三江源區(qū)燕麥根際PGPR菌株功能多樣性研究

關(guān)鍵詞：燕麥;固氮菌;溶磷能力;土壤理化性質(zhì);菌株功能多樣性

植物根際促生菌（Plantgrowth-promotingrhizobacteria，PGPR）是指一類自由生活在土壤中或附生在植物的根際、莖葉上，能分泌物質(zhì)和促進植物利用物質(zhì)以及通過抑制其它有害物質(zhì)來促進植物生長的有益菌類[1]。多數(shù)PGPR 可通過生物固氮、解鉀、產(chǎn)生鐵載體、產(chǎn)生植物激素等特性促進植物生長[2];也可通過增加土壤養(yǎng)分供應(yīng)，提高植物根表面積和對養(yǎng)分的吸收能力，改善土壤狀況等方式影響作物的生長;同時具有拮抗病原真菌，耐逆等優(yōu)良特性[3]。常見的根際促生菌有假單孢菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、埃文氏菌屬（Eriwinia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、巴斯德氏菌屬（Pasteuria）、沙雷氏菌屬（Serratia）、腸桿菌屬（Enterobacter）等[4]。研究表明大部分根際微生物對植物不存在危害性，1%～2%的菌落能促進植物生長發(fā)育[5-7]，只有少數(shù)的根際微生物有害。因此，深入挖掘三江源高寒草地中的PGPR資源來促進高原植物生長、防治病害及保護生態(tài)具有重要意義。

燕麥（Avennasativa L.）是一年生草本植物，為禾本科燕麥屬[9]，具有耐寒、耐旱、易栽培、生產(chǎn)潛力大、對土壤適用性強等優(yōu)良品性，可作為高寒地區(qū)重要牧草品種來加以廣泛推廣栽培[10]，這對推進高寒畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有著重大意義。因此，可從三江源不同高寒地區(qū)燕麥根際取樣，分離篩選PGPR，以期得到功能優(yōu)異的菌株用于生態(tài)保護。

三江源區(qū)海拔高、氣候寒冷、人口增長過快、土壤侵蝕嚴(yán)重、年平均氣溫逐年升高，再加上放牧過載、嚙齒動物及害蟲猖獗等[11]因素導(dǎo)致高寒草甸退化加快。由于其特殊的環(huán)境而受到各位專家學(xué)者的廣泛關(guān)注，目前該地區(qū)研究多在人類活動對草地植被生長的影響、土壤侵蝕、退化高寒草甸群落特征、草地產(chǎn)量與載畜關(guān)聯(lián)性等方面展開[12-13]。涉及根際微生物和草地微生物的研究主要在三江源地區(qū)高寒草原土壤微生物活性和微生物量、根際土壤微生物的多樣性和低溫乳酸菌的篩選及利用等方面[14]，而關(guān)于植物根際促生菌PGPR 的研究較少。張萬通等[8]研究表明，在高寒草地中PGPR菌肥代替30%的氮肥，可增加土壤含水量和土壤全氮含量，從而促進植物生長、達到保護生態(tài)環(huán)境的目的。綜上可知，一株優(yōu)良的植物根際促生菌具有優(yōu)良的功能特性，有很好的開發(fā)利用價值，在促進植物生長、抗病、耐逆及生態(tài)恢復(fù)等領(lǐng)域有較大的應(yīng)用空間。燕麥作為優(yōu)質(zhì)的牧草，本身不僅可為脆弱生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)提供草種，在西北高寒地區(qū)廣泛種植[15]，同時其根際分布著優(yōu)良的PGPR資源，從三江源區(qū)燕麥根際分離優(yōu)良的PGPR 菌株對三江源高寒草地的恢復(fù)具有重要意義。

本文以三江源地區(qū)不同地域主要栽培牧草燕麥為研究對象，從燕麥根際分離篩選PGPR 菌株，研究其數(shù)量、功能多樣性，并分析根際土壤特性和根際促生菌數(shù)量間的相關(guān)關(guān)系，研究功能優(yōu)良的PGPR菌株的生物學(xué)特性，這對為三江源地區(qū)功能微生物資源的研究、開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，收集優(yōu)良的PGPR菌株資源有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究采樣地點位于三江源地區(qū)海南州貴南縣、海南州同德牧場、黃南州河南縣優(yōu)干寧鎮(zhèn)、黃南州同仁縣瓜什則鄉(xiāng)、海北州海晏縣西莎線、海北州海晏縣西海鎮(zhèn)牧草試驗站、玉樹州稱多縣珍秦鎮(zhèn)珍秦站和海南州共和縣倒淌河鎮(zhèn)地區(qū)，燕麥樣地基本特征如表1所示。在每個樣地中隨機選取5個樣點，采集0～20cm 燕麥根系及土壤樣品，用毛刷輕輕地將根上0～5mm 的土壤刷下作為根際土，低溫保存并迅速帶回實驗室。

1.2 燕麥PGPR 菌株的篩選及數(shù)量統(tǒng)計

稱取燕麥根際土壤10g 于錐形瓶中，加入90mL0.85%的無菌生理鹽水，充分振蕩20min，取1mL菌懸液加入到盛有9mL0.85%無菌生理鹽水的試管，依次制得10-5稀釋梯度懸液。吸取懸液50μL均勻涂布于固氮培養(yǎng)基、無機磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機磷培養(yǎng)基上。倒置20min，于28℃培養(yǎng)3d后統(tǒng)計固氮菌、溶磷菌的數(shù)量，根據(jù)公式（菌數(shù)=（菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/干土重量）計算PGPR的數(shù)量。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)的測定

堿解氮含量：堿解擴散法。全氮含量：半微量凱氏定氮法。速效磷含量：碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法。全磷含量：酸溶-鉬銻抗比色法。速效鉀含量：醋酸銨浸提-火焰光度計法。全鉀含量：酸溶-火焰光度計法。土壤pH 值：電導(dǎo)法。有機質(zhì)含量：重鉻酸鉀高溫外熱氧化-容量法。

1.4 不同地域燕麥PGPR 菌株特性研究

1.4.1 不同地域燕麥根際固氮菌的固氮特性研究

在無菌的5mL固氮培養(yǎng)基的血清小瓶中接種固氮菌，每個菌株重復(fù)3次，以等量的無菌培養(yǎng)基為對照（CK）。置入培養(yǎng)箱中28℃ 下培養(yǎng)5d。抽取1mL氣體再注入每個小瓶1mLC2H4 氣體，置入培養(yǎng)箱中28℃下培養(yǎng)48h。用無菌微量注射器從各樣品瓶中抽取氣體50μL注入氣相色譜儀（型號：GC7890F）進樣柱中，測定C2H4 峰的生成情況。制作C2H4 標(biāo)準(zhǔn)曲線，用外標(biāo)法計算C2H4 量。

1.4.2 不同地域燕麥根際溶磷菌的溶磷特性研究 定性：在無機磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機磷培養(yǎng)基平板上接種菌株，在28℃培養(yǎng)8d，測定菌株的直徑（d）和溶磷圈直徑（D）。根據(jù)D/d值初步篩選溶磷菌。

定 量：吸取菌懸液500μL（OD660=1.00）接種于有機磷及無機磷液體培養(yǎng)基中。每菌株設(shè)3個重復(fù)，以不接菌為對照。在28℃，160r·min-1下震蕩培養(yǎng)10d，測定培養(yǎng)液pH，置于4℃，10000r·min-1條件下離心15min，吸取5mL上清液置入150mL三角瓶中，加入50mL0.5mol·L-1碳酸氫鈉浸提劑，加一勺無磷活性炭粉，封口后置搖床中振蕩30min，用無磷濾紙過濾。吸取10mL濾液置入50mL容量瓶中，加入5mL鉬銻抗顯色劑，搖勻，定容，室溫靜置30min，在700nm下比色。

1.4.3 不同地域燕麥PGPR 菌株的分泌吲哚乙酸（Indoleaceticacid，IAA）特性研究 配制金氏培養(yǎng)基，吸取菌懸液500μL（OD660=1.00）接種于錐形瓶中。28℃，150r·min-1條件下培養(yǎng)12d。吸取50μL 懸浮液滴入白色陶瓷板，分別加入50μLSalkowski比色液，對照則不加比色液;在室溫條件下，15min內(nèi)觀察顏色變化。顏色變粉紅色表示能分泌IAA，顏色越深表示分泌IAA 能力越強，不變色，即不分泌IAA。定量：將培養(yǎng)液置于高速離心機中，10000r·min-1、4℃條件下離心10min，吸取5mL上清液，并加5mL比色液，室溫黑暗中靜置30min，在530nm 下測吸光值，從IAA 濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)值計算IAA 含量。

1.5 16SrDNA 基因序列的鑒定

采用Ezup柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒（來源：生工生物工程（上海）有限公司，貨號為SK8255）提取細菌DNA;合成引物（來源：生工合成部合成）。選取16SrDNA擴增的通用引物，其序列為：F，5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3;R，5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。PCR 體系：引物0.5μL，Tempplate（基因組DNA20～50ng·μL-1）0.5μL，10×Buffer（withMg2+ ）2.5μL，dNTP （各25mM）1μL、酶0.1μL、ddH2O25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃4min;94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min，30個循環(huán);72℃10min。將16SrDNA 基因擴增產(chǎn)物純化后測序，測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2019進行數(shù)據(jù)整理，運用SPSS7.0進行單因素方差分析（One-wayANOVA），進行差異顯著性檢驗（Plt;0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地域燕麥PGPR 的數(shù)量多樣性

由表2可知，從不同地域燕麥根際分離到固氮菌、溶解無機菌和溶解有機磷菌3類PGPR菌株，不同地域燕麥PGPR 菌株的數(shù)量存在極顯著的差異（Plt;0.01），不同地域燕麥PGPR菌株、根際固氮菌、溶解無機磷菌、溶解有機磷菌的數(shù)量分別為9.30～48.83cfu·kg-1，3.13～24.07cfu·kg-1，0.54～23.10cfu·kg-1，1.43～12.87cfu·kg-1。其中，TR31和TD6樣地燕麥PGPR 菌株差異顯著（Plt;0.05），顯著高于其他6個樣地;ZQ 樣地燕麥PGPR菌株的數(shù)量顯著低于其他7 個樣地（P lt;0.05）。TR31樣地燕麥根際固氮菌的數(shù)量顯著高于其他7個樣地，XHZY和ZQ2樣地燕麥根際固氮的數(shù)量顯著低于其他6個樣地;DTH1樣地燕麥根際溶解無機磷菌株的數(shù)量顯著高于其他7個樣地，XSXY樣地燕麥根際溶解無機磷菌株的數(shù)量顯著低于其他7個樣地（Plt;0.01）。各樣地燕麥根際溶解有機磷菌株差異顯著（Plt;0.05），TD16，HN27樣地燕麥根際溶解有機磷菌株差異顯著（Plt;0.01），顯著高于其他6個樣地。

2.2 不同地域燕麥根際土壤理化性質(zhì)

燕麥根際土壤堿解氮含量、全氮含量、速效磷含量、全磷含量、速效鉀含量、全鉀含量、pH 值、有機質(zhì)含量存在極顯著性差異（Plt;0.01）（表3）。GN03燕麥根際堿解氮含量為275mg·kg-1，顯著高于其他燕麥根際的（P lt;0.01）。DTH1（129 mg·kg-1），TR31（112mg·kg-1）燕麥堿解氮含量較低。TD16燕麥根際速效磷含量為74.50mg·kg-1，顯著高于其他燕麥根際的（P lt; 0.01）。HN27（5.60mg·kg-1），TR31（7.20mg·kg-1）燕麥根際速效磷含量最低，顯著低于DTH1（25.90mg·kg-1），ZQ2（22.50 mg·kg-1 ）（P lt;0.01）;TD16（3.25g·kg-1）燕麥根際全磷含量最高，與其他燕麥根際的存在顯著性差異（Plt;0.05）。燕麥根際土壤pH 值在7.66～8.61之間，呈堿性;ZQ2（62.56g·kg-1）燕麥根際有機質(zhì)含量最高，XSXY（53.23g·kg-1），GN03（53.24g·kg-1）燕麥根際有機質(zhì)含量較高，三者顯著高于其他燕麥根際的（Plt;0.01）。

2.3 不同地域燕麥根際土壤理化性質(zhì)與PGPR 菌株數(shù)量相關(guān)性分析

不同地域燕麥根際土壤理化性質(zhì)與PGPR 菌株數(shù)量存在一定的相關(guān)性（表4）。在一定范圍內(nèi)，根際土壤全氮含量與PGPR 菌株數(shù)量存在顯著的負相關(guān)關(guān)系（P lt;0.05），根際全磷含量、速效鉀含量、土壤pH 值、有機質(zhì)含量與PGPR菌株數(shù)量存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）。

2.4 不同地域燕麥PGPR 菌株功能多樣性

2.4.1 不同地域燕麥根際固氮菌的固氮酶活性 采用乙炔還原法測定86株固氮菌的固氮酶活性，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=17249x+14987（R2=0.9995）。31株固氮菌具有較強的固氮性能，固氮活性（表5）在116.91～655.26nmolC2H4·h-1·mL-1之間，各菌株間以及與對照組相比，固氮酶活性存在極顯著性差異（Plt;0.01）。菌株N-4HN272c（655.26nmolC2H4 ·h-1 ·mL-1）和菌株N-3TR312a（622.34nmolC2H4·h-1·mL-1）顯著高于其他固氮菌和對照的測定值（Plt;0.01）。

2.4.2 不同地域燕麥根際溶磷菌溶磷特性 采用平板溶磷圈法和液培鉬銻抗比色法測定供試溶磷菌的溶磷能力。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.2009x-0.0415（R2=0.997），由表6可知，4株溶解無機磷的菌株D/d值在1.35～3.28 之間，溶磷量在15.17～26.16μg·mL-1 之間，3 株菌株有效磷增量為5.48～10.99 μg· mL-1，顯著高于菌株IP-3DTH13a（16.95μg·mL-1）和對照組（Plt;0.01）。由表7 可知，溶解有機磷菌株有19 株，D/d值在0.95～2.90 之間，溶磷量在16.63～22.08μg·mL-1 之間， 其中OP-3TR311c 及OP-4DTH13b溶磷量分別為22.08μg·mL-1，21.68μg·mL-1，顯著高于其他株菌株和對照組（P lt;0.01），分別來自于TR31和DTH1樣地。

對溶磷量與培養(yǎng)液pH 值、D/d值的相關(guān)性進行分析，由表8可知，溶解無機磷菌株的溶磷量與培養(yǎng)液pH 值存在一定的負相關(guān)性，與D/d值存在極顯著的正相關(guān)性;溶解有機磷菌株的溶磷量與培養(yǎng)液pH 值和D/d值存在一定的正相關(guān)性。

2.4.3 不同地域燕麥PGPR 菌株的分泌IAA 特性 采用顯色法和Salkowski比色法測定120株P(guān)GPR菌株的IAA 分泌能力（表9），回歸方程為y=92.445x2+8.0936x+0.498（R2=0.982）。結(jié)果顯示，29株菌株具有顯色反應(yīng)，占供試菌株的24.2%，分泌IAA 量在2.69 ～ 118.85μg·mL-1之間。其中，菌株N-3HN273a（118.85μg·mL-1）和菌株N-3HN271a（116.05μg·mL-1）分泌的IAA 量顯著高于其他菌株和對照組（P lt;0.01）。

2.5 優(yōu)良PGPR 菌株16SrDNA 序列鑒定

使用雙引物對擴增成功的9株P(guān)GPR菌株（圖1）的16SrDNA 序列進行測定。

將測得的9株P(guān)GPR菌株的16SrDNA 序列登錄GenBank進行BLAST檢索，與已經(jīng)報道的菌株的16SrDNA 序列進行同源性比較（表10）。同源性結(jié)果顯示，6株菌株為假單胞菌屬Pseudomonassp.，1株菌株為短小芽孢桿菌屬Bacilluspumilussp.，2株菌株為節(jié)桿菌屬Arthrobactersp.。

3 討論

目前，根際促生菌的研究多在根際固氮菌和溶磷菌方面展開，根際促生菌數(shù)量高于非根際的[16-18];本試驗發(fā)現(xiàn)植物根際固氮性能較強的菌株數(shù)量較多，溶磷性能較強的菌株比較少;相關(guān)根際促生菌研究中也發(fā)現(xiàn)植物根際固氮菌較多，溶磷菌較少[19-20]，與本試驗結(jié)果一致。但因為不同區(qū)域氣候條件不同，并且根際促生菌的宿主植物不同，導(dǎo)致固氮溶磷菌比例不同的具體原因有待深究。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)燕麥根際全氮含量、全磷含量、速效鉀含量、pH 值、有機質(zhì)含量與PGPR菌株多樣性相關(guān)，而菌株多樣性也受燕麥根際土理化性質(zhì)的影響。遠兵強等[21]發(fā)現(xiàn)根際促生菌（PGPR）處理下可提高土壤有機質(zhì)（OM）、全量養(yǎng)分（TN，TP，TK）、速效養(yǎng)分（AN，AP，AK）含量及土壤酶活性。于洋等[22]對河北省木蘭圍場華北落葉松人工林土壤微生物與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性進行了分析，發(fā)現(xiàn)土壤微生物的數(shù)量與土壤理化性質(zhì)存在一定相關(guān)性，土壤細菌、放線菌的數(shù)量與土壤全氮和有機質(zhì)含量的相關(guān)性最高，這與本文中不同地域燕麥根際土壤理化性質(zhì)與PGPR菌株數(shù)量間的相關(guān)性一致。在一定范圍內(nèi)，根際土壤全氮含量與PGPR 菌株數(shù)量存在顯著的負相關(guān)關(guān)系，根際全磷含量、速效鉀含量、土壤pH 值、有機質(zhì)含量與PGPR菌株數(shù)量存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。胡忠學(xué)[23]以河北省塞林壩機械林場的落葉松林業(yè)區(qū)域的土壤為研究對象，發(fā)現(xiàn)土壤微生物數(shù)量與土壤理化性質(zhì)相互影響，在lt;20cm 的土壤層中，土壤微生物數(shù)量與土壤理化性質(zhì)存在負相關(guān)性，這也與本文結(jié)果一致。推測可能是由于農(nóng)田通過人工施肥和翻耕改變了土壤的相關(guān)性質(zhì)[24]，進而影響土壤微生物的數(shù)量與群落結(jié)構(gòu)。通過測定燕麥田地根際土壤微生物的數(shù)量結(jié)構(gòu)及土壤理化性質(zhì)，可以探究不同燕麥地優(yōu)良PGPR 菌株在土壤恢復(fù)中發(fā)揮作用的潛力。

吳瑛等[25]發(fā)現(xiàn)根際促生菌具有固氮、溶磷和分泌植物生長激素等特性，固氮弧菌屬、巴西固氮螺菌和重氮營養(yǎng)葡萄糖酸桿菌已被報道在控制條件下通過固氮增加宿主植物生物量，因此本文中燕麥根際較多的固氮菌也可能通過一定途徑來促進植株健康生長。覃麗金等[26]從10種‘熱研2號’柱花草根際篩選出9株溶解無機磷菌株和6株溶解有機磷菌株，發(fā)現(xiàn)根際溶解無機菌溶磷能力最高可達216.57mg·L-1;本試驗分離篩選得到4株溶解無機磷菌、3株溶解有機磷菌;有效磷增量在5.31～10.99μg·mL-1之間，并且發(fā)現(xiàn)溶解無機磷菌株的溶磷量與培養(yǎng)液pH 值存在一定的負相關(guān)性，與D/d值存在極顯著的正相關(guān)。鄭紅麗等[27]從內(nèi)蒙古四子王旗燕麥根際中分離出2株溶磷能力較強的菌株，并且兩菌株還具有耐鹽性，由此可以推測本試驗中篩選得到的菌株也可能具有一定的抗逆能力，從而促進植物更好的發(fā)育。張英等[28]從三葉草根際篩選出10株溶磷菌，發(fā)現(xiàn)該菌株還具有較強的分泌IAA能力，分泌量為0.36～20.39mg·L-1，可促進植物生長;本試驗發(fā)現(xiàn)分泌IAA 能力較強的菌株數(shù)量較多，IAA 分泌量較高，在20.64～118.85μg·mL-1之間，能夠通過為燕麥生長提供生長素來增加其產(chǎn)量。張凱曄等[29]分離出的BacillusSC60 可分泌IAA 和溶解無機磷，提高種子活力，促進胚根發(fā)育。接種根際促生菌可以促進植物生長[30-32]，推測本文中不同地區(qū)燕麥生長過程中優(yōu)良PGPR菌株對種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育貢獻了一定作用，其促生機制為：植物根際促生菌株產(chǎn)生IAA，并促進其寄主植物的生長，IAA 含量升高，內(nèi)源的ABA 和JA 也隨之升高[33]，通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平促進植物生長。席琳喬等[34]為燕麥接種固氮菌，采用15N 同位素稀釋法測定其地下根系部分為1.0921%～1.2751%，植株全氮含量增加2.08%～39.58%;姚拓等[35]同樣為燕麥接種固氮菌，發(fā)現(xiàn)大多固氮菌均能提高燕麥的株高、根長、根表面積和生物量，由此可見，本文中優(yōu)異固氮菌對不同燕麥地燕麥植株的生長提供了一定的助力，從而使其生物量有所增加。本文從不同燕麥根際分離篩選PGPR菌株，以期為三江源地區(qū)功能微生物資源的研究、開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，收集優(yōu)良的PGPR菌株資源助力三江源高寒草地的恢復(fù)。

4 結(jié)論

從三江源不同地域燕麥根際土壤共篩得優(yōu)異的固氮菌31株、溶磷菌5株、產(chǎn)吲哚乙酸菌13株。各地區(qū)土壤堿解氮、全氮、速效磷、全磷、速效鉀、全鉀和有機質(zhì)含量以及pH 值存在極顯著性差異（Plt;0.01）。土壤全氮含量與PGPR 數(shù)量呈負相關(guān)關(guān)系，根際全磷含量、速效鉀含量、土壤pH 值、有機質(zhì)含量與PGPR 數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系。燕麥根際優(yōu)良PGPR多屬于假單胞菌屬Pseudomonassp.、短小芽孢桿菌屬Bacilluspumilussp.和節(jié)桿菌屬Arthrobactersp.。