鎘脅迫對南方莧種子萌發(fā)及幼苗生長和生理的影響

關鍵詞：南方莧;鎘脅迫;種子萌發(fā);生理特性;轉運系數(shù);富集系數(shù)

由于工業(yè)生產中“三廢”的不合理排放以及現(xiàn)代農業(yè)中各種農藥化肥的大量使用，導致了土壤中重金屬污染問題，其中鎘（Cadmium，Cd）是污染源中最為嚴重的重金屬元素之一[1-2]。鎘具有毒性大、遷移性強、生物積累和放大效應顯著等特點，能夠通過動植物遷移進入食物鏈而最終進入人體器官產生健康危害[3]。因此，對鎘污染土壤的修復治理與安全利用已經(jīng)引起國內外的高度重視。利用超富集植物進行鎘污染修復是一種常見的重金屬污染土壤修復技術，具有技術簡單、成本低、經(jīng)濟和生態(tài)效益顯著等特點，目前已受到高度認可和廣泛應用。有研究報道，寶山堇菜（Violabaoshangensis）[4]、印度芥菜（Brassicajunicea）[5]、龍葵（Solanumnigrum ）[6]、天藍遏藍菜（Thlaspicaerulescens）[7]、東南景天（Sedumalfredii）[8]、商陸（Phytolaccaacinosa）[9]等植物為Cd超富集植物，但存在生物量相對較小或地域適應性相對較窄等不足。因此，篩選和培育耐鎘和超富集鎘且生物量大、適應性強的植物，豐富鎘污染土壤修復的植物種類對。

植物種子的萌發(fā)和幼苗生長是開展植物修復的關鍵開端，也是植物對外界環(huán)境最敏感的時期之一，萌發(fā)和幼苗階段的生長狀況直接影響后期的生長發(fā)育與修復效果[10]。除此之外，在萌發(fā)和幼苗階段開展重金屬響應與耐受性評價具有操作簡便、可重復性強等特點[11-13]。幼苗受到重金屬脅迫時因鎘離子積累而細胞膜受損，植株內的抗氧化酶系統(tǒng)如超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）等常被誘導顯著增強進而清除過量的活性氧和超氧陰離子以緩解傷害[14]。此外，在重金屬離子脅迫下，植物細胞內還會通過生物合成配體化合物以螯合重金屬并以復合物的形式進行區(qū)域化隔離而降低重金屬的毒害[15]。其中非蛋白巰基（Non-proteinthiol，NPT）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、植物螯合肽（Phytochelatins，PCs）等含巰基類化合物在結合Cd離子、減少細胞內自由態(tài)Cd中發(fā)揮重要作用[16]。

莧屬植物被報道對鎘脅迫的耐受性及鎘富集能力非常強，其中千穗谷（Amaranthushypochondriacus）、尾穗莧（A.caudatus）和綠穗莧（A.hybridus）轉移系數(shù)達1.07～1.50，富集系數(shù)達5.18～17.55，地上部分Cd含量可高達128.39～354.56mg·kg-1，均具有超富集鎘的特性[17-19]。南方莧（A.australis）是莧科莧屬一年生草本植物，具有生物量大、品質和適應性好等特性，可開發(fā)作為牧草利用。此外，作者團隊預試驗發(fā)現(xiàn)南方莧對重金屬鎘具有較好的耐性和富集特性，但目前未見針對莧屬植物中南方莧在種子萌發(fā)和幼苗生長期耐鎘和富集鎘特性的研究。本研究探討南方莧種子在不同鎘濃度下的萌發(fā)情況，以及鎘脅迫對南方莧幼苗生長與生理特性的影響，旨在為篩選和評價鎘修復植物及其推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試南方莧種子來自美國農業(yè)部種質資源庫（編號為PI553076），由湖南農業(yè)大學草業(yè)科學系保存，萌發(fā)試驗和幼苗試驗均在湖南農業(yè)草業(yè)科學研究所步入式生長室中進行。重金屬鎘的供源為氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），購自阿拉丁試劑官網(wǎng)（Aladdin）。

1.2 試驗設計與處理

1.2.1 萌發(fā)試驗 根據(jù)土壤環(huán)境質量標準（GB15618—2018）和地表水環(huán)境質量標準（GB3838—2002），以去離子水作為對照組（CK），重金屬溶液均用去離子水進行配制，設置低、中、高3個鎘濃度范圍，Cd2+ 的濃度分別為10，20和40mg·kg-1。采用高溫滅菌后的塑料發(fā)芽盒（長12cm×寬12cm×高5cm），每個發(fā)芽盒里放置3層滅菌后的濾紙，然后分別加入10，20和40mg·kg-1 濃度的鎘溶液20mL以讓濾紙充分濕潤而水分又不會過多。選取顆粒飽滿、大小均勻的南方莧種子用5% NaClO 溶液消毒5min，再用蒸餾水沖洗2～3次，均勻散布于發(fā)芽盒中，每個發(fā)芽盒放置50粒種子，然后將發(fā)芽盒用封口膜密封以防水分蒸發(fā)而發(fā)芽期間不需要額外補充水分，每個處理4次重復（4個發(fā)芽盒）。將發(fā)芽盒置于溫度為25℃/20℃（晝/夜）、光周期為14h/10h（光照/黑暗）、光強為200μmol·m-2·s-1和相對濕度為75%的人工氣候室中。

1.2.2 幼苗試驗 采用沙培法進行幼苗生長試驗，將潔凈的沙子過2mm 篩滅菌后裝入高12cm，上口徑6cm，下口徑5cm 的塑料杯中，杯底留3個小孔并墊一層濾紙以利濾出多余水分，每杯播種2～3粒種子。試驗在與種子萌發(fā)試驗相同條件的人工氣候室中進行，每天加入去離子水保持細沙濕潤以利種子萌發(fā)。待南方莧幼苗長出1～2片真葉時間苗，每杯留一株健壯幼苗，并開始用1/2Hoagland營養(yǎng)液進行澆灌培養(yǎng)。待幼苗長出6片真葉左右時用CdCl2 進行鎘脅迫，CdCl2 用1/2Hoagland營養(yǎng)液配制，鎘濃度設置與萌發(fā)試驗相同，每個鎘處理濃度設4次重復，每個重復共3株幼苗（3杯），每個鎘處理共12株幼苗。每隔一天每杯澆灌約100mL 用1/2Hoagland營養(yǎng)液配制的鎘濃液，對照澆100mL1/2Hoagland營養(yǎng)液，脅迫10d后取樣進行生長和生理生化指標及鎘含量測定分析。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 萌發(fā)期相關指標測定 每天觀察并記錄發(fā)芽情況，發(fā)芽標準為胚根突破種皮1mm 且發(fā)育正常（GB/T2930.4—2017）。第4d統(tǒng)計發(fā)芽勢，第14d統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，萌發(fā)結束后隨機抽取10株幼苗用數(shù)顯游標卡尺測定胚根、胚芽長。本試驗測定的指標有發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長、胚芽長，并根據(jù)公式計算種子發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù)[10，20]。相關計算方法如下：

發(fā)芽勢（%）= （第4d種子發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù)）×100;

發(fā)芽率（%）= （第14d種子發(fā)芽粒數(shù)/供試種子粒數(shù)）×100;

發(fā)芽指數(shù)（GI）= Σ（Gt/Dt）（Gt為t時間的萌發(fā)數(shù)，Dt為相應的萌發(fā)天數(shù)）

種子活力指數(shù)（VI）= GI×S（GI為發(fā)芽指數(shù)，S為根長）。

1.3.2 幼苗期相關指標測定 （1）生長指標測定：鎘處理結束后用直尺測量植株根莖處至生長點的高度為株高;植株從沙培中取出并在自來水下沖洗干凈后將地上和地下部分開，在105℃下殺青15min，80℃烘至恒重，稱得各部分的干重，并計算根冠比，即地下部干重與地上部干重之間的比率。

（2）葉片相對電導率：參考李雙銘等[21]的方法進行測定，按下式計算：相對電導率（%）=[E1/E2]×100，E1表示初始電導率，E2表示最大電導率。

（3）丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性測定：參考李雙銘等[21]的方法進行測定。采用硫代巴比妥酸反應法測定MDA 含量，氮藍四唑（NBT）光化還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）活性，紫外吸收分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性。

（4）植物螯合肽（Phytochelatins，PCs）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量的測定：準確稱取新鮮葉片樣品0.2g放置于研缽中液氮冷凍并研磨成均勻粉末，加入3mLPBS提取液（pH7.2～7.4）4℃下研磨成勻漿，12000g離心10min，收集上清液用于PCs和GSH 含量測定。測試方法與步驟根據(jù)江蘇寶萊生物科技有限公司相應的試劑盒說明書進行。非蛋白巰基總量（NPT）=植物螯合肽（PCs）+谷胱甘肽含量（GSH）[22]。

（5）地上和地下部鎘含量測定：

分別稱取烘干后的根、莖和葉樣品0.3g，采用濕式消解法，用HNO3-HClO4（5 ∶ 1，體積比）消解，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICPE-9000，日本島津）進行檢測，設置空白對照并使用國家標準物質（GBW07063）進行質量控制（95% ±5%）。

試驗結束各處理株高測定完成后，收獲植株，先將其根、莖、葉分開，根和莖用乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）溶液浸泡30min脫去表面附著的金屬離子，用去離子水沖洗干凈后105℃烘箱內殺青15min，70℃下烘至恒重。烘干樣粉碎過100目篩，樣品用HNO3-HClO4 消解后定容，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（PerkinElmer，USA）測定Cd的含量。采用以下公式計算Cd轉運系數(shù)和富集系數(shù)：

富集系數(shù)（Bioaccumulationfactor，BCF）= 地上部Cd濃度/生長基質中Cd濃度;

轉移系數(shù)（Translocationfactor，TF）=地上部Cd濃度/地下部Cd濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)采用Excel處理，用SPSS軟件包進行單因素方差分析，用Duncan’s新復極差法進行平均數(shù)的顯著性檢驗，用Sigmplaot10.0作圖。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對南方莧種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，與對照（0mg·kg-1Cd）相比，10，20和40mg·kg-1濃度的Cd處理對南方莧種子的發(fā)芽勢（圖1A）、發(fā)芽率（圖1B）和發(fā)芽指數(shù)（圖1C）均無顯著影響，但是顯著降低了種子的活力指數(shù)（Plt;0.05），相比對照，在10，20和40mg·kg-1的Cd處理下活力指數(shù)分別下降了12.9%，40.2%和110.5%（圖1D），表明在40mg·kg-1的鎘濃度范圍對南方莧的萌發(fā)無顯著影響，但對其生長具有抑制效應。

2.2 鎘脅迫對南方莧胚根和胚芽長的影響

由圖2可知，不同鎘濃度對南方莧種子萌發(fā)后的胚根和胚芽長度影響不同。在10，20和40mg·kg-1濃度的Cd處理下胚根長度顯著下降（Plt;0.05），分別下降至對照的89.7%，68.9%和31.5%（圖2A），胚芽長度在20和40mg·kg-1濃度的Cd處理下顯著下降（Plt;0.05），分別下降至對照的81.8%和67.8%（圖2B）。與對照相比，10和20mg·kg-1濃度的Cd處理對南方莧種子萌發(fā)后根/芽比無顯著影響，但40mg·kg-1濃度的Cd處理顯著降低了南方莧種子萌發(fā)后的根/芽比（圖2C）（Plt;0.05），表明較高濃度的鎘對根的影響要顯著大于芽。

2.3 鎘脅迫對南方莧幼苗生長的影響

由圖3可知，南方莧幼苗的株高、地上和地下部干重均隨著Cd濃度處理的升高而呈下降趨勢，但在10mg·kg-1Cd濃度處理下與對照相比無顯著差異。20和40mg·kg-1濃度的Cd處理顯著降低了南方莧幼苗的株高、地上和地下部干重（Plt;0.05），株高分別下降至對照的83.2%和57.3%（圖3A），地上部干重下降至對照的74.1%和56.2%（圖3B），地下部干重下降至對照的67.4%和44.2%（圖3C）。不同濃度的Cd處理對南方莧幼苗的根/冠比無顯著影響（圖3D）。

2.4 鎘脅迫對南方莧幼苗葉片細胞膜穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，南方莧幼苗葉片的相對電導率和MDA含量均隨著鎘脅迫處理濃度的升高而增加。在10，20和40mg·kg-1濃度的Cd處理下相對電導率分別增至對照的1.5，2.9和4.3倍（圖4A），而MDA含量則增至對照的1.4，2.6和3.9倍（圖4B）。

2.5 鎘脅迫對南方莧幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖5可知，南方莧幼苗葉片的SOD和POD活性在10和20mg·kg-1濃度的Cd處理下顯著升高（Plt;0.05），分別升至對照的2.1和3.2倍，而40mg·kg-1濃度的Cd處理下SOD和POD活性則與對照無顯著差異（圖5）。CAT 活性隨Cd濃度的升高而顯著下降（Plt;0.05），在10，20和40mg·kg-1濃度的Cd處理下CAT活性分別下降至對照的78%，67%和50%（圖5）。

2.6 鎘脅迫對南方莧幼苗螯合肽、谷胱甘肽及非蛋白巰基含量的影響

由圖6可知，南方莧幼苗葉片和根系中的PCs，GSH 和NPT 含量在不同Cd濃度處理下均顯著增加（Plt;0.05）。10，20和40mg·kg-1Cd濃度處理下葉中PCs含量分別增加至對照的1.3，1.9和2.1倍，GSH含量分別增加至對照的2.0，3.2和3.0倍，NPT含量分別增加至對照的1.4，2.1和2.2倍;根中PCs含量分別增加至對照的2.1，2.4和1.6倍，GSH 含量分別增加至對照的2.5，3.6和2.9倍，NPT含量分別增加至對照的2.2，2.7和1.8倍。

2.7 鎘脅迫對南方莧幼苗鎘吸收與轉運和富集的影響

由圖7可知，南方莧幼苗地上部和地下部Cd含量以及植株的轉運系數(shù)和富集系數(shù)均隨著Cd處理濃度的升高而顯著增加（Plt;0.05）。10，20和40mg·kg-1濃度Cd處理下南方莧幼苗地上部Cd含量分別為12.6，56.4和186.5mg·kg-1，地下部Cd含量分別為16.6，42.3和95.6mg·kg-1（圖7A），轉運系數(shù)分別為0.76，1.33和1.95，富集系數(shù)分別為1.48，3.28和5.14（圖7B）。

3 討論

3.1 南方莧種子萌發(fā)對鎘的響應

種子萌發(fā)是植物生長的一個最初過程，種子萌發(fā)期的相關生長指標能夠反映植物耐鎘能力的強弱。本研究中，鎘脅迫對南方莧種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均無顯著影響。這與低濃度鎘脅迫對繁穗莧（A.cruentus）[10] 和百日草（Zinniaelegans）[23]種子萌發(fā)的影響結果相一致。種子萌發(fā)在重金屬離子的脅迫下會呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象[24]，可能是本試驗濃度設置較低，南方莧種子在0～40mg·kg-1鎘濃度處理下的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)表現(xiàn)出無顯著影響，但鎘處理顯著降低了南方莧種子的活力指數(shù)以及萌發(fā)后的胚根長度，這種現(xiàn)象在野牡丹（Melastomacandidum ）種子[25]耐鎘性研究中的得到同樣的體現(xiàn)，原因可能是根相較于芽更先接觸到重金屬離子，從而產生大量自由基，超過自身氧化防御系統(tǒng)的過量自由基將傷害植物根系，影響胚根的生長，當重金屬離子濃度達到一定程度時，將出現(xiàn)根系無法生長的情況。

3.2 南方莧幼苗生長對鎘的響應

植物吸收金屬鎘后，主要在根、莖、葉等組織中積累。本研究中，南方莧幼苗的株高、地上和地下部干重均隨著鎘濃度的升高而下降，這與鎘脅迫對桑樹（Morusalba）[26]、柳枝稷（Panicumvirgatum ）[27]和狼尾草（Pennisetumalopecuroides）幼苗[28]生長的影響結果相似。鎘脅迫對南方莧幼苗生長產生抑制作用，說明幼苗初期的生長狀況比種子萌發(fā)更能體現(xiàn)鎘毒性的大小。不同濃度的鎘處理對南方莧幼苗的根/冠比無顯著影響，這與鎘脅迫對雞冠花（Celosiacristata）[29]幼苗生長影響結果相似，說明南方莧幼苗具有一定的鎘耐受能力。

3.3 鎘對南方莧幼苗生理特性的影響

當植物受到逆境影響時，電導率和MDA 能直接反映膜系統(tǒng)受損傷程度，而抗氧化系統(tǒng)的SOD，POD和CAT活性水平能反應植物對外界逆境環(huán)境的抗性程度。本研究中，南方莧幼苗葉片的電導率和MDA 含量均隨著鎘濃度的升高而增加，這表明南方莧植株的細胞膜系統(tǒng)受到了鎘的毒害，植株生長發(fā)育受到抑制。SOD 活性和POD 活性在10和20mg·kg-1的鎘處理下顯著升高，而40mg·kg-1濃度的鎘處理下則與對照無顯著差異，CAT活性隨鎘濃度的升高而顯著下降，這與鎘脅迫對小白菜（Brassicacampestris）[14]和尾穗莧[18]幼苗生理特性研究結果相似。低濃度鎘脅迫下，植物體內抗氧化酶活性呈上升趨勢，由于植物調節(jié)鎘毒害能力有限，當植物處于高濃度鎘脅迫或者超過一定時間后，活性氧清除酶的能力則會降低[30]。本研究中，南方莧幼苗SOD和POD活性在低濃度鎘脅迫中發(fā)揮主要作用，當鎘濃度到達40 mg·kg-1 時，SOD 和POD酶對膜系統(tǒng)的保護作用降低?？梢娔戏角{幼苗在鎘毒害環(huán)境中能通過自身調節(jié)抗氧化系統(tǒng)機制減少逆境對自身的傷害，以達到適應環(huán)境的目的。王瑜等[31]在狼尾草（Pennisetumalopecuroides）幼苗中的研究結果顯示CAT 活性隨著鎘濃度的升高而升高，張秀娟等[32]在黑麥草（Loliumperenne）中的研究結果則顯示CAT 活性隨著鎘濃度的升高而先升后降，而陳順鈺等[33]在寬葉雀稗（Paspalumwettsteinii）幼苗期研究表明CAT 活性隨鎘濃度的升高先下降后升高，本研究中南方莧幼苗的CAT活性則隨著鎘濃度的升高呈顯著下降趨勢，表明可能不同的植物種類在不同鎘濃度處理下CAT 活性的響應和變化趨勢存在差異，鎘脅迫下南方莧體內的抗氧化防御酶起主要作用為SOD 和POD，而CAT活性僅顯示了受鎘脅迫的程度的大小。

NPT是植物螯合作用的主要物質之一，其中GSH 和PCs的濃度大小反映了植物遭受重金屬毒害的程度。本研究中，南方莧幼苗葉片和根系中的巰基化合物含量均隨鎘濃度的增加而增加，這與鎘脅迫對秋華柳（Salixvariegata）[34]的影響結果相一致?？梢娫阪k脅迫下，南方莧幼苗能迅速作出反應，合成大量GSH 和PCs與進入細胞內的鎘發(fā)生螯合作用，形成無毒化合物，從而提高對鎘的耐受和解毒能力。當鎘濃度達到40mg·kg-1時，南方莧幼苗葉中巰基化合物含量均超過根系，說明植物為了更有效地清除鎘毒害產生的自由基，驅使根系運輸更多的巰基化合物到葉片，以增強其抗氧化脅迫的能力。

3.4 鎘脅迫對南方莧幼苗鎘吸收與轉運的影響

富集系數(shù)與轉運系數(shù)常用于評估超富集植物對重金屬的富集特征，其數(shù)值的高低直接影響植物能否應用于重金屬污染土壤的實地修復[35-37]。本研究中，南方莧幼苗地上部和地下部鎘含量以及植株的轉運系數(shù)和富集系數(shù)均隨著鎘處理濃度的升高而增加，處于10，20和40mg·kg-1鎘濃度處理下的南方莧幼苗地上部鎘含量分別為12.6，56.4和186.5mg·kg-1，已超過土壤環(huán)境鎘含量，且在40mg·kg-1鎘濃度處理下超過地下部，并超過了100mg·kg-1這一鎘超積累植物臨界含量標準[38]。轉運系數(shù)在0.76～1.95 之間，富集系數(shù)在1.48～5.14之間，說明南方莧幼苗對重金屬鎘有較強的吸收能力，能將鎘金屬元素有效轉運至植株地上部分，具有鎘超富集植物的特征。

4 結論

在0～40mg·kg-1的鎘濃度范圍內對南方莧種子萌發(fā)無顯著影響，但對其生長有顯著影響，表現(xiàn)為胚根和胚芽長度以及幼苗株高降低。南方莧幼苗對鎘脅迫具有較好的耐性，主要是通過提高體內PCs，GSH 和NPT 含量來提高對鎘的適應和耐性。沙培條件下南方莧地上部和地下部鎘含量以及植株的轉運系數(shù)和富集系數(shù)均隨著Cd處理濃度的升高而增加，轉運系數(shù)在0.76～1.95之間，富集系數(shù)在1.48～5.14之間，表明南方莧對重金屬鎘有較強的吸收和轉運能力，具有鎘超富集植物的特征和應用于鎘污染土壤修復的潛力。