蘇丹草和高丹草轉(zhuǎn)錄組測序及其差異基因表達分析

關(guān)鍵詞：蘇丹草;高丹草;轉(zhuǎn)錄組分析;分蘗調(diào)控;粗蛋白合成;木質(zhì)素合成

蘇丹草（Sorghumsudanense （Piper）Stapf.）是禾本科高粱屬重要的一年生暖季型（C4）禾本科牧草[1]。蘇丹草耐旱，產(chǎn)量高，營養(yǎng)價值高，在世界各地被作為重要飼料作物廣泛栽培[2-4]，素有“漁業(yè)青飼料之王”之美譽[5]。高丹草（Sorghum bicolor （Linn.）Moench.×Sorghumsudanense （Piper）Stapf.）為高粱（Sorghumbicolor （Linn.）Moench.）與蘇丹草（Sorghumsudanense（Piper）Stapf.）雜交而成的一年生禾本科牧草[6]，既有高粱的高產(chǎn)草量、高適應(yīng)性和強抗逆性等特點，也具有蘇丹草莖葉比小、強分蘗性和再生性、高營養(yǎng)價值等優(yōu)點，對農(nóng)區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)有著重要利用價值，目前已成為我國畜牧業(yè)發(fā)展的首選飼料之一[7-8]。研究表明，飼用高粱（包括蘇丹草和高丹草）的株型是影響其產(chǎn)量的主要因素[9-11]。粗蛋白含量顯著影響飼用高粱的營養(yǎng)品質(zhì)及經(jīng)濟價值[6，11-14]。飼用高粱的木質(zhì)素與植物體形態(tài)建成緊密相關(guān)[15-17]。

目前關(guān)于蘇丹草和高丹草的研究主要集中在引種栽培比較[18]、生物性狀比較[19]、干旱脅迫的生理響應(yīng)與抗旱性比較[20]、簡單重復(fù)序列標記（Simplesequencerepeat，SSR）指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[21]等方面。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，利用組學(xué)技術(shù)解析牧草抵御逆境脅迫機制、挖掘關(guān)鍵農(nóng)藝性狀功能基因，成為目前研究關(guān)注的焦點[22]。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（Transcriptomesequencing，RNA-seq）是研究飼用高粱表型和細胞功能的重要方法，也是挖掘飼用高粱重要性狀相關(guān)基因、揭示飼用高粱基因調(diào)控及表達規(guī)律的最有效工具之一[23]。目前，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)在高丹草[24]、蘇丹草[2]等單核苷酸多態(tài)性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）及等位基因特異性表達、SSR分子標記開發(fā)及遺傳多樣性評價等研究中廣泛應(yīng)用，而關(guān)于飼用高粱分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)機理的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究還鮮有報道。盧倩倩等[6]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對高丹草進行測序分析，最終獲得與高丹草粗蛋白合成相關(guān)的基因25個，其中20個基因在拔節(jié)盛期上調(diào)表達，5個基因在拔節(jié)盛期下調(diào)表達。

‘優(yōu)牧2號’高丹草和‘寧農(nóng)’蘇丹草是江西等南方省區(qū)普遍種植的一年生高產(chǎn)牧草品種，也是南方地區(qū)“糧改飼”種植模式的2種優(yōu)選牧草。有研究表明，大田栽培的‘優(yōu)牧2號’高丹草分蘗數(shù)低于‘寧農(nóng)’蘇丹草，‘優(yōu)牧2號’高丹草粗蛋白含量高于‘寧農(nóng)’蘇丹草，‘優(yōu)牧2號’高丹草比‘寧農(nóng)’蘇丹草更抗倒伏[25]。但‘優(yōu)牧2號’高丹草和‘寧農(nóng)’蘇丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成關(guān)聯(lián)基因的表達無相關(guān)報道，挖掘兩者分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成關(guān)聯(lián)基因有利于其在江西的進一步推廣種植。

本研究分別以‘優(yōu)牧2號’高丹草和‘寧農(nóng)’蘇丹草為材料，在建立其組培無菌體系的基礎(chǔ)上，對其分蘗數(shù)以及粗蛋白和木質(zhì)素含量進行統(tǒng)計和測定，再經(jīng)RNA-seq測序分析、差異基因篩選和鑒定，挖掘出與蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)的功能基因，并對蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成關(guān)聯(lián)基因的表達進行qRT-PCR驗證，最后運用SPSS24.0軟件對蘇丹草和高丹草試管苗的分蘗數(shù)、粗蛋白含量、木質(zhì)素含量以及分蘗調(diào)控、粗蛋白合成和木質(zhì)素合成相關(guān)功能基因qRT-PCR 的相對表達量進行Pearson相關(guān)性分析，初步揭示蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成的分子機制，以期為蘇丹草和高丹草品種選育及種質(zhì)創(chuàng)新等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘寧農(nóng)’蘇丹草（SDC）和‘優(yōu)牧2 號’高丹草（GDC）種子（由北京正道種業(yè)有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 無菌體系的建立 選取蘇丹草和高丹草大小均一且飽滿的種子，先用75%酒精處理1min，無菌沖洗3次后，再用0.1%氯化汞處理30min，無菌沖洗3次后，接種到MS固體培養(yǎng)基上，約20d后即可獲得蘇丹草和高丹草的試管苗（圖1）。

1.2.2 單株分蘗數(shù)的統(tǒng)計以及粗蛋白和木質(zhì)素含量的測定 將蘇丹草和高丹草的莖葉和根切除，保留植株基部，重新接種到新鮮的MS培養(yǎng)基上。60d后統(tǒng)計蘇丹草和高丹草的分蘗數(shù)，并測定蘇丹草和高丹草粗蛋白和木質(zhì)素的含量。單株分蘗數(shù)（Numberoftillers，NT）為每個處理萌發(fā)的總分蘗數(shù)/每個處理接種的植株數(shù)[26];蘇丹草和高丹草植株基部以上莖稈和葉片部分的粗蛋白（Crudeprotein，CP）含量利用近紅外光譜儀（SpectraStar2600XT 型，美國UnityScientific）進行測定[6];蘇丹草和高丹草植株基部以上莖稈和葉片部分的木質(zhì)素（Lignin，LN）含量依據(jù)Schwanninger等[27]的Kason法進行測定。

1.2.3 酶活性和內(nèi)源激素含量的測定 將蘇丹草和高丹草的莖葉和根切除，保留植株基部，重新接種到新鮮的MS培養(yǎng)基上。60d后取蘇丹草和高丹草植株基部以上的莖稈和葉片部分進行生理生化指標的測定。依據(jù)帥良等[28]的方法提取果糖激酶（Fructokinase，F(xiàn)RK）并用紫外分光光度計測定FRK活性;依據(jù)王姣等[29]的方法測定苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性;依據(jù)黃樹蘋等[30]的比色法測定多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性;采用島津超高效液相色譜儀（LC-30AT）測定獨角金內(nèi)酯（Strigolactones，SLs）含量;采用反肉桂酸4-單加氧酶（Trans-cinnamate4-monooxygenase，C4H）ELISA 檢測試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）測定反肉桂酸4-單加氧酶（C4H）活性。

1.2.4 RNA 的提取、cDNA 文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序 利用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）提取蘇丹草和高丹草植株基部以上的莖稈和葉片部分的RNA。RNA 濃度和純度采用Nanodrop2000進行檢測，RNA 完整性采用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，RIN 值采用Agilent2100進行測定。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對蘇丹草（SDC）和高丹草（GDC）樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，測序平臺為illumina NovaSeq 6000 （illumina，USA）。生物學(xué)3次重復(fù)。

1.2.5 測序數(shù)據(jù)分析及基因注釋 高質(zhì)量序列（Cleanreads）的獲得采用原始數(shù)據(jù)過濾、GC含量分布及測序錯誤率檢查的方法。Cleanreads與高粱參考基因組數(shù)據(jù)庫（NCBIv3）（PRJCA012970）的比對采用HISAT2軟件[6]。所有轉(zhuǎn)錄本比對的六大數(shù)據(jù)庫為NR，Swiss-Prot，Pfam，COG，GO和KEGG數(shù)據(jù)庫。

1.2.6 差異基因的篩選與分析 對樣本間共有與特有表達基因/轉(zhuǎn)錄本進行Venn分析和相關(guān)性分析?；?轉(zhuǎn)錄本ReadCounts的數(shù)目獲得后，進行差異表達分析。

1.2.7 分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)基因的實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測 為驗證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的可靠性，利用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）提取蘇丹草和高丹草植株基部以上的莖稈和葉片部分的RNA;利用北京全式金生物技術(shù)股份有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（EasyScript·First-StrandcDNASynthesisSuperMix）進行RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在篩選所得的與粗蛋白合成相關(guān)的差異表達基因中，隨機選取6 個，即TRINITY _DN21156_c0_g1（hexokinase-3，己糖激酶-3，HXK3）、TRINITY_DN5697_c0_g2（aspartateaminotransferase，chloroplastic，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ASPAT ）、TRINITY_DN14734_c0_g1（fructokinase-2，果糖激酶2，F(xiàn)RK2）、TRINITY_DN46 _c0 _g2 （S-adenosylmethioninesynthase1，S-腺苷甲硫氨酸合成酶1，SAMS1）、TRINITY_DN31771_c0_g1（polyphenoloxidaseII，chloroplastic，多酚氧化酶II，PPOII）、TRINITY_DN12259_c0_g1（bifunctionalaspartokinase/homoserinedehydrogenase2，chloroplasticisoformX1雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2，AKI/DHI2）;在篩選所得的與木質(zhì)素合成相關(guān)的差異表達基因中，隨機選取2 個，即TRINITY_DN15425_c0_g2（phenylalanineammonialyase，苯丙氨酸解氨酶，PAL）、TRINITY_DN21502_c0_g1（trans-cinnamate4-monooxygenase，反-肉桂酸4-單加氧酶，C4H ）;在篩選所得的與分蘗調(diào)控相關(guān)的差異表達基因中，隨機選取1個，即TRINITY_DN23078_c0_g2 （strigolactoneesteraseD14，獨角金內(nèi)酯酯酶D14，SLsED14），以EIF4a 基因[31]作為內(nèi)參基因進行qRT-PCR分析。利用PrimerPremier5軟件設(shè)計引物，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量（Relativequantification，RQ值）。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 實驗重復(fù)三次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差;差異顯著性檢驗和Pearson相關(guān)性分析采用SPSS19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇丹草和高丹草單株分蘗數(shù)及其粗蛋白和木質(zhì)素含量比較

由圖2可知，高丹草的單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草（Plt;0.05），蘇丹草的單株分蘗數(shù)是高丹草的1.78倍;但高丹草的粗蛋白和木質(zhì)素含量顯著高于蘇丹草（Plt;0.05），與蘇丹草相比，高丹草的粗蛋白和木質(zhì)素含量分別增加了50.19%和36.44%。

2.2 蘇丹草和高丹草酶活性和內(nèi)源激素含量的比較

由圖3可知，高丹草的獨角金內(nèi)酯（SLs）含量以及果糖激酶（FRK）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、反肉桂酸4-單加氧酶（C4H）活性顯著高于蘇丹草（Plt;0.05），與蘇丹草相比，高丹草的SLs含量以及FRK，PAL，PPO，C4H 活性分別增加57.88%，28.37%，58.27%，26.78%和44.14%。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與表達量分析

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組樣本表達unigene/transcript的表達量分布整體情況以及樣本unigene/transcript的表達量密度分布情況見圖4。由圖4可知，SDC組和GDC組表達量每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments（Fragmentsperkilobaseofexon modelper million mappedfragments，F(xiàn)PKM）的對數(shù)值在-1.5～4.5之間，表達量密度在0～0.8之間。

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組樣本間Venn分析和相關(guān)性分析見圖5。從圖5可知，蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組表達的共有基因數(shù)為30506，蘇丹草（SDC）組單獨表達的基因數(shù)為4279，高丹草（GDC）組單獨表達的基因數(shù)為8824，蘇丹草（SDC）組單獨表達的基因數(shù)遠遠少于高丹草（GDC）組單獨表達的基因數(shù);蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組表達量的相關(guān)系數(shù)為0.758，表明蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組樣本間相關(guān)性較強，重復(fù)性較好。

2.4 轉(zhuǎn)錄組差異表達分析及注釋

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組表達量差異火山圖和表達量差異散點圖見圖6。由圖6可知，蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組共產(chǎn)生差異表達基因（Differentiallyexpressedgene，DEG）12415個，與蘇丹草（SDC）組比較，高丹草（GDC）組上調(diào)基因3903，下調(diào)基因8512。

2.5 轉(zhuǎn)錄組差異表達基因GO 富集分析

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組差異表達基因GO 富集分析結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，基于GO功能注釋，差異表達基因顯著（Plt;0.05）富集到生物學(xué)過程（Biologicalprocess，BP）、細胞組分（Cellcomponene，CC）和分子功能（Molecularfunction，MF）3大類303個小類。在BP類別中，差異表達基因主要富集在翻譯（GO：0006412）、肽生物合成過程（GO：0043043）、肽代謝過程（GO：0006518）、酰胺生物合成過程（GO：0043604）、細胞酰胺代謝過程（GO：0043603）、細胞大分子生物合成過程（GO：0034645）等條目;在CC類別中，差異表達基因主要富集在胞質(zhì)小核糖體亞單位（GO：0022627）、核糖體小亞基（GO：0015935）、胞質(zhì)大核糖體亞基（GO：0022625）、核糖體大亞基（GO：0015934）、核糖體（GO：0005840）、細胞外區(qū)（GO：0005576）等條目;在MF類別中，差異表達基因主要富集在單加氧酶活性（GO：0004497）、水解酶活性（水解O-糖基化合物）（GO：0004553）、鐵離子結(jié)合（GO：0005506）、水解酶活性（作用于糖基鍵）（GO：0016798）、血紅素結(jié)合（GO：0020037）、結(jié)構(gòu)分子活性（GO：0005198）等條目。

2.6 轉(zhuǎn)錄組差異表達基因KEGG 富集分析

蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組差異表達基因KEGG富集分析結(jié)果見圖8。由圖8可知，2438個差異表達基因被注釋到131條代謝途徑中，KEGG富集的前20代謝通路包括核糖體、苯丙烷生物合成，基于天線蛋白的光合作用，半乳糖代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，二萜生物合成，類黃酮生物合成，脂肪酸延長，苯丙氨酸代謝，氰基氨基酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，萜、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，其他各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，異喹啉生物堿生物合成，新霉素、卡那霉素和慶大霉素的生物合成，α-亞麻酸代謝，亞油酸代謝，二苯乙烯類化合物、二芳基庚烷和姜酚生物合成，類固醇生物合成，果糖和甘露糖代謝等等代謝途徑中。其中，各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成活動較為活躍，可能是引起粗蛋白和木質(zhì)素含量變化的主要代謝途徑。

2.7 轉(zhuǎn)錄組分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達基因qRT-PCR 驗證

為了進一步挖掘蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成的相關(guān)基因，根據(jù)已公布的高粱基因組注釋情況[32]及發(fā)表的與分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)的文獻[6，33-34]來對差異表達基因進行篩選和確定，共獲得9個分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達基因。其中6個差異表達基因，即TRINITY_DN21156_c0_g1（hexokinase-3，己糖激酶-3，HXK3）、TRINITY _DN5697_c0 _g2 （aspartateaminotransferase，chloroplastic，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ASPAT）、TRINITY_DN14734 _c0 _g1 （fructokinase-2，果糖激酶2，F(xiàn)RK2）、TRINITY_DN46 _c0 _g2 （S-adenosylmethioninesynthase1，S-腺苷甲硫氨酸合成酶1，SAMS1）、TRINITY_DN31771_c0_g1（polyphenoloxidaseII，chloroplastic，多酚氧化酶II，PPOII）、TRINITY_DN12259 _c0 _g1 （bifunctionalaspartokinase/homoserinedehydrogenase2，chloroplasticisoformX1雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2，AKI/DHI2）與粗蛋白合成相關(guān);2個差異表達基因，即TRINITY_DN15425_c0_g2（phenylalanineammonia-lyase，苯丙氨酸解氨酶，PAL ）、TRINITY_DN21502 _c0 _g1 （trans-cinnamate4-monooxygenase，反-肉桂酸4-單加氧酶，C4H ）與木質(zhì)素合成相關(guān);1個差異表達基因，即TRINITY_DN23078_c0_g2（strigolactoneesteraseD14，獨角金內(nèi)酯酯酶D14，SLsED14）與分蘗調(diào)控相關(guān)。

9個分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達基因的轉(zhuǎn)錄組表達量及其qRT-PCR 驗證見表2。由表2可知，9個分蘗調(diào)控以及粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異表達基因在蘇丹草（SDC）組和高丹草（GDC）組中的表達程度稍有不同，但轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果的表達趨勢與qRT-PCR 驗證的趨勢一致。與蘇丹草（SDC）組相比，在高丹草（GDC）組中的8個基因上調(diào)表達，包括TRINITY_DN21156_c0_g1（hexokinase-3，己糖激酶-3，HXK3）、TRINITY_DN14734_c0_g1（fructokinase-2，果糖激酶2，F(xiàn)RK2）、TRINITY _DN5697 _c0 _g2 （aspartateaminotransferase，chloroplastic，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ASPAT）、TRINITY_DN46_c0_g2（S-adenosylmethioninesynthase1，S-腺苷甲硫氨酸合成酶1，SAMS1）、TRINITY_DN31771_c0_g1（polyphenoloxidaseII，chloroplastic，多酚氧化酶II，PPOII）、TRINITY_DN12259 _c0 _g1 （bifunctionalaspartokinase/homoserinedehydrogenase2，chloroplasticisoformX1雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2，AKI/DHI2）、TRINITY_DN15425 _c0 _g2（phenylalanineammonia-lyase，苯丙氨酸解氨酶，PAL）、TRINITY _DN21502 _c0 _g1 （trans-cinnamate4-monooxygenase，反-肉桂酸4-單加氧酶，C4H ），1個基因下調(diào)表達，即TRINITY_DN23078_c0_g2（strigolactoneesteraseD14，獨角金內(nèi)酯酯酶D14，SLsED14）。

2.8 生理生化指標與分蘗調(diào)控、粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異基因表達的相關(guān)性分析

生理生化指標與分蘗調(diào)控、粗蛋白和木質(zhì)素合成相關(guān)差異基因表達的相關(guān)性分析見表3。由表3可知，單株分蘗數(shù)（NT）與獨角金內(nèi)酯（SLs）含量均呈極顯著負相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01），與獨角金內(nèi)酯酯酶D14基因（SLsED14）相對表達量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01）;粗蛋白（CP）含量與己糖激酶-3（HXK3）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT ）、果糖激酶2（FRK2）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1（SAMS1）、雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2（AKI/DHI2）基因相對表達量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P lt;0.01），與果糖激酶2（FRK2）活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）;木質(zhì)素（LN）含量與多酚氧化酶（PPO）活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、反肉桂酸4-單加氧酶（C4H）活性以及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶II（PPOII）、反-肉桂酸4-單加氧酶（C4H ）基因相對表達量均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01）。

3 討論

3.1 蘇丹草和高丹草分蘗調(diào)控關(guān)聯(lián)基因差異表達分析

分蘗是飼用高粱極為重要的性狀，決定飼用高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)，而分蘗是飼用高粱極為復(fù)雜的性狀，受多種環(huán)境和生理因素控制，其中包括激素調(diào)節(jié)和同化物的競爭[11]。有研究表明，刈割能增加蘇丹草比葉面積，降低其株高，增加其分蘗數(shù)，實現(xiàn)補償指數(shù)的增大[35];龐良玉等[19]的研究表明，蘇丹草的生長速度和分蘗、再生能力總體上優(yōu)于高丹草;許國成等[18]的研究也表明，與高丹草相比，蘇丹草的生育期短，分蘗能力和再生能力強。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，在本試驗中，高丹草的單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草，蘇丹草的單株分蘗數(shù)是高丹草的1.78倍。

獨腳金內(nèi)酯是一種控制禾本科植物分蘗的新激素，為倍半萜烯化合物，可抑制植物分蘗和側(cè)芽生長[34]。Hayward等[36]和Dun等[37]的研究揭示了獨角金內(nèi)酯的含量與分蘗增加的關(guān)系，即獨角金內(nèi)酯含量降低，分蘗增加。本研究結(jié)果也表明，高丹草的獨角金內(nèi)酯（SLs）含量顯著高于蘇丹草，與蘇丹草相比，高丹草的SLs含量增加57.88%;轉(zhuǎn)錄組表達量及其qRT-PCR證實，與蘇丹草（SDC）組相比，高丹草（GDC）組的TRINITY_DN23078 _c0 _g2（strigolactoneesteraseD14，獨角金內(nèi)酯酯酶D14，SLsED14）基因下調(diào)表達。獨角金內(nèi)酯酯酶起到水解獨角金內(nèi)酯的作用，高丹草（GDC）組的SLsED14 基因下調(diào)表達，表明與蘇丹草（SDC）組相比，高丹草（GDC）組獨角金內(nèi)酯含量較高，這與生理生化指標一致;生理生化指標與分蘗調(diào)控的相關(guān)性分析表明，單株分蘗數(shù)（NT）與獨角金內(nèi)酯（SLs）含量均呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，與獨角金內(nèi)酯酯酶D14基因（SLsED14）表達呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，與蘇丹草相比，高丹草SLsED14 基因表達下調(diào)，可能導(dǎo)致SLs無法水解，引起SLs大量積累，在一定程度上抑制了分蘗和側(cè)芽的生長，最終導(dǎo)致其單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草。

3.2 蘇丹草和高丹草粗蛋白合成關(guān)聯(lián)基因差異表達分析

氮代謝是無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮以及氨基酸合成代謝的重要途徑，對飼用高粱品質(zhì)形成起著重要調(diào)節(jié)作用[6]。FRK 和HXK 可催化果糖和己糖磷酸化[28，38]，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT）可調(diào)控氮代謝[39]，三者均可通過影響植物生長周期來調(diào)控蛋白質(zhì)合成，從而促進粗蛋白的合成。Karmoker等[41]研究表明，SAMS可促進硫代謝和谷胱甘肽代謝，調(diào)控飼用高粱粗蛋白的合成[40]。天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶（AKI/DHI）由thra 基因編碼，是蘇氨酸生產(chǎn)的限速酶，直接影響蛋白質(zhì)的合成[42]。研究表明，粗蛋白含量會顯著影響飼用高粱的營養(yǎng)品質(zhì)和經(jīng)濟價值[6]。有研究表明，與蘇丹草相比，高丹草富含糖類和多種氨基酸等營養(yǎng)成分，拔節(jié)盛期其粗蛋白含量高達14%以上，雜種優(yōu)勢明顯，應(yīng)用前景廣泛[7]。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，在本試驗中，高丹草的粗蛋白含量顯著高于蘇丹草，與蘇丹草相比，高丹草的粗蛋白含量增加了50.19%。究其原因，可能是與蘇丹草相比，高丹草的己糖激酶-3（HXK3）、果糖激酶2（FRK2）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1（SAMS1）、雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2（AKI/DHI2）等基因上調(diào)表達，造成高丹草的果糖激酶（FRK）活性增加。生理生化指標與粗蛋白合成基因表達的相關(guān)性分析表明，粗蛋白（CP）含量與HXK3，ASPAT，F(xiàn)RK2，SAMS1，AKI/DHI2 基因表達均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與FRK2活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，與蘇丹草相比，高丹草HXK3，ASPAT，F(xiàn)RK2，SAMS1，AKI/DHI2 基因表達上調(diào)，F(xiàn)RK2活性顯著增加，可能直接或間接促進粗蛋白的合成。但許國成等[18]的研究表明，蘇丹草粗蛋白含量（11.2%）高于高丹草（6.8%），這可能是選用了低蛋白高丹草品種的緣故。盧倩倩等[6]也指出高丹草有高粗蛋白含量高丹草（GH）和低粗蛋白含量高丹草（GL）之分，GH 樣本的粗蛋白含量（10.53%）比GL樣本的粗蛋白含量（5.59%）高88.37%。這可能是因為高粗蛋白含量高丹草（GH）的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等基因的表達量上調(diào)，從而導(dǎo)致其粗蛋白含量顯著高于低粗蛋白含量高丹草（GL）。本試驗結(jié)果也表明，與蘇丹草相比，高丹草的己糖激酶-3（HXK3）、果糖激酶2（FRK2）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1（SAMS1）、雙功能天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶2（AKI/DHI2）等基因上調(diào)表達，說明在氮代謝途徑中，可能通過多種基因協(xié)同發(fā)揮作用，共同促進高丹草氮同化，引起粗蛋白的積累。

3.3 蘇丹草和高丹草木質(zhì)素合成關(guān)聯(lián)基因差異表達分析

倒伏是飼用高粱生長發(fā)育過程中很常見的現(xiàn)象[17]。倒伏會造成飼用高粱莖稈疏導(dǎo)系統(tǒng)堵塞，養(yǎng)分和水分運輸受阻，飼用高粱產(chǎn)量和品質(zhì)降低，從而嚴重制約了飼用高粱的穩(wěn)產(chǎn)栽培[43]。隨著對飼用高粱抗倒伏性研究的深入，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素在飼用高粱生長發(fā)育和抗倒伏方面發(fā)揮著重要的功能。PPO，C4H 和PAL的活性和含量直接影響飼用高粱木質(zhì)素合成的效率[44-47]。劉兆明等[48]的研究表明，蘇丹草新品系‘蘇牧3 號’的胚性愈傷組織在MS+3g·L-1活性炭+16h·d-1光照的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)21d，木質(zhì)素含量達到最高值18.11%，與木質(zhì)素合成相關(guān)的酶PAL的活性也達到最高值。本試驗結(jié)果表明，與蘇丹草相比，高丹草的木質(zhì)素含量分別增加了36.44%。究其原因，可能是與蘇丹草相比，高丹草的多酚氧化酶II（PPOII）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、反-肉桂酸4-單加氧酶（C4H ）基因上調(diào)表達，導(dǎo)致高丹草的PPO，PAL，C4H 活性顯著增加。生理生化指標與木質(zhì)素合成基因表達的相關(guān)性分析表明，木質(zhì)素（LN）含量與PPO，PAL，C4H 活性以及PAL，PPOII，C4H 基因表達均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，與蘇丹草相比，高丹草PAL，PPOII，C4H 基因極顯著表達，PPO，PAL，C4H 活性顯著增加，可能直接或間接促進木質(zhì)素的合成。

4 結(jié)論

高丹草的單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草，高丹草的粗蛋白和木質(zhì)素含量顯著高于蘇丹草。高丹草SLsED14 基因極顯著表達，可能導(dǎo)致SLs無法水解，引起SLs大量積累，在一定程度上抑制了分蘗和側(cè)芽的生長，最終導(dǎo)致其單株分蘗數(shù)顯著低于蘇丹草。與蘇丹草相比，高丹草HXK3，ASPAT，F(xiàn)RK2，SAMS1，AKI/DHI2 基因極顯著表達，F(xiàn)RK2活性顯著增加，可能直接或間接促進粗蛋白的合成。與蘇丹草相比，高丹草PAL，PPOII，C4H基因表達上調(diào)，PPO，PAL，C4H 活性顯著增加，可能直接或間接促進木質(zhì)素的合成。