甜菜堿對低溫下苜蓿種子萌發(fā)中呼吸電子傳遞的影響

關鍵詞：紫花苜蓿;低溫脅迫;甜菜堿;種子萌發(fā);呼吸電子傳遞

紫花苜蓿（Medicagosativa L.）是多年生豆科牧草（以下簡稱苜蓿），在新疆廣泛栽培。由于新疆地區(qū)氣候條件特殊，春季“倒春寒”引起的低溫頻發(fā)，苜蓿在春季播種時常常遭受低溫的影響，萌發(fā)率降低，嚴重影響了后期苜蓿的生長及產(chǎn)量，限制了苜蓿產(chǎn)業(yè)在新疆的發(fā)展。

種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的重要階段，在吸脹期若遇0℃～12℃低溫，常發(fā)生吸脹冷害，延遲種子吸水膨脹及萌動過程的進行[1]，抑制淀粉分解酶活性，阻礙貯藏物質的分解[2]，進而嚴重影響作物苗期的生長及后期產(chǎn)量形成[3]。種子吸水后的呼吸作用是種子萌發(fā)生長為幼苗的前提，呼吸作用通過對種子內貯藏物質進行氧化分解為種子萌發(fā)提供營養(yǎng)保證和能量供應[4]。種子萌發(fā)過程中ATP 的產(chǎn)生主要依賴于線粒體呼吸電子傳遞和氧化磷酸化。電子傳遞主要是通過耦聯(lián)ATP 合成的細胞色素C 氧化酶（Cytochromecoxidase，COX）途徑進行，但當電子過剩時便會有大量電子外滲產(chǎn)生活性氧，此時植物細胞特有的交替氧化酶（Alternativeoxidase，AOX）途徑能夠有效的分流電子減少活性氧的產(chǎn)生。線粒體電子傳遞和氧化磷酸化完全依賴于線粒體膜結構的穩(wěn)定性。研究表明，低溫破壞了種子下胚軸細胞超微結構尤其是線粒體膜結構的完整性和穩(wěn)定性[5]，進而影響種子呼吸作用最終影響種子的萌發(fā)。

甘氨酸甜菜堿（Glycinebetaine，GB）是一種季銨型水溶生物堿，是一種重要的滲透保護劑[6]，有效提高植物的抗逆性。研究發(fā)現(xiàn)施加適量外源甜菜堿可以增強低溫脅迫下葉片葉綠素含量，光合作用能力以及植物細胞內抗氧化系統(tǒng)活性和抗氧化物質積累，穩(wěn)定植物細胞膜進而維持植物的抗寒性[7-8]。此外，姜秀梅等研究表明一定低濃度的外源甜菜堿顯著增加了低溫下辣椒（Capsicumannuum L.）種子的萌發(fā)指標，而高濃度的甜菜堿則抑制其萌發(fā)[9]。目前外源甜菜堿對于紫花苜?？购缘难芯恐饕杏诙嘀孛{迫[10-12]以及對于植物幼苗根莖、葉片影響的研究[13-16]，施加外源甜菜堿在低溫脅迫下對種子萌發(fā)過程尤其是萌發(fā)過程中的呼吸作用的影響鮮有報道。

因此本研究選取新疆廣泛種植的苜蓿品種‘新牧4號’為材料，研究外源甜菜堿對不同低溫（5℃，10℃和15℃）脅迫下苜蓿種子呼吸、萌發(fā)等相關生理指標的影響，旨在為甜菜堿在苜蓿抗寒性的研究與應用中提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為‘新牧4 號’紫花苜蓿（Medicagosativa L.‘XinmuNo.4’），供試種子于2022年從新疆烏魯木齊新疆農(nóng)業(yè)大學陸港校區(qū)三坪基地采集。甜菜堿購于上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同溫度下種子萌發(fā)試驗 通過預實驗在5℃的溫度下外施5，10，15，20mmol·L-1的甜菜堿開展種子萌發(fā)實驗，從而確定15mmol·L-1的甜菜堿能提高種子的萌發(fā)指標，以此濃度的甜菜堿為后期實驗的指定濃度。

選取顆粒飽滿，大小均勻的種子，用75%的乙醇消毒30s，再用蒸餾水沖洗三次，將種子整齊的置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中進行萌發(fā)，每個處理設置3個重復，每個培養(yǎng)皿100粒種子。每個培養(yǎng)皿用移液槍加入3mL15mmol·L-1的甜菜堿，以加等量蒸餾水為對照。而后將其分別放置在5℃，10℃，15℃，20℃的培養(yǎng)箱中（光照/黑暗條件為12h/12h）進行培養(yǎng)，從第二天開始，每天同一時間觀察并記錄種子萌發(fā)情況，以胚根突破種皮2mm作為發(fā)芽標準[17]。發(fā)芽過程中根據(jù)培養(yǎng)皿中平鋪的雙層濾紙的干濕程度，每天補充適量的蒸餾水，以防止水分被種子吸收或蒸發(fā)后導致甜菜堿濃度增加。

為研究低溫對種子萌發(fā)的影響機制，本實驗設置兩種種子萌發(fā)終止時間，其一以20℃種子萌發(fā)結束為萌發(fā)終止時間，其二以5℃種子萌發(fā)結束為萌發(fā)終止時間。

種子萌發(fā)按如下公式：

平均發(fā)芽時間（Meantimetogermination，MGT）=Σ（nt×t）/n;

式中：nt為第t天發(fā)芽數(shù)，n 為最終發(fā)芽數(shù)[18]。

1.2.2 不同溫度下種子呼吸速率的測定 各處理發(fā)芽結束后，選取在不同溫度下萌發(fā)的種子，分別在相應下萌發(fā)溫度下測定種子的呼吸速率，以此來反映不同溫度下種子呼吸變化。根據(jù)Zhang等[19-20]的方法，利用OXYTHERM 氧電極（Hansatech，英國），在各自的處理溫度下測定不同呼吸途徑的呼吸速率。反應室溫度由OXYTHERM 氧電極的控溫裝置自動控制。于反應杯中添加2.6mLPBS緩沖液，加入8粒提前稱好質量、形態(tài)大小發(fā)芽狀態(tài)相似的種子，在黑暗中測定種子的耗氧速率，當耗氧速率達到穩(wěn)定狀態(tài)后，根據(jù)氧氣濃度的下降斜率計算種子總呼吸速率（Rtotal，μmol·m-2·s-1）。當加入工作濃度為20mmol·L-1的SHAM 溶液后，測得種子COX呼吸的耗氧速率（RCox，μmol·m-2·s-1），AOX途徑呼吸速率為：RAox=Rtotal-RCox。根據(jù)上述方法分別測定不同溫度萌發(fā)條件下種子的不同呼吸途徑的呼吸速率。

1.2.3 不同溫度下種子生理指標測定 將萌發(fā)結束后的種子進行生理指標測定，每個指標重復三次。超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD），過氧化物酶（Peroxidase，POD），過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性，過氧化氫（H2O2）均由相對應的試劑盒（源于山東格銳思公司）進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MicrosoftExcel2017 軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS26.0軟件進行獨立樣本T檢驗統(tǒng)計分析，采用軟件MicrosoftExcel2017，Origin2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源甜菜堿對不同處理下苜蓿種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，隨著溫度降低，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均會呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢，而平均發(fā)芽天數(shù)呈上升趨勢。在5℃，10℃下GB處理的苜蓿種子發(fā)芽率均顯著高于CK（Plt;0.05），在5℃，10℃下GB處理下的苜蓿種子發(fā)芽勢均高于CK 處理，5℃ 下GB 對提高種子發(fā)芽率的作用最顯著，10℃下GB 對提高種子發(fā)芽勢的作用最顯著（圖1A，1B）。在10℃下施用GB對減少種子發(fā)芽天數(shù)，種子發(fā)芽高峰期的提前效果顯著，在15℃，20℃下無顯著效果（圖1C，1D）。

2.2 外源甜菜堿對不同處理下苜蓿種子總呼吸、呼吸電子傳遞途徑的影響

由圖2可知，隨著溫度降低，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均會呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢，而平均發(fā)芽天數(shù)呈上升趨勢。在5℃，10℃，15℃下GB處理的苜蓿種子發(fā)芽率均顯著高于CK（Plt;0.05），在5℃，10℃下GB處理下的苜蓿種子發(fā)芽勢均高于CK 處理，5℃下甜菜堿對提高種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率的作用最顯著（圖2A，2B）。在5℃，10℃下施用甜菜堿對減少種子發(fā)芽天數(shù)，提前種子發(fā)芽高峰期效果顯著，在其他溫度下無顯著效果（圖2C，2D）。

上述結果表明，低溫會顯著影響種子萌發(fā)進程，但只是減緩種子萌發(fā)速率，并未終止種子萌發(fā)進程，而施加甜菜堿有效促進了低溫下苜蓿種子萌發(fā)速率，緩解了低溫對種子萌發(fā)進程的抑制作用。

由圖3A 可知，隨著溫度的降低，總呼吸呼吸速率呈下降趨勢。在5℃，10℃，15℃，20℃下GB處理下種子總呼吸速率均顯著高于CK，隨著溫度的降低，GB對苜蓿種子的呼吸的提升作用逐漸增加，在5℃下的提升作用最為顯著（Plt;0.05）。這表明低溫顯著抑制了萌發(fā)種子的呼吸速率，甜菜堿能有效增強種子在低溫下的總呼吸速率，緩解低溫對種子的傷害。

COX呼吸途徑是呼吸過程中產(chǎn)生ATP的最主要電子傳遞途徑。由圖3B可發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低COX呼吸速率逐漸下降。在不同處理溫度下，GB處理的種子COX 呼吸速率均顯著高于CK，且隨著溫度的下降，GB對萌發(fā)種子COX 呼吸速率的提升程度逐漸增加，且在5℃下作用增加最大（Plt;0.05）。這表明，低溫顯著抑制了萌發(fā)種子COX 呼吸電子傳遞速率，從而減少了ATP 的產(chǎn)生。甜菜堿有效提升了低溫下COX呼吸從而維持了低溫下用于種子萌發(fā)的ATP的產(chǎn)生。

AOX呼吸途徑是非磷酸化途徑，由圖3C可發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低AOX 呼吸速率呈逐漸降低后趨于穩(wěn)定趨勢，在5℃，10℃，15℃下施加甜菜堿較CK處理提高種子AOX呼吸速率作用顯著，20℃下無顯著影響。這表明，低溫顯著抑制了電子傳遞，隨著溫度的增加，通過AOX 耗散電子的速率逐漸增加。甜菜堿對AOX呼吸電子傳遞的促進隨著溫度的增加而逐漸減弱。上述結果表明，甜菜堿對萌發(fā)種子內COX和AOX 途徑的呼吸速率的促進作用隨著溫度的不同而不同。

不同途徑的呼吸占總呼吸的比率反映了線粒體電子傳遞的能量分配。如圖4A 所示，隨著溫度降低，COX呼吸途徑在總呼吸中的占比呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。GB處理對種子COX 呼吸在總呼吸中的占比的影響隨著溫度的增加逐漸減小。這表明，5℃低溫顯著抑制了萌發(fā)種子線粒體電子向COX呼吸途徑的傳遞，從而影響了ATP的產(chǎn)生，甜菜堿有效緩解了低溫對此過程的抑制作用。而隨著溫度的增加，電子向COX的分配逐漸增加并趨于正常，甜菜堿的作用逐漸減小。如圖4B所示，在5℃下，AOX呼吸占總呼吸的比率較高，10℃下最低，并且隨著溫度增加，AOX呼吸途徑在總呼吸中的占比呈現(xiàn)上升趨勢。GB處理增加了AOX 呼吸途徑在總呼吸中的占比。這表明，5℃低溫對種子產(chǎn)生低溫傷害，并且產(chǎn)生過剩的電子需要通過AOX 消耗，甜菜堿處理減少了低溫對種子的傷害從而降低了AOX的占比。10℃開始，低溫傷害減弱，隨著溫度的增加，總的電子流增加，產(chǎn)生的電子泄露增加，需要通過AOX耗散的能量也逐漸增加。甜菜堿處理提高了AOX呼吸的占比以此減少活性氧的產(chǎn)生。

綜上所述甜菜堿在不同溫度下對于不同呼吸途徑起到的作用不同，但在低溫脅迫下起到了一定的保護作用。在5℃低溫下，甜菜堿主要上調電子向COX的分配以產(chǎn)生ATP，隨著溫度的增加，甜菜堿對呼吸的上調作用主要表現(xiàn)在對AOX 呼吸途徑的影響。

2.3 外源甜菜堿對不同溫度下種子氧化還原平衡的影響

由圖5A 可知，苜蓿種子SOD活性隨溫度降低呈上升趨勢。在5℃下，GB處理顯著提升SOD 活性，在剩余溫度處理下提升效果不顯著。由圖5B可知，苜蓿種子POD 活性隨溫度降低呈上升趨勢。與CK相比，浸種15mmol·L-1的GB處理均提高了低溫脅迫下種子內POD活性，在5℃，10℃，15℃下提升效果顯著，其中在5℃下效果最佳。由圖5C可知，苜蓿種子CAT 活性隨萌發(fā)溫度降低呈上升趨勢，而GB處理下的種子CAT活性均高于CK 處理下，在5℃，10℃，15℃提升效果顯著。由圖5D可知，隨溫度的降低種子內H2O2 含量逐漸上升，在GB處理下H2O2 含量均低于CK 處理下，其中在5℃下降低顯著，其余溫度下GB處理有提高H2O2含量作用，但不顯著。

綜上所述，SOD，POD，CAT活性均隨萌發(fā)溫度上升逐漸降低，而甜菜堿處理下上述抗氧化酶活性均有提升，其中在5℃下提升作用最顯著。這說明甜菜堿能增強抗氧化酶活性，降低低溫下種子內活性氧的積累，從而有效緩解低溫對種子的傷害。

3 討論

溫度是植物生長發(fā)育的關鍵環(huán)境因素之一，與對照相比，在一定的時間內，低溫顯著抑制紫花苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根長，萌發(fā)高峰期也會隨著溫度降低而后延[21]，但低溫沒有終止苜蓿種子萌發(fā)過程，延長低溫下萌發(fā)的時間，最終苜蓿種子仍可達到較高萌發(fā)率，且與常溫無差異。這說明，本實驗中5℃低溫脅迫并沒有對苜蓿種子產(chǎn)生不可逆的破壞，只是減緩了苜蓿種子萌發(fā)進程。種子遭受低溫脅迫時，一方面會引起生物膜從液晶態(tài)變成凝膠態(tài)的變化;另一方面會引起膜系統(tǒng)結構的變化，即使膜上的各類酶活性受到影響，從而引起細胞生理生化發(fā)生異常變化[22]。種子萌發(fā)中，線粒體內膜上呼吸電子傳遞中COX呼吸途徑產(chǎn)生的ATP為種子萌發(fā)提供了能力，是種子萌發(fā)的關鍵[5]。低溫脅迫下COX途徑的電子傳遞速率受到明顯的脅制，ATP合成受限，從而影響種子萌發(fā)。此外，低溫抑制呼吸電子傳遞過程，導致大量的電子泄露，活性氧產(chǎn)生[23];同時低溫顯著的抑制了苜蓿種子內包括SOD、POD和CAT 在內的活性氧清除酶的活性，最終導致H2O2 積累，對種子造成氧化傷害，最終影響了苜蓿種子的萌發(fā)。

外施甜菜堿可有效提高抗性緩解低溫脅迫對植物的傷害[24-25]，本實驗結果表明，甜菜堿浸種在一定程度下可以緩解低溫脅迫對于種子萌發(fā)的影響，加快平均發(fā)芽時間，且隨著溫度的下降甜菜堿效果逐漸增加。這與前人研究發(fā)現(xiàn)使用一定濃度甜菜堿可以提高脅迫下種子各項萌發(fā)指標結論一致[26-27]。趙文靜等[5]研究表明，低溫下種子萌發(fā)過程中推動ATP合成的COX呼吸貢獻更大，我們的研究表明甜菜堿處理提高了低溫下COX呼吸電子傳遞速率以及COX在總呼吸中的占比，這表明低溫下萌發(fā)種子呼吸作用受限的前提下，甜菜堿處理能調控電子傳遞向產(chǎn)生ATP的COX 呼吸途徑分配，用以產(chǎn)生較多的ATP供給種子萌發(fā)。張苗等[28]通過研究低溫下西葫蘆的研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿可顯著提升低溫下西葫蘆（Cucurbitapepo L.）線粒體細胞色素細胞氧化酶活力，延緩ATP含量的下降，這進一步佐證了甜菜堿通過維持低溫下ATP的含量進而減緩低溫對植物的傷害。

在低溫下，甜菜堿增強細胞酶活性[29]，緩解低溫對細胞膜的傷害[30]，利于維持呼吸電子傳遞的正常運轉，減少了活性氧的產(chǎn)生。此外，外施甜菜堿后苜蓿種子內SOD，POD，CAT 等活性氧清除酶活性顯著增加，減少了苜蓿種子內活性氧的積累，維持了種子內的氧化還原平衡，緩解了低溫下苜蓿種子的氧化傷害，維持了苜蓿種子正常生理活性，從而促進種子萌發(fā)。并且甜菜堿對苜蓿種子萌發(fā)的促進作用隨著溫度的下降而增大，其中5℃下提升作用最顯著。因此，在今后苜蓿種子生產(chǎn)加工過程中，可以以種子包衣等形式將甜菜堿預包裹種子，以促進其在低溫下的萌發(fā)速率，從而擴大苜蓿在寒冷地區(qū)的推廣應用。

4 結論

外施甜菜堿有效緩解了低溫對苜蓿種子呼吸作用尤其是耦聯(lián)ATP產(chǎn)生的COX 呼吸途徑的抑制作用，此外，提升了活性氧清除系統(tǒng)的活性，緩解了低溫下種子萌發(fā)過程中的氧化傷害，縮短了種子萌發(fā)時間，促進苜蓿種子在低溫下的萌發(fā)。甜菜堿對苜蓿種子萌發(fā)的促進作用隨著溫度的下降而增大。