響應(yīng)面法優(yōu)化火絨草中總黃酮與總酚酸的提取工藝研究

關(guān)鍵詞：火絨草;總黃酮;總酚酸;快速溶劑萃取;響應(yīng)面法優(yōu)化;抗氧化活性

火絨草（Leontopodium leontopodioides（Wild.）Beauv.）是菊科火絨草屬（Leontopodium）多年生草本植物[1]，廣泛分布于世界各地，常見于歐洲和亞洲的寒帶、溫帶和亞熱帶地區(qū)[2]。在我國約有41種火絨草屬植物，主要分布于我國的東北、西北、華北和西南地區(qū)，其中有20多種在民間作為藥用植物[3]。近年來有關(guān)火絨草化學(xué)成分及其藥理活性研究較多，從火絨草屬中發(fā)現(xiàn)了多種具有藥理活性的化合物。如黃酮類、苯丙素類、葡萄糖二酸類等化合物[4-5]?，F(xiàn)已將火絨草提取物用于治療腹部疾病、心臟病、腹瀉、痢疾、肺炎、扁桃體炎和各種癌癥等多種人類和牲畜疾病，其中具有主要藥理活性的成分是黃酮類及酚酸類物質(zhì)[6-7]，綠原酸和阿魏酸等成分具有明顯抗氧化作用[8]。

目前，人們通常使用熱回流提取法、超聲波輔助提取法、二氧化碳超臨界流體萃取法等方法來萃取火絨草中的活性物質(zhì)[9-10]，但上述方法存在效率低、時間長、不環(huán)保等問題。本試驗中使用的快速溶劑萃取法是一種新型提取技術(shù)，在高溫高壓條件下使用有機溶劑萃取固體或半固體樣品的一種全自動萃取技術(shù)，具有成本低、萃取率高、萃取時間短、萃取純度高、綠色環(huán)保等優(yōu)點[11-12]。近年來，隨著活性物質(zhì)提取工藝的發(fā)展，該技術(shù)已逐漸應(yīng)用到提取多酚、多糖類化合物當(dāng)中[13]。孫海燕等[14]采用快速溶劑萃取法及正交試驗對櫻桃（PrunuspseudocerasusLindl.）核中類黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化;王國明等[15]研究發(fā)現(xiàn)使用快速溶劑萃取法萃取人參（Panaxginseng C.A.Mey.）多糖得率高于傳統(tǒng)的水提法。本研究以野生火絨草為原料，采用快速溶劑萃取法探究萃取時間、循環(huán)次數(shù)、加熱時間及萃取壓力等參數(shù)對總黃酮與總酚酸影響，通過響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為火絨草開發(fā)利用提供詳實的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試火絨草樣品于2022年8月取自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市克什克騰旗，經(jīng)鑒定為菊科火絨草屬長葉火絨草（Leontopodiumjunpeianum Kitam.），將樣品陰干，用粉粹機磨成粉，過60目篩后備用。

1.2 供試品溶液制備

精密稱取火絨草3g，置于40mL萃取池中，加入一定量的石英砂，以70%乙醇作為提取溶劑，按一定條件進(jìn)行萃取，過濾，用70% 乙醇定容至50mL，即得供試品溶劑，冷藏保存，備用。

1.3 總黃酮含量檢測方法

參照Zhi等[16-18]方法，稍作修改。取200μL不同濃度的蘆丁對照品與40μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液反應(yīng)6 min 后加入40μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 的Al（NO3）3 溶液，放置6min，再加入400μL1mol·L-1的NaOH和400μL的蒸餾水，搖勻，放置15min后，在510nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。得線性回歸方程：

式中M 為黃酮含量，單位：mg·g-1;C 為濃度，單位：mg·mL-1;V 為體積，單位：mL;n為倍數(shù);m 為質(zhì)量，單位：g。

1.4 總酚酸含量檢測方法

參照Naidu等[19-20]方法，稍作修改。取200μL不同濃度沒食子酸標(biāo)品與0.5 mLFolin-Ciocalteu試劑充分混勻，5min后加入1.5mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的NaCO3 溶液，蒸餾水定容至10 mL，置于75℃水浴中避光反應(yīng)10min，在765nm 處測定吸光度值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

得線性回歸方程：y=49.229x+0.0075 R2=0.9991

式中M 為黃酮含量，單位：mg·g-1;C 為濃度，單位：mg·mL-1;V 為體積，單位：mL;n為倍數(shù);m 為質(zhì)量，單位：g。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH 自由基清除試驗 參照Wang等[21]方法，取1.5mL不同濃度的火絨草提取液（0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg·mL-1）與0.75mL 的0.1mol·mL-1 DPPH 溶液充分混勻，避光反應(yīng)30min后以無水乙醇作為空白在517nm 處測定吸光度，得A1。取1.5mL不同濃度的火絨草提取液與0.75mL無水乙醇混勻，避光反應(yīng)30min后在517nm 處測定吸光度，得A2。取1.5mL 無水乙醇與0.75mL的0.1mol·mL-1 DPPH 溶液混勻，避光反應(yīng)30min后在517nm 處測定吸光度，得A0。以抗壞血酸作為陽性對照。根據(jù)吸光值計算DPPH清除率，并計算火絨草對DPPH 自由基的半數(shù)清除率IC50。

1.5.2 ABTS自由基清除試驗 參照Liang等[22]方法，取3.9mL的ABTS反應(yīng)液分別加入100μL不同濃度的火絨草提取液（0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg·mL-1）A2 或100μL無水乙醇溶液A1，避光反應(yīng)30min后，在734nm 處測定吸光值。以抗壞血酸作為陽性對照。根據(jù)吸光值計算ABTS清除率，并計算火絨草對ABTS自由基的IC50。

1.5.3 總還原力測定試驗 參照劉秀敏等[23]方法，稍作修改。取1mL不同濃度的供試溶劑分別加入0.2mL濃度為0.2mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）和0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫化鉀，搖勻后置于50℃水浴中反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻，加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸后在5000r·min-1下離心10min，取1.5mL上清液加入0.2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3 和3mL蒸餾水靜置10min后在700nm 處測定吸光度，以抗壞血酸作為陽性對照。吸光值越大表示樣品還原力越強。

1.6 火絨草總黃酮、總酚酸提取的單因素試驗

采用快速溶劑萃取儀提取火絨草中總黃酮與總酚酸，主要考察萃取溫度（45℃，60℃，75℃，90℃和105℃）、循環(huán)次數(shù)（1，2，3，4和5次）、提取時間（5，10，15，20和25min）和萃取壓力（80，90，100，110和120bar）等4個因素對火絨草總黃酮和總酚酸提取率的影響。以萃取溫度45℃、循環(huán)一次、提取5min和80bar設(shè)置為單因素基礎(chǔ)條件，當(dāng)研究某一因素時確定其他因素保持不變。所得提取液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定吸光度，計算總黃酮與總酚酸含量。

1.7 響應(yīng)面試驗優(yōu)化火絨草總黃酮和總酚酸提取工藝

基于Box-Benhnken試驗設(shè)計，綜合單因素試驗結(jié)果，固定萃取投料量3g，以總黃酮和總酚酸含量為響應(yīng)值，選擇萃取溫度（A）循環(huán)次數(shù)（B）提取時間（C）和萃取壓力（D）為自變量，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定最佳提取工藝條件，驗證最佳提取方法。方案如表1所示。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel2016 整理試驗數(shù)據(jù)作表，利用Origin2021軟件作圖，利用SPSS24軟件進(jìn)行方差分析，所有試驗均重復(fù)3 次利，用Desigin-Expert11軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗分析。P lt;0.05 表示具有顯著性差異，Plt;0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取火絨草總黃酮的單因素試驗

由圖1可知，在萃取溫度為45℃～90℃時，隨著溫度的增加提取含量隨之上升，萃取溫度為90℃時提取含量最高;繼續(xù)提高溫度，總黃酮提取含量有所下降;在循環(huán)1～3次時，隨著次數(shù)的增加提取含量有所上升，循環(huán)次數(shù)為3時提取含量最高，繼續(xù)增加次數(shù)，總黃酮提取含量并沒有得到增加，分析是火絨草在提取溶劑中的溶解度達(dá)到了飽和，不在溶出;在提取時間5～20min時，隨著時間的增加提取含量上升，15min時提取含量達(dá)到最高值;在25min后總黃酮提取含量有所下降;在萃取壓力80～100bar時，隨著壓力的增加提取含量有所上升，在100bar時提取含量達(dá)到最高值，在120bar時總黃酮提取含量雖有上升趨勢，但是沒有超過最高值，在高溫高壓條件下黃酮類的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因此將75℃～105℃、2～4次、15～25min、90～110bar設(shè)定為各因素考察范圍。

2.2 提取火絨草總酚酸的單因素試驗

由圖2可知，在90℃時，提取含量達(dá)到最高，為20.63mg·g-1;但溫度達(dá)到105℃ 時總酚酸提取含量有所下降;在循環(huán)1～3次時，隨著次數(shù)的增加提取含量上升，但循環(huán)次數(shù)超過3時提取含量迅速下降;在提取5～15min時，提取含量并沒有明顯上升，20 min后提取含量迅速上升，到達(dá)最高點;在萃取壓力為80～100bar時，隨著壓力的增加提取含量有所上升，在100bar時提取含量達(dá)到最高值，之后下降。因此將75℃ ～105℃、2～4次、15～25min、90～110bar設(shè)定為提取考察范圍。

2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面多元回歸方程建立 以火絨草總黃酮與總酚酸的含量為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計得到最佳提取工藝參數(shù)，試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表格3。對表2中響應(yīng)面的結(jié)果進(jìn)行了多元回歸方程擬合，并獲得以火絨草總黃酮含量和總酚酸含量為響應(yīng)值的多元回歸方程：Y1=-337.35+1.32A+20.76B+4.49C+4.87D-0.07AB+0.001AC-0.002AD-0.0024BC-0.066BD-0.0067CD-0.0049A2 -1.37B2 -0.098C2-0.021D2，Y2= -173.6+1.9442A+9.2442B+1.3468C+1.6664D-0.047AB-0.002AC-0.005AD+0.0395BC-0.005BD-0.003CD-0.007A2-0.885B2-0.026C2-0.006D2。

由表3可知，該模型極顯著（Plt;0.01），失擬項不顯著，R2，R2Adj，R2Pred及變異系數(shù)均在可接受范圍內(nèi)，說明模型具有較高的擬合度和可信度，可較好的分析與預(yù)測火絨草的提取工藝條件;其中A，B，C 和BD 對總黃酮提取含量有顯著影響（P lt;0.05），D，AB，A2，B2，C2 和D2 對總黃酮提取含量有極顯著影響（Plt;0.01）;而A，D，AB，AD，及二次項A2，B2，C2 和D2 對總酚酸含量均有極顯著影響。各因素對總黃酮提取含量的影響從高到低為：壓力gt;溫度gt;循環(huán)次數(shù)gt;提取時間;各因素對總酚酸提取含量的影響從高到低為：壓力gt;溫度gt;提取時間gt;循環(huán)次數(shù)。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析 如圖3a～3b所示，循環(huán)次數(shù)不變時，總黃酮提取含量隨著萃取溫度的增加先呈上升后下降的趨勢;當(dāng)萃取溫度不變時，總黃酮提取含量隨著循環(huán)次數(shù)的增加同樣先呈上升后下降的趨勢。萃取溫度與循環(huán)次數(shù)的等高線圖呈橢圓狀，說明兩項之間的交互影響較強;從等高線圖和三維圖的傾斜度可知，萃取溫度對總黃酮提取含量的影響大于循環(huán)次數(shù)。從圖3c～3d可知，循環(huán)次數(shù)不變時，總黃酮提取含量隨著萃取壓力的增大先呈略上升后下降的趨勢;當(dāng)萃取壓力不變時，總黃酮提取含量隨著循環(huán)次數(shù)的增加先呈升高后略微下降的趨勢。從等高線圖和三維圖的傾斜度可知，萃取壓力對總黃酮提取含量的影響略大于循環(huán)次數(shù)。

如圖4a～4b所示，萃取溫度不變時，總酚酸提取含量隨著循環(huán)次數(shù)的增加呈上升后迅速下降趨勢;當(dāng)循環(huán)次數(shù)不變時，總酚酸提取含量隨著萃取溫度的增加先呈上升后略微下降趨勢。從等高線圖和三維圖的傾斜度可知，萃取溫度對總酚酸提取含量的影響大于循環(huán)次數(shù)。從圖4c～4d可知，萃取溫度不變時，總酚酸提取含量隨著萃取壓力的增大先呈略上升后下降的趨勢;當(dāng)萃取壓力不變時，響應(yīng)面值隨著萃取溫度的增加先呈升高后下降趨勢。從等高線圖和三維圖的傾斜度可知，萃取壓力對總酚酸提取含量的影響大于萃取溫度。

綜上可知，結(jié)合模型結(jié)果和等高線得到提取總黃酮最佳工藝為：萃取溫度92.62℃，循環(huán)次數(shù)2.82次，提取時間19.66min，萃取壓力102.15bar，總黃酮提取含量為45.92mg·g-1。根據(jù)實際情況，修改為萃取溫度93℃，循環(huán)次數(shù)3次，提取時間20min，萃取壓力102bar?？偡铀嶙罴烟崛」に嚍椋狠腿囟?3.117℃，循環(huán)次數(shù)2.914次，提取時間19.72min，萃取壓力95.963bar，總酚酸提取含量為23.582mg·g-1。根據(jù)實際情況，修改為萃取溫度93℃，循環(huán)次數(shù)3次，提取時間20min，萃取壓力96bar。在所得最佳提取工藝條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，總黃酮提取含量為（45.45±0.36）mg·g-1，總酚酸提取含量為（23.52±0.34）mg·g-1，與模型得到的預(yù)測值相近，表明該模型優(yōu)化參數(shù)穩(wěn)定，且具有較高的可靠性。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 火絨草總黃酮對DPPH 自由基的消除影響

以抗壞血酸作為陽性對照，火絨草總黃酮對DPPH自由基的消除作用如圖5所示，隨著質(zhì)量濃度的增加DPPH 自由基消除率持續(xù)上升，火絨草總黃酮質(zhì)量濃度與DPPH 自由基清除率呈正相關(guān)作用，其IC50為0.012mg·mL-1。當(dāng)火絨草質(zhì)量濃度達(dá)到0.08mg·mL-1時消除率可達(dá)到80%以上。雖然低于抗壞血酸，但是對于DPPH 自由基，火絨草總黃酮表現(xiàn)出較好的消除作用。

2.4.2 火絨草總黃酮對ABTS自由基的消除影響

以抗壞血酸作為陽性對照，火絨草總黃酮對ABTS自由基的消除作用如圖6所示，隨著質(zhì)量濃度的增加ABTS自由基消除率呈緩慢上升的趨勢，火絨草總黃酮質(zhì)量濃度與ABTS自由基清除率呈正相關(guān)作用，其IC50為0.356mg·mL-1。與相同濃度的抗壞血酸相比，火絨草總黃酮對ABTS的清除率低于抗壞血酸。但也能表現(xiàn)出一定的消除能力。

2.4.3 火絨草總黃酮的總還原力 以抗壞血酸作為陽性對照，火絨草總黃酮的還原力如圖7所示，隨著質(zhì)量濃度的增加吸光度呈上升的趨勢，說明火絨草總黃酮質(zhì)量濃度與總還原力呈正相關(guān)。雖然總還原力低于抗壞血酸，但還是能表現(xiàn)出具有一定的還原能力。

3 討論

本試驗采用快速溶劑萃取法得出了火絨草中總黃酮與總酚酸的最佳提取工藝條件?？焖偃軇┹腿》ㄊ且环N新興的高壓自動萃取技術(shù)[24]，通過改變萃取溫度、提取時間、循環(huán)次數(shù)以及萃取壓力等因素來提高活性物質(zhì)的提取率。Chuang等[25]研究表明，與索式提取和熱回流提取相比，快速溶劑萃取法是一種簡單、有效、省時又先進(jìn)的一項技術(shù)。王鐸[26]分別采用超聲提取、回流提取、溫浸提取以及快速溶劑萃取四種方法對甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.）中的總黃酮進(jìn)行了提取，結(jié)果表明快速溶劑萃取法對甘草中總黃酮的提取為最佳，平均總黃酮含量達(dá)到10.63mg·g-1;Chamali等[27]探索出快速溶劑萃取法萃取桉樹（Eucalyptusspp.）總酚酸的最佳提取方法為：提取溫度179℃、提取時間36min。而有關(guān)火絨草活性物質(zhì)提取、純化工藝方面的研究較少，本研究對火絨草總黃酮與總酚酸提取工藝優(yōu)化進(jìn)行了初步探索，為后續(xù)火絨草活性物質(zhì)開發(fā)利用提供有效的技術(shù)支撐。

本研究中火絨草總黃酮提取含量受萃取溫度、萃取次數(shù)、加熱時間和萃取壓力的影響，其中提取時間的影響最小。唐巧玉等[28]研究使用快速溶劑萃取法提取水芹（Oenanthejavanica （Blume）DC.）中總黃酮時得出提取時間對總黃酮提取含量的的影響較小。而吳桐[29]在研究中指出影響蘆丁、金絲桃苷提取效果的因素順序為提取溫度gt;循環(huán)次數(shù)gt;提取壓力gt;提取時間，這與本試驗的結(jié)果有相同之處。原因可能是快速溶劑萃取法本身是一種快速提取的方法，大大節(jié)約了萃取時間，從而導(dǎo)致提取時間對提取率沒有較大影響。劉葉等[30]采用單因素試驗研究了快速溶劑萃取儀提取葡萄（Vitisvinifera L.）籽中多酚物質(zhì)的工藝并進(jìn)行了正交試驗優(yōu)化，在文中指出影響提取含量的主要影響因素為提取時間其次是提取溫度，提取壓力的影響效果最小，與本試驗結(jié)果存在差異，可能是因為本試驗中萃取壓力設(shè)置的水平之間差異較大，從而導(dǎo)致萃取壓力對總酚酸提取含量影響較大。Wang等[31]在研究中提出隨著溫度、循環(huán)次數(shù)、提取時間和萃取壓力的增加總酚酸含量有所上升，到達(dá)一定程度后又開始下降，在本試驗結(jié)果中也存在這種現(xiàn)象，而這種現(xiàn)象可用快速溶劑萃取儀的基本原理來解釋：高壓的應(yīng)用使萃取溶劑高于其沸點，并迫使溶劑擴散進(jìn)入樣品基質(zhì)，而更高的溫度使得溶劑具有更好的溶解能力和更低的粘度，并減弱樣品與溶劑之間的相互作用，從而增加了傳質(zhì)，提高了萃取率[32-33]。

本研究通過測定火絨草總黃酮提取液對DPPH、ABTS自由基的消除率及總還原力來檢測火絨草活性物質(zhì)的抗氧化活性。DPPH 自由基在可見光范圍內(nèi)有特征吸收[34]，ABTS自由基會被抗氧化物抑制[35]，因此都是測定抗氧化活性的重要指標(biāo)?？傔€原力是測定潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)，其機理是通過樣品將Fe3+ 還原成Fe2+ ，中斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[36]。展銳等[37]通過測定火絨草提取物的總還原力、羥自由基清除能力等比較了火絨草醇提物和水提物的抗氧化活性，結(jié)果表明，火絨草提物都具有較強的抗氧化活性，且醇提物的作用比水提物更有佳。吳楠貞等[3]研究發(fā)現(xiàn)火絨草醇提物有較強的抗氧化活性，這與本研究結(jié)果相似。綜上所述，火絨草提取物可作為一種天然的抗氧化劑，有清除體內(nèi)的自由基和抗脂質(zhì)氧化等功能。

4 結(jié)論

本試驗以火絨草為原料使用快速溶劑萃取法萃取火絨草中總黃酮與總酚酸，結(jié)果表明，總黃酮最佳提取方法為：萃取溫度93℃，循環(huán)次數(shù)3次，提取時間20min，萃取壓力102bar;總酚酸最佳提取方法為：萃取溫度93℃，循環(huán)次數(shù)3 次，提取時間20min，萃取壓力96bar。驗證試驗結(jié)果表明，總黃酮提取含量為（45.45±0.36）mg·g-1，總酚酸提取含量為（23.52±0.34）mg·g-1，與模型擬合度高，可用于優(yōu)化提取工藝。

本試驗對火絨草總黃酮提取液進(jìn)行了抗氧化活性研究，研究發(fā)現(xiàn)，火絨草總黃酮提取液對DPPH自由基的IC50為0.012mg·mL-1;對ABTS自由基的IC50為0.356mg·mL-1;具有一定還原力，說明火絨草具有較好的抗氧化活性。