鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和毒性研究

李云峰 梁十 曾業(yè)文 羅挺 凌雪熒 關(guān)業(yè)枝 歐陽惠君

收稿日期：2023-10-30

基金項(xiàng)目：廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022B1111020005）；惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020SD0410038）

作者簡(jiǎn)介：李云峰（1975—），男，碩士，高級(jí)工程師，從事藥物安全性評(píng)價(jià)研究.Email：lyf@gdlami.com

通信作者：歐陽惠君（1982—），女，副教授，從事血液檢驗(yàn)研究.Email：25514618@qq.com

摘要：通過對(duì)比格犬單次灌胃或直腸給予鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑，觀察動(dòng)物的臨床反應(yīng)，測(cè)定鹽酸丁卡因在體內(nèi)的濃度，對(duì)主要的組織臟器進(jìn)行大體剖檢，并測(cè)量臟器重量及系數(shù)，以了解其在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和毒性反應(yīng).將8只普通級(jí)比格犬，隨機(jī)分為灌胃組和直腸組，每只犬分別單次灌胃或直腸給予10 mL鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑（含鹽酸丁卡因80 mg）.結(jié)果顯示，各動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)、呼吸和糞便等均未見明顯異常，攝食正常，體重正常增長(zhǎng)；與給藥前相比，各動(dòng)物在給藥后4 h體溫下降、心率減慢、QT間期和T波時(shí)間延長(zhǎng)，為鹽酸丁卡因的麻醉藥效作用所致；各動(dòng)物的血液學(xué)、血液生化學(xué)、主要臟器重量和系數(shù)及大體剖檢均未見明顯異常；單次灌胃或直腸給予后的平均達(dá)峰時(shí)間分別為0.63和0.44 h，平均消除半衰期分別為1.20和3.36 h，平均藥時(shí)曲線下面積分別為60.44和60.19 μg/L*h，提示吸收進(jìn)入血液的藥量較少，大部分留在局部發(fā)揮潤(rùn)滑和麻醉作用.

關(guān)鍵詞：鹽酸丁卡因；胃/腸鏡潤(rùn)滑劑；比格犬；藥動(dòng)學(xué)；毒性

中圖分類號(hào)：R96

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0引言

鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑是一種體腔器械導(dǎo)入潤(rùn)滑液，臨床主要用于胃、腸和肛門等插管鏡檢或手術(shù)時(shí)的局部潤(rùn)滑麻醉.鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑是一種新的器械治療輔助性藥物，是由二甲硅油、甘油、鹽酸丁卡因和純化水組成.本研究通過對(duì)比格犬單次灌胃或直腸給予鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑，觀察動(dòng)物的各種臨床反應(yīng)，測(cè)定鹽酸丁卡因在體內(nèi)的濃度，對(duì)主要的組織臟器進(jìn)行大體剖檢，并測(cè)量臟器重量及系數(shù)，以了解其在動(dòng)物體內(nèi)的藥效作用、藥動(dòng)學(xué)和毒性反應(yīng).

1材料與方法

1.1儀器

Waters Xevo TQS型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（沃特世科技有限公司），Hettich Universal 320R型冷凍離心機(jī)（德國Hettich科學(xué)儀器有限公司），MS3 Basic型振蕩器（德國艾卡有限公司），ECG2303B型數(shù)字心電圖機(jī)（廣州三銳電子科技有限公司），SYSMEX XN1000型全自動(dòng)模塊式血液分析儀、CS1300型全自動(dòng)凝血分析儀（日本希森美康株式會(huì)社），3100型全自動(dòng)生化分析儀（株式會(huì)社日立制作所），CPA225D型電子精密天平（賽多利斯公司），XK3190A6型電子臺(tái)秤（上海耀華稱重系統(tǒng)有限公司）.

1.2試劑與試藥

鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑（批號(hào)，20210127），購自深圳市盛康泰醫(yī)療器械有限公司，10 mL/支，含鹽酸丁卡因濃度8 mg/mL；鹽酸丁卡因標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)，100456201602），購自中國食品藥品檢定研究院，含量按C15H24N2O2·HCl計(jì)，為100.0%；甲醇與甲酸等均為色譜純，乙酸乙酯為分析純，水為超純水.

1.3動(dòng)物

普通級(jí)比格犬8只，體質(zhì)量為6.89～7.26 kg，雌雄各4只，購自儀征安立卯生物科技有限公司（SCXK（蘇）20210006）.動(dòng)物飼養(yǎng)在廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所普通環(huán)境動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（粵）20210122.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開展經(jīng)過廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所動(dòng)物使用與管理委員會(huì)審批，編號(hào)為IACUC2021188，廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明號(hào)為00292919.動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20.5～24.5 ℃，相對(duì)濕度為42.8％～68.9％，12 h/12 h明暗交替.

1.4劑量設(shè)計(jì)與動(dòng)物分組

本實(shí)驗(yàn)設(shè)灌胃組（1組）與直腸組（2組），動(dòng)物按體重隨機(jī)分為2組，每組雌雄各2只.經(jīng)口灌胃或直腸給藥1次，給藥量均為10 mL/只.

1.5指標(biāo)檢測(cè)方法與頻率

1.5.1一般狀況

每天對(duì)動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)、呼吸、分泌物、攝食、糞便及神經(jīng)系統(tǒng)等進(jìn)行觀察記錄，給藥當(dāng)天從給藥后開始連續(xù)觀察4 h，其后每日觀察1次.分別在動(dòng)物檢疫1 d、給藥前（D0）、給藥后第7 d和第14 d各稱重1次.

1.5.2心電圖和體溫

分別于D0、給藥后4 h（D1）、給藥后第7 d和第14 d各測(cè)量1次，Ⅱ?qū)?lián)指標(biāo)包括心率、PR間期、QRS時(shí)間、QT間期、QTC間期和T波時(shí)間等.

1.5.3血液學(xué)

在采血前空腹12 h以上（不禁水），分別于D0、給藥后4 h、第7 d和第14 d采用真空采血管在動(dòng)物前肢靜脈處采血.用枸櫞酸鈉抗凝管采血約2 mL，采集后立即上下顛倒混勻，3000 r/min離心15 min，取血漿用凝血分析儀測(cè)定凝血酶原時(shí)間（PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）.用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采血約1 mL，采集后立即上下顛倒混勻，采用血液分析儀測(cè)定紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)（RET）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、血紅蛋白量（HGB）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板數(shù)（PLT）、中性粒細(xì)胞數(shù)（NEUT）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYMPH）、單核細(xì)胞數(shù)（MONO）、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)（EO）、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)（BASO）、中性粒細(xì)胞比率（NEUT%）、淋巴細(xì)胞比率（LYMPH%）、單核細(xì)胞比率（MONO%）、嗜酸性粒細(xì)胞比率（EO%）、嗜堿性粒細(xì)胞比率（BASO%）、網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（RET%）、未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（IRF%）、低熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（LFR%）、中熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（MFR%）和高熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞比率（HFR%）等指標(biāo).

1.5.4血液生化學(xué)

真空采血約2 mL，血液不抗凝，在室溫靜置30～50 min后，3 000 r/min離心15 min；分離所有血清置已編號(hào)標(biāo)記的塑料離心（EP）管中，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿素氮（UREA）和肌酐（CREA）等指標(biāo).

1.5.5比格犬血液樣品采集、測(cè)定及參數(shù)計(jì)算

1）血液樣品采集：采用一次性注射器真空肝素管針頭刺入前肢或后肢靜脈，以適當(dāng)速度采血.分別在D0（0 h）及給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、12和24 h采集血液約2 mL，在4 h內(nèi)進(jìn)行離心，4 000 r/min離心10 min，取上層血漿，分別轉(zhuǎn)移至已標(biāo)記的EP管中，置超低溫冰箱（-80 ℃）冷凍保存至測(cè)定.

2）血漿樣品測(cè)定：于2 mL EP管中加入200 μL血漿樣品，加入氫氧化鈉溶液40 μL，混勻后加入甲醇50 μL，渦旋混勻；再加入1 mL乙酸乙酯，渦旋10 min后，在4 ℃下以4 000 r/min離心10 min；將上層有機(jī)相移至另一個(gè)EP管中，置50 ℃水浴氮?dú)獯蹈?殘?jiān)?00 μL的70%甲醇溶液溶解，在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min后，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中進(jìn)行測(cè)定.色譜柱為Waters UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液—甲醇，采用梯度洗脫方式，流速0.4 mL/min；電噴霧離子源ESI+模式，離子源溫度150 ℃，洗脫溶劑溫度400 ℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓26 V，MS碰撞能4 eV，丁卡因定量檢測(cè)離子對(duì)為m/z 265→176.

3）藥時(shí)數(shù)據(jù)處理：采用液質(zhì)聯(lián)用儀配有的UNIFI軟件對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量處理，采用DAS3.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)藥時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算藥時(shí)曲線下面積（AUC）、峰濃度（Cmax）、達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、消除半衰期（t1/2β）及平均滯留時(shí)間（MRT）等參數(shù).

1.5.6大體剖檢與組織病理學(xué)檢查

全部存活動(dòng)物采用氯胺酮（20 mg/kg）—速眠新Ⅱ（2 mg/kg）合劑肌肉注射麻醉放血處死后，進(jìn)行大體解剖檢查，肉眼觀察各組織和器官的變化，同時(shí)取腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、腎上腺和甲狀腺等主要臟器進(jìn)行稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=臟重/體重×100%）.各組織器官放入10%中性福爾馬林溶液中固定備查，對(duì)發(fā)現(xiàn)異常的組織或臟器需要進(jìn)行取材和制片等處理，然后進(jìn)行顯微鏡檢查.

1.6數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

體重、體溫、心電圖、血液學(xué)、血液生化學(xué)、臟器重量及臟器系數(shù)等數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為統(tǒng)計(jì)差異進(jìn)行判斷.

2結(jié)果

2.1一般狀況和體重

實(shí)驗(yàn)期間，各動(dòng)物的皮毛、行為活動(dòng)、呼吸、糞便及尿液等均未見明顯異常，攝食正常，未見剩余飼料.給藥后未見動(dòng)物出現(xiàn)嗜睡或昏睡、狂躁不安、寒顫或震顫、麻疹或蕁麻疹等異常反應(yīng)，攝食正常，體重正常增長(zhǎng)，結(jié)果見表1.

2.2體溫

給藥后4 h與D0相比，各動(dòng)物的體溫均顯著下降（P<0.05），考慮為受試物鹽酸丁卡因的麻醉藥效作用所致；在給藥后第7 d和14 d均未見顯著性差異（P>0.05），結(jié)果見表2.

2.3心電圖

與D0相比，在給藥后4 h，各動(dòng)物的心率均顯著減慢、QT間期和T波時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.05或0.01）；在給藥后第7 d，各動(dòng)物的QT間期仍顯著延長(zhǎng)（P<0.05或P<0.01）；在給藥后第14 d，各動(dòng)物的心電圖指標(biāo)均未見顯著性差異（P>0.05）.這些指標(biāo)值變化考慮為鹽酸丁卡因的藥效作用所致，結(jié)果見表3.

2.4血液學(xué)

與D0相比，給藥后4 h，各動(dòng)物的IRF%和MFR%顯著降低（P<0.05），LFR%顯著升高（P<0.05），RET%和HFR%有所下降，但未見顯著性差異（P>0.05）；這些指標(biāo)在給藥后第7 d和第14 d均沒有顯著差異，考慮為動(dòng)物采血后的正常生理性變化，與鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑無關(guān).其余各指標(biāo)均未見異常，結(jié)果見表4.

2.5血液生化學(xué)

與D0相比，給藥后4 h、第7 d和第14 d，各動(dòng)物的UREA和CREA均有所升高，但未見顯著性差異（P>0.05），且在正常值范圍內(nèi)，考慮為動(dòng)物的生理波動(dòng)性變化，與鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑無關(guān).其余各指標(biāo)均未見顯著性差異，結(jié)果見表5.

2.6血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

比格犬經(jīng)口單次灌胃或直腸給予鹽酸丁卡因內(nèi)鏡潤(rùn)滑劑10 mL后，在不同時(shí)間點(diǎn)均能在其血漿中檢測(cè)到丁卡因.其中，在給藥后0.25 h的血藥濃度分別為（19.49±20.61）和（12.53±11.25）ng/mL，與動(dòng)物個(gè)體吸收差異有關(guān).平均Tmax分別為（0.63±0.25）和（0.44±0.13）h，平均Cmax分別為（33.65±17.61）和（15.12±10.64）ng/mL，平均t1/2β分別為（1.20±0.61）和（3.36±1.5）h；平均AUC分別為（60.44±11.45）和（60.19±42.65）μg/L*h，提示吸收進(jìn)入血液的藥量較少，大部分留在局部，有利于鏡檢或手術(shù)順利進(jìn)行.血藥濃度及藥代學(xué)參數(shù)結(jié)果見表6.

2.7臟器重量和系數(shù)

各動(dòng)物的腦、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腺、腎上腺和甲狀腺等主要臟器的重量和系數(shù)均未見明顯變化，結(jié)果見表7；心臟、肝臟（含膽囊）、脾臟、腎臟、睪丸、附睪、子宮（含子宮頸）、卵巢、胸腺、腎上腺、甲狀腺（含甲狀旁腺）和腦等組織器官大體剖檢均未見異常改變，無需進(jìn)行組織學(xué)檢查，各動(dòng)物均未有肉眼可見的毒性病理改變.

3討論

臨床上進(jìn)行胃/腸鏡檢查或手術(shù)時(shí)，患者經(jīng)常因器械的進(jìn)入刺激引起嗆咳、嘔吐與疼痛等癥狀，導(dǎo)致不少患者對(duì)此項(xiàng)檢查產(chǎn)生恐懼甚至拒絕，為減輕患者的痛苦，順利實(shí)施胃/腸鏡檢查或手術(shù)，胃/腸鏡潤(rùn)滑劑產(chǎn)品的研發(fā)十分必要.鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑是在腸鏡潤(rùn)滑劑的制備與胃鏡潤(rùn)滑劑的應(yīng)用等研究［1-3］基礎(chǔ)上研發(fā)出來的新產(chǎn)品，將其涂抹在胃/腸鏡器械表面，其中的二甲硅油和甘油可減少胃/腸鏡器械的刺激性，同時(shí)增加潤(rùn)滑度，鹽酸丁卡因通過胃/腸表皮黏膜吸收后起到局部麻醉的作用，從而減輕患者因胃/腸鏡器械進(jìn)入胃/腸腔內(nèi)引起的惡心、嘔吐與疼痛等癥狀.

已有研究表明，丁卡因用于麻醉有較大毒性作用［4-5］，在本研究中，比格犬單次灌胃或直腸給予鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑后，各組動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)與呼吸等均未見明顯異常，攝食和體重均正常，也未見動(dòng)物出現(xiàn)狂躁不安、抽搐或驚厥等毒性反應(yīng).但在給藥后4 h出現(xiàn)了體溫下降、心率減慢、QT間期和T波時(shí)間延長(zhǎng)等現(xiàn)象，應(yīng)為鹽酸丁卡因的麻醉藥效作用所致，與吸收進(jìn)入血液的丁卡因藥量較少結(jié)果相一致，且灌胃與直腸給予方式間沒有差異.

鹽酸丁卡因含量測(cè)定的方法主要有紫外分光光度法、高效液相法［6-7］和毛細(xì)管電泳法［8］等.本研究參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，采用甲醇和乙酸乙酯混合液沉淀蛋白法處理比格犬血漿樣品，采用液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定，具有靈敏度高、提取回收率高、檢測(cè)時(shí)間短與操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn).藥動(dòng)學(xué)參數(shù)平均Tmax分別為0.63和0.44 h，表明吸收起效較快；平均AUC分別為60.44和60.19 μg/L*h，提示吸收進(jìn)入血液的藥量較少，大部分留在局部，有利于鏡檢或手術(shù)順利進(jìn)行，且灌胃與直腸給予方式間沒有差異.

與D0相比，給藥后4 h，各組動(dòng)物的IRF%和MFR%顯著降低，LFR%顯著升高（P<0.05），RET%和HFR%略有下降；但在給藥后第7 d和第14 d，未見顯著性差異.給藥后4 h、第7 d和第14 d，各動(dòng)物的UREA和CREA均有所升高，但未見顯著性差異.這些指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)，應(yīng)為動(dòng)物采血后的正常生理性變化.

綜上所述，8只比格犬分別在單次灌胃或直腸給予鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑10 mL后觀察14 d，各動(dòng)物的一般狀況觀察、體重、血液學(xué)、血液生化學(xué)、主要臟器重量和系數(shù)與病理大體剖檢等均未見明顯異常；在給藥后4 h，各動(dòng)物因鹽酸丁卡因的麻醉藥效作用而出現(xiàn)體溫下降、心率減慢與QT間期延長(zhǎng)等；吸收進(jìn)入血液的藥量較少，大部分留在局部發(fā)揮潤(rùn)滑和麻醉作用，有利于鏡檢或手術(shù)順利進(jìn)行；未見與鹽酸丁卡因胃/腸鏡潤(rùn)滑劑相關(guān)的毒性反應(yīng).

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（責(zé)任編輯：伍利華）