍，隨后保存在-80 ℃超低溫冰箱備用。

2023年2月16日，在6年生“飛鳥”架活體陽(yáng)光玫瑰葡萄樹(shù)上重復(fù)上述試驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果。

1.2.2 夏季（類休眠階段）冬芽破眠處理與樣品采集 2022年8月13日，將平棚架“一”字形陽(yáng)光玫瑰采收后的1年生主梢進(jìn)行摘葉處理，將主梢進(jìn)行第7節(jié)位短截后對(duì)其第5～7節(jié)位上的冬芽進(jìn)行不同破眠劑處理（處理方法同表1），每個(gè)處理53根枝條。分別在0 h、處理后24 h和72 h收集冬芽。樣品收集標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)處理隨機(jī)取10根枝條，每根枝條上取5～7節(jié)位上的3個(gè)芽，并迅速放入液氮中速凍，隨后保存在-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 以花芽出現(xiàn)明顯膨大、鱗片松動(dòng)、露綠較多作為萌發(fā)指標(biāo)，進(jìn)行冬芽萌芽率的統(tǒng)計(jì)?；ㄋ腴L(zhǎng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：一級(jí)花穗長(zhǎng)度≤3 cm；二級(jí)花穗長(zhǎng)度為3～10 cm；三級(jí)花穗長(zhǎng)度≥10 cm。

萌芽率/%=已萌動(dòng)的冬芽數(shù)/調(diào)查的冬芽數(shù)×100。

成花率/%=有花穗新梢數(shù)/已萌動(dòng)冬芽數(shù)×100。

1.2.4 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 將2022年2月28日、3月1日、3月3日和8月13日、8月14日、8月16日收集的冬芽樣品（表2）的RNA提取以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托百邁客生物科技有限公司（北京）完成。使用Nanodrop2000（賽默飛，Nanodrop2000）對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度檢測(cè)，并使用Agient2100，LabChip GX（廠家鉑，型號(hào)鉑金埃爾默LabChip GX）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)。樣品檢測(cè)合格后，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建：用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer將mRNA進(jìn)行隨機(jī)打斷；以mRNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈及其互補(bǔ)鏈，并經(jīng)過(guò)純化步驟去除；純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇；最后通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)。經(jīng)庫(kù)檢合格后，使用Illumina NovaSeq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行PE150模式測(cè)序。

1.2.5 差異表達(dá)基因的篩選和分析 首先對(duì)樣品中Mapped Reads的數(shù)目和轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化處理，根據(jù)FPKM值判定基因的相對(duì)表達(dá)量。不同樣本中表達(dá)水平存在顯著差異的基因稱之為差異表達(dá)基因（DEGs）。根據(jù)不同樣品之間表達(dá)水平的相對(duì)高低，差異表達(dá)基因可以分為上調(diào)基因（up-regulated gene）和下調(diào)基因（down-regulated gene）。使用edgeR軟件進(jìn)行差異分析，將|log2Fold Change|≥1且FDR＜0.01作為差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用百邁客分析平臺(tái)，導(dǎo)出基因在不同樣品中的功能注釋和相關(guān)代謝通路等信息，差異表達(dá)基因基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋并按照生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能對(duì)其富集分析，找出差異基因顯著富集的GO term和KEGG term。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)的采集和計(jì)算均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用Excel整理數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism8和R語(yǔ)言聚類程序作圖；采用SPSS26.0進(jìn)行單因素ANOVA分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同破眠處理對(duì)不同休眠階段葡萄萌芽和開(kāi)花的影響

不同破眠處理對(duì)不同休眠階段的陽(yáng)光玫瑰葡萄芽的萌芽率、萌芽速度均會(huì)產(chǎn)生一定影響。內(nèi)休眠階段進(jìn)行不同破眠處理后的葡萄離體枝條冬芽萌芽率結(jié)果（圖1-A）表明，T1處理萌芽最早，其次是T2處理，最后是CK，各處理萌芽整體速度呈先慢后快的趨勢(shì)。2022年4月10日，T1、T2處理后的萌芽率與CK相比開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，其中T2處理的萌芽率最高。2022年4月15日，T1處理與T2處理的萌芽率分別為81.48%和85.80%，均顯著高于CK（66.05%）。類休眠階段進(jìn)行不同破眠處理后的葡萄冬芽萌芽率結(jié)果（圖1-B）表明，T1處理萌芽最早，2022年9月3日，T1、T2處理后的萌芽率與CK相比開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，其中T2處理的萌芽率最高。2022年9月9日，T1與T2處理的萌芽率分別為65.66%和69.70%，均顯著高于CK（41.41%）。內(nèi)休眠階段進(jìn)行不同破眠處理后的葡萄冬芽萌芽率結(jié)果（圖1-C）表明，處理后25 d，T1、T2處理的萌芽率與CK相比開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，2023年4月3日，T1與T2處理的萌芽率分別為96.43%和97.22%，均顯著高于CK（76.19%）。

破眠處理后離體枝條上葡萄芽的生長(zhǎng)發(fā)育動(dòng)態(tài)如圖2所示，T1、T2處理的葡萄芽提早解除休眠，均在2022年3月21日出現(xiàn)2～3枚新葉。T1處理在2022年3月15日已經(jīng)開(kāi)始萌芽，萌芽開(kāi)始時(shí)間最早，萌芽較為整齊；T2處理的葡萄芽在3月21日左右開(kāi)始萌芽，萌芽較為整齊。CK的葡萄芽在2022年4月2日出現(xiàn)2～3枚新葉，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，萌芽不整齊。

破眠處理后葡萄枝條生長(zhǎng)狀態(tài)如圖3所示，與CK相比，2023年4月3日，T1處理后的葉片生長(zhǎng)速度最快，其次是T2處理。2023年4月29日，T1、T2處理后的葉片生長(zhǎng)速度、葉片大小、節(jié)間長(zhǎng)度與CK相比無(wú)顯著差異。

為了解不同破眠處理對(duì)葡萄花穗的影響，筆者統(tǒng)計(jì)了不同破眠處理后所有1年生枝條的成花情況。如圖4所示，T1、T2處理對(duì)葡萄1年生枝條的成花率相比于CK沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異，同時(shí)也不影響花序長(zhǎng)度。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析及序列比對(duì)

利用Illuminate平臺(tái)，完成14個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。為保證后續(xù)分析的準(zhǔn)確性，筆者通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行一系列嚴(yán)格的質(zhì)量控制后得到高質(zhì)量的Clean Data。經(jīng)過(guò)測(cè)序質(zhì)量控制后，共得到92.92 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達(dá)到5.89 Gb，Q30堿基百分比在94.21%以上，GC含量為45.72%～47.50%。以上結(jié)果表明測(cè)序質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)的比對(duì)分析。通過(guò)使用HISAT2將Clean Reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，各樣本的Reads與指定的參考基因組的比對(duì)率在85.18%～90.91%（表3）。

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

以|log2fold changes|≥1、FDR＜0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。通過(guò)差異表達(dá)基因韋恩圖（圖5）分析發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)休眠階段，6個(gè)處理中全部共有的差異基因?yàn)?77個(gè)，W-CK-72-vs-W-ACC-72與W-CK-72-vs-W-HC-72有大量相同的差異基因，為3598個(gè)；W-CK-24-vs-W-ACC-24和W-CK-72-vs-W-ACC-72共有差異基因536個(gè)；W-CK-24-vs-W-HC-24和W-CK-72-vs-W-HC-72共有差異基因2678個(gè)；W-CK-24-vs-W-ACC-24和W-CK-24-vs-W-HC-24共有差異基因較少，僅554個(gè)。在類休眠階段，6個(gè)處理組中全部共有的差異基因?yàn)?6個(gè)，S-CK-24-vs-S-HC-24和S-CK-72-vs-S-HC-72有大量相同的差異基因，為5796個(gè)；S-CK-72-vs-S-ACC-72和S-CK-72-vs-S-HC-72共有差異基因985個(gè)；S-CK-24-vs-S-ACC-24和S-CK-24-vs-S-HC-24共有差異基因724個(gè)；S-CK-24-vs-S-ACC-24和S-CK-72-vs-S-ACC-72共有差異基因較少，僅283個(gè)。

2.4 休眠期間差異表達(dá)基因模式變化

筆者研究了不同休眠階段不同破眠處理后葡萄芽在2個(gè)時(shí)期的基因表達(dá)模式，鑒定的不同時(shí)期樣本之間的DEGs數(shù)量如圖6所示。結(jié)果表明，在類休眠階段，T1處理后24 h有3662個(gè)基因顯著上調(diào)，2935個(gè)基因顯著下調(diào)；T1處理后72 h有4375個(gè)基因顯著上調(diào)，3486個(gè)基因顯著下調(diào)；T2處理后24 h有1636個(gè)基因顯著上調(diào)，1301個(gè)基因顯著下調(diào)；T2處理后72 h有1559個(gè)基因顯著上調(diào)，1464個(gè)基因顯著下調(diào)。在內(nèi)休眠階段，T1處理后24 h有2780個(gè)基因顯著上調(diào)，1842個(gè)基因顯著下調(diào)；T1處理后72 h有3230個(gè)基因顯著上調(diào)，2071個(gè)基因顯著下調(diào)；T2處理后24 h有661個(gè)基因顯著上調(diào)，1137個(gè)基因顯著下調(diào)；T2處理后72 h有3279個(gè)基因顯著上調(diào)，2218個(gè)基因顯著下調(diào)。

2.5 休眠期間差異基因的聚類分析

表達(dá)模式相似的基因通常具有相似的功能，為了解不同休眠階段不同破眠處理后不同時(shí)期芽的差異表達(dá)基因的表達(dá)模式，筆者利用R語(yǔ)言中的聚類程序?qū)?2組樣本的顯著差異基因進(jìn)行等級(jí)聚類分析（圖7）。結(jié)果表明，4399個(gè)基因被分成8組，最多的一組（Class 8）包含了1161個(gè)DEGs，DEGs的表達(dá)模式呈現(xiàn)為在W-HC-24樣本、W-HC-72樣本上調(diào)表達(dá)，其他樣本基本下調(diào)表達(dá)，這些基因顯著富集在轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移氨基酰基以外的?；?、生物合成進(jìn)程、UPD-糖基轉(zhuǎn)移酶活性、苯丙氨酸解氨酶活性、解氨酶活性等途徑。

第二大組（Class 7）包含821個(gè)基因，DEGs的表達(dá)模式呈現(xiàn)為在S-HC-72樣本上調(diào)表達(dá)，其他樣本基本下調(diào)表達(dá)，這些基因主要富集在光系統(tǒng)Ⅱ、葉綠體類囊體膜、光合作用，光系統(tǒng)Ⅰ的捕光天線復(fù)合體、膜的錨固成分、絲氨酸型羧肽酶活性等途徑。

第三大組（Class 2）包含633個(gè)基因，DEGs的表達(dá)模式呈現(xiàn)為在S-CK-24樣本、S-CK-72樣本、S-ACC-24樣本、S-ACC-72樣本上調(diào)表達(dá)，其他樣本基本下調(diào)表達(dá)，這些基因主要富集在響應(yīng)熱休克、響應(yīng)過(guò)氧化氫、響應(yīng)活性氧、蛋白質(zhì)復(fù)合物寡聚化、蛋白質(zhì)自聚集等途徑。

第四大組（Class 4）包含480個(gè)基因，DEGs的表達(dá)模式呈現(xiàn)為在W-CK-24樣本、W-CK-72樣本、W-ACC-24樣本上調(diào)表達(dá)，其他樣本基本下調(diào)表達(dá)，這些基因主要富集在嘌呤核苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、纖維素合酶（UDP?forming）活性、磷脂代謝過(guò)程、纖維素生物合成過(guò)程、轉(zhuǎn)氨酶活性等途徑。

在Class 6中，373個(gè)基因在S-HC-72樣本、W-ACC-72樣本中上調(diào)表達(dá)，其他樣本基本下調(diào)表達(dá)，這些基因主要富集在通過(guò)斷裂誘導(dǎo)復(fù)制進(jìn)行DNA雙鏈斷裂修復(fù)、微小染色體維持蛋白復(fù)合物、DNA復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合、單鏈DNA結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合等途徑。

在Class 3中，350個(gè)基因在S-CK-24樣本、S-CK-72樣本、S-ACC-24樣本、S-ACC-72樣本、W-CK-24樣本、W-CK-72樣本、W-ACC-24樣本上調(diào)表達(dá)，其他樣本基本下調(diào)表達(dá)，這些基因主要富集在序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化活性、氧化還原酶活性、作用于硫基供體等途徑。

在Class 5中，309個(gè)基因在S-HC-24樣本、S-HC-72樣本、W-ACC-72樣本、W-HC-72樣本上調(diào)表達(dá)，其余樣本基本下調(diào)表達(dá)，這些基因主要富集在呼吸鏈、分枝酸生物合成過(guò)程、鋅離子依賴的乙醇脫氫酶活性、S-羥甲基谷胱甘肽脫氫酶活性、甲醛分解代謝過(guò)程等途徑。

在Class 1中，272個(gè)基因在S-HC-24樣本中上調(diào)表達(dá)，其余樣本基本下調(diào)表達(dá)，這些基因主要富集在未折疊蛋白反應(yīng)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、谷胱甘肽代謝過(guò)程、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊等途徑。

2.6 與休眠相關(guān)的差異表達(dá)基因篩選

在使用不同破眠劑打破葡萄芽休眠的過(guò)程中會(huì)引起植物體內(nèi)一系列生理生化變化，同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)破眠相關(guān)基因的表達(dá)。在內(nèi)休眠階段W-CK-72樣本與W-HC-72樣本相比的差異表達(dá)基因中（表4）有10個(gè)被注釋為轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，其中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有3個(gè)，包括MYB4、ERF073、HSF A-4a；下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有7個(gè)，包括ERF023-like、ERF011-like、TT2、MYB44、HSF C-1、Nuclear transcription factor Y、HSF30。另外，有10個(gè)被注釋為參與生長(zhǎng)素（auxin，AUX）、赤霉素（gibberelli acid，GA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、油菜素甾醇（brassinosteroids，BR）等激素的生物合成或介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在ABA信號(hào)通路中，PYL4基因上調(diào)表達(dá)；4個(gè)與蛋白磷酸酶2C（PP2C）家族相關(guān)的基因被注釋，PP2C24、PP2C8、PP2C37均下調(diào)表達(dá)，PP2C25上調(diào)表達(dá)；與Snrk2家族相關(guān)的SAPK2基因下調(diào)表達(dá)。其他差異基因與氧化應(yīng)激、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等有關(guān)。

3 討 論

生長(zhǎng)期和休眠期是葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中較為明顯的兩個(gè)時(shí)期。在內(nèi)休眠階段，通過(guò)對(duì)葡萄冬芽采取物理或化學(xué)等破眠措施可使冬芽提前萌發(fā)[6]。前人在不同品種葡萄上均已試驗(yàn)證明單氰胺可以提前打破葡萄休眠[17]，在我國(guó)南方地區(qū)，萌芽前一個(gè)月對(duì)葡萄冬芽進(jìn)行單氰胺處理破眠效果最佳，可明顯提高萌芽率，從而在一定程度上能夠提高葡萄產(chǎn)量。乙烯是五大植物激素之一，廣泛參與到植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)進(jìn)程中。前人研究表明，植物器官本身能生成乙烯，并提出了乙烯具有促進(jìn)植物成熟衰老的作用[18]。乙烯是氣體，在實(shí)際生產(chǎn)中主要使用乙烯利對(duì)香蕉[19]、菠蘿蜜[20]等進(jìn)行催熟；浙江、上海地區(qū)常用乙烯利對(duì)葡萄進(jìn)行催熟。ACC是乙烯合成的前體，在1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（ACC氧化酶，ACO）的氧化作用下生成乙烯[21]。因此，筆者推測(cè)ACC可能對(duì)芽的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用。

Keilin等[22]在構(gòu)建單氰胺（HC）誘導(dǎo)表達(dá)的EST文庫(kù)后，利用比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、鈣信號(hào)傳導(dǎo)等生化過(guò)程中的功能基因可能參與休眠解除過(guò)程。Halaly等[23]研究表明，HC和熱擊（heaat shock，HS）兩種方式均可解除生理休眠，觸發(fā)細(xì)胞生化水平暫時(shí)性呼吸和氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)CAT、ADH和PDC等相關(guān)基因瞬時(shí)上調(diào)表達(dá)，破眠處理還誘導(dǎo)抗壞血酸過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白h、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶編碼基因表達(dá)。單氰胺處理休眠芽后，通過(guò)釋放氰化物抑制有氧呼吸和過(guò)氧化氫酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞缺氧的同時(shí)誘導(dǎo)過(guò)氧化氫產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧含量升高[24]。Pacey-Miller等[25]報(bào)道了葡萄休眠芽中活性氧相關(guān)的Cu/Zn超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶和過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)量升高。在本研究中，MYB、ERF、MADS-box等轉(zhuǎn)錄因子都與芽萌發(fā)有關(guān)，這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)共同調(diào)控多種途徑從而影響葡萄萌芽，其中一些與氧化應(yīng)激有關(guān)，鈣信號(hào)傳導(dǎo)等基因也對(duì)葡萄活性氧代謝進(jìn)行調(diào)控。

植物激素與芽休眠密切相關(guān)，尤其是ABA和GA在調(diào)控芽休眠和萌發(fā)的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Khalil-Ur-Rehman等[16]認(rèn)為ABA和GA信號(hào)通路作為開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)葡萄芽休眠。ABA可以促進(jìn)楊樹(shù)SVL基因的表達(dá)[12]，而內(nèi)源ABA可通過(guò)激活PpyABF3調(diào)控梨PpyDAM3的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控休眠進(jìn)程[26]。在梨芽?jī)?nèi)休眠解除后觀察到較低水平的NCEDs表達(dá)，PpyCYB8和Ppy707A3的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)ABA含量降低[26]。李可等[27]研究表明，外源ABA可抑制藍(lán)莓花芽萌芽。在本研究中，鑒定出與激素合成相關(guān)的基因，如GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白、生長(zhǎng)素抑制蛋白、脫落酸受體、BRI1激酶抑制劑1、蛋白磷酸酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等可能參與了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本試驗(yàn)對(duì)不同休眠階段的陽(yáng)光玫瑰葡萄冬芽進(jìn)行破眠試驗(yàn)，用萌芽率、成花率及花穗質(zhì)量作為衡量葡萄破眠效果優(yōu)劣的三個(gè)指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在類休眠階段和內(nèi)休眠階段，單氰胺處理、石硫合劑+ACC處理均對(duì)陽(yáng)光玫瑰葡萄萌芽產(chǎn)生積極影響，石硫合劑+ACC處理后的萌芽率略高于單氰胺處理，兩種處理均能使陽(yáng)光玫瑰葡萄冬芽萌發(fā)時(shí)間提前，顯著提升植株萌芽率，對(duì)后續(xù)成花率及花穗長(zhǎng)度均無(wú)影響，且不會(huì)引起藥害。在本研究中，還有一些與環(huán)境響應(yīng)相關(guān)的差異基因，如熱擊蛋白（Heat shock protein，HSP）基因、光敏色素（phytochrome）基因、水孔蛋白（aquaporin，AQP）等水分代謝相關(guān)的基因、蔗糖合酶（sucrose synthase）等能量與物質(zhì)代謝相關(guān)的基因、細(xì)胞周期蛋白（cyclin，CYC）基因、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）等細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因，可能也參與了葡萄芽休眠解除的調(diào)控。

4 結(jié) 論

5 °Bé石硫合劑+0.25 mg·mL-1ACC處理能提早打破葡萄休眠，且不影響后續(xù)成花率及花穗質(zhì)量，對(duì)操作人員較為安全。石硫合劑+ACC的混合溶液是陽(yáng)光玫瑰葡萄打破休眠的一種安全、理想的藥劑。單氰胺處理、石硫合劑+ACC處理均誘導(dǎo)了PYL4、PP2C24、PP2C8、PP2C37、PP2C25、SAPK2等基因的表達(dá)，這些基因可能通過(guò)參與激素信號(hào)傳導(dǎo)、氧化應(yīng)激等反應(yīng)打破芽的休眠，促進(jìn)萌芽。

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