生草對關中地區(qū)有機獼猴桃園土壤理化性質及細菌群落的影響

關鍵詞：果園生草;土壤理化性質;土壤細菌群落;共現網絡

我國是獼猴桃屬植物的起源、進化及發(fā)展中心[1]，陜西是全球最大的獼猴桃生產基地，截止2022年，全省獼猴桃種植面積達6.53萬公頃、產量達129.43萬噸[2]。獼猴桃作為陜西省的傳統特色農業(yè)產業(yè)之一，種植歷史悠久，是陜西農業(yè)農村經濟的重要支柱產業(yè)[3]，但由于傳統果園土壤管理模式以清耕為主，農藥、肥料等的長期使用導致土壤質量變差，制約了獼猴桃產業(yè)的高質量發(fā)展。果園生草是指利用果樹行間或全園種植草本植物，或果園自然生草（剔除惡性雜草）作為覆蓋作物的一種土壤管理模式[4]。研究表明，生草覆蓋能顯著減少土壤水分侵蝕和土壤有機碳的損失[5]。果園生草能調節(jié)果樹與土壤之間的關系，進而建立豐產優(yōu)質、生態(tài)友好的可持續(xù)果園生產體系。

土壤細菌在調節(jié)土壤形成、有機質分解、營養(yǎng)循環(huán)等生物化學過程中發(fā)揮重要作用，有助于維持土壤健康和生產力[6-7]。根系分泌物中含有的葡萄糖、甘氨酸和檸檬酸及一些次級代謝產物對微生物群落結構和微生物組特征有重要影響[8]。果園生草能夠調節(jié)根系分泌物的組成，從而促進微生物的生長，改變細菌群落結構，提高特定生態(tài)系統中植物的適應性[8-9]。Yang等[10]表明，果園不同生草覆蓋顯著改變了土壤可溶性有機質的成分和細菌群落結構，提高了復合營養(yǎng)菌的比例，降低了寡營養(yǎng)菌的比例，對土壤養(yǎng)分循環(huán)有顯著影響。微生物共現網絡揭示土壤微生物之間的潛在聯系和共生模式，已被廣泛應用于研究微生物群落對環(huán)境變化的響應[11-12]。Yuan等[13]研究表明網絡穩(wěn)定性隨著網絡復雜性的增加而增加，但與理論分析相矛盾，理論分析表明更高的復雜性會破壞生態(tài)系統的穩(wěn)定性。Zheng等[14]指出，網絡可以被解釋為將微生物相互作用作為一個概念框架，并在總體尺度上分析微生物之間的生態(tài)位共享或競爭，能更清楚地了解微生物在微生物交換和土壤養(yǎng)分競爭中的作用。Wang等[15]研究表明，生草覆蓋可以提升微生物網絡的復雜性，特別是網絡的正向連接，促進了微生物群落之間的相互關系。因此，揭示獼猴桃園不同生草措施對土壤理化性質、細菌群落組成和共現網絡結構的影響具有重要意義。

豆科和禾本科牧草的混播模式能產生生態(tài)位互補，能更好的利用生態(tài)環(huán)境資源，同時，能改善土壤微生物、土壤含水量及根系分泌物，從而提升土壤肥力[16]。不同的生草措施對土壤特征的影響有所差異，因此，本研究以3種混播生草措施為研究對象，揭示不同生草措施對有機獼猴桃園土壤理化性質、微生物群落結構和網絡復雜性的影響，提高對果園生草如何通過改變果園生草生態(tài)系統中土壤微生物群落來改善土壤質量的理解，以期為關中地區(qū)果園生草技術的深入研究和進一步推廣提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗設計

本試驗在陜西省楊凌示范區(qū)五泉鎮(zhèn)上灣村百恒有機獼猴桃園進行（34°30'N，107°59'E），海拔540.1m，該地屬東亞暖溫帶半濕潤半干旱氣候，年降水量635.1mm，年均氣溫12.9℃。本試驗的供試獼猴桃果樹為8齡“翠香”品種，株行距6.0m×3.8m。

試驗于2021年4月進行播種，設置3個處理：一年生黑麥草+紫云英（Lp+As）、一年生黑麥草+秣食豆（Lp+Gm）、一年生黑麥草+毛苕子（Lp+Vv），以自然生草（CK）為對照，供試草種來源及播量見表1，每個處理重復3次，完全隨機區(qū)組設計，各重復小區(qū)面積為52.8m2（12.0m×4.4m）。于2021年8月牧草達到盛花期時進行樣品采集，各小區(qū)采用S形取樣法選取5個樣點鉆取5鉆土壤，經充分混合后形成一份樣品，每份樣品隨后分為兩部分，一部分進行自然風干，以備進行土壤理化性質和酶活性的測定，一部分保存于-80℃冰箱中用于高通量測序。

1.2 土壤理化性質及酶活性的測定

按1∶2.5土水比進行浸提，用pH 計測定pH值，采用重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱法測定土壤有機質（Soilorganicmatter，SOM）[17]。參照關松蔭[18]的方法測定土壤酶活性，采用苯酚鈉比色法測定脲酶（Urease，URE）活性，蔗糖酶（Sucrase，SUC）活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，采用磷酸苯二鈉比色法測定堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP）活性，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性。

1.3 土壤細菌高通量測序

使用E.Z.N.A.4StoolDNAKit試劑盒提取各樣本的總DNA，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取的質量，同時通過紫外分光光度法定量DNA。使用引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）對16SrDNA（V3+V4）可變區(qū)進行PCR擴增。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳確證，并由AMPureXTbeads（BeckmanCoulterGenomics，Danvers，MA，USA）純化，Qubit（Invitrogen，USA）定量。擴增子文庫的大小和數量分別在Agilent2100生物分析儀（Agilent，USA）和Illumina（KapaBiosciences，Woburn，MA，USA）的文庫定量試劑盒上進行評估。在NovaSeqPE250平臺上對庫進行排序。根據樣品獨特的條形碼，將配對端序列分配給樣品，并將建庫引入的barcode和引物序列去除。使用FLASH 合并匹配端讀取。根據fqtrim（v0.94），在特定的過濾條件下對原始讀數據進行質量過濾，以獲得高質量的cleandata。使用Vsearch軟件對嵌合序列進行過濾（v2.3.4）。利用DADA2（DivisiveAmpliconDenoisingAlgorithm）進行解調，然后使用ASVs（AmpliconSequenceVariants）的概念構建類OTU（OperationalTaxonomicUnits）表，獲得最終的feature特征表以及特征序列，進一步進行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。

1.4 數據分析

使用MicrosoftExcel2019進行數據整理，IBMSPSSstatistics27進行方差分析和顯著性檢驗。細菌beta多樣性采用QIIME2計算，使用PCoA分析不同生草措施細菌物種組成差異情況。通過LEfSe（LDAEffectSize）分析基于LDA閾值3.0找到不同處理間在豐度上有顯著性差異的物種。利用PICRUSt2軟件及京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG），對物種代謝功能進行預測。采用網絡結構分析細菌群落之間的共生模式，用相對豐度大于0.1%的屬來進行Spearman相關性分析，通過R語言中的igraph包和gephi0.9.2軟件進行網絡結構分析和可視化，按介數中心性得分排序，各處理中排名前3的物種作為共現網絡結構中的關鍵物種。采用Spearman相關性分析微生物（門水平）與土壤環(huán)境因子的相關關系，gephi0.9.2軟件進行可視化。使用R4.3.1plspm包進行偏最小二乘路徑建模（PartialLeastSquaresPathModeling，PLS-PM）分析構建潛變量結構方程模型，由于表征網絡的復雜性的節(jié)點、邊數、連接性和邊密度存在極顯著相關性，因此本研究使用邊密度作為細菌網絡復雜性指數[19]，細菌多樣性通過Anosim相似性來進行評價，潛變量（土壤酶活性）是標準化指標變量（URE，ALP，CAT）的線性組合[20]。

2 結果與分析

2.1 不同生草措施對有機獼猴桃園耕層土壤化學和酶活性的影響

如表2所示，與CK 相比，Lp+As，Lp+Gm，Lp+Vv處理的土壤pH 值顯著升高（P lt;0.05）。Lp+As，Lp+Gm 的SOM 含量顯著升高（P lt;0.05），分別提高了11.9%，8.8%。Lp+Gm，Lp+Vv處理的URE，ALP，CAT 活性均顯著高于CK處理（Plt;0.05），其中Lp+Vv處理的提升效果更佳，分別提高了21.45%，28.00%，10.23%。Lp+As處理的ALP活性顯著高于CK處理（Plt;0.05）。

2.1 不同生草措施對有機獼猴桃園耕層土壤細菌多樣性的影響

如表3所示，4組中的測序深度指數均在99%以上，說明本次測序足以覆蓋大部分細菌，可較為全面地揭示土壤樣品的細菌群落組成。4種處理的Chao1指數、特征序列指數、香農指數均無顯著性差異。如圖1a，采用Anosim相似性分析檢驗各處理組間差異是否顯著大于組內差異。在本研究中，不同分組對組間群落差異解釋度R值為0.337，顯著性P 值為0.001，達到極顯著水平，說明處理間差異顯著大于處理內差異，試驗設計分組有意義。與CK 相比，Lp+Vv處理的群落組成結構差異最大，Lp+As次之，Lp+Gm差異最小。圖1b基于Bray_curtis距離矩陣，進行了微生物群落結構的主坐標分析（PrincipalCoordinatesAnalysis，PCoA）。不同處理土壤細菌群落差異的33.71% 可被第一主成分（PCoA1）解釋，15.90%可被第二主成分（PCoA2）解釋。不同處理下的樣品在空間排序中形成了不同的聚類，3種人工生草處理與自然生草對照相比樣品呈現分離，表明細菌群落結構具有明顯差異。

2.2 不同生草措施對有機獼猴桃園耕層土壤細菌群落結構組成分析

本研究中所有測序數據經過序列剪切過濾后，共獲得了1333756條16sRNA 優(yōu)質序列，處理后，在所有樣品中共有1086584條有效序列，占原始數據的81.51%，測序量符合試驗分析要求。為研究生草對微生物群落結構組成的影響，本研究比較了不同處理之間豐度排名前30的門（圖2a）。與CK相比，3種人工生草處理的芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度較對照分別增加了8.85%，55.1%，10.24%，厚壁菌門（Firmicutes）的豐度增加了37.93%，39.66%，8.62%，放線菌門（Actinobacteria）的豐度減少了41.17%，10.17%，35.64%，疣微菌門（Verrucomicrobia）的豐度減少了25.16%，34.64%，22.88%，六菌門（Rokubacteria）的豐度減少了34.88%，11.05%，13.37%。Lp+Vv、Lp+Gm 處理的變形菌門（Proteobacteria）的豐度分別增加了7.85%，7.34%，酸桿菌門（Acidobacteria）的豐度分別增加了3.14%，4.99%，浮霉菌門（Planctomycetes）的豐度減少了20.09%，8.84%，綠彎菌門（Chloroflexi）的豐度減少了6.72%，8.21%。Lp+Gm 的擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度增加了1.67%。

本研究采用LEfSe分析不同生草措施下土壤細菌從門到屬水平的差異菌群，并分別用柱狀圖展示LDA 值（圖2b），用Cladograms圖展示菌群進化分支（圖2c）?；贚DA 閾值3.0，在4種處理中共篩選出了42個具有顯著性差異的菌群（Plt;0.05），Lp+As，Lp+Gm，Lp+Vv，CK 分別有9，7，8，18種。Lp+Vv處理的差異物種主要為芽孢桿菌科（Bacillaceae）（LDA=3.36，P=0.02）和芽孢桿菌屬（Bacillus）（LDA=3.38，P=0.02）;Lp+Gm 處理中的差異物種主要為生絲單胞菌科（Hyphomonadaceae）（LDA=3.47，P=0.03）和SWB02屬（LDA=3.35，P=0.03）;Lp+As處理中的差異物種主要為芽孢桿菌綱（Bacilli）（LDA=3.47，P=0.03）和芽孢桿菌目（Bacillales）（LDA=3.57，P=0.02）。

2.3 不同生草措施下有機獼猴桃園耕層土壤PICRUSt2細菌群落功能預測分析

利用PICRUS12軟件進行細菌功能特征預測，同時結合京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）注釋基因數據庫進行比對，對土壤細菌進行代謝功能預測。如圖3b，在二級代謝通路中，Lp+Gm處理的其他次生代謝物合成（Biosynthesisofothersecondarymetabolites）途徑的相對豐度顯著高于Lp+Vv（Plt;0.05），CK 處理的排泄系統（Excretorysystem）、信號轉導（Signaltransduction）、轉錄（Transcription）代謝途徑顯著高于人工生草處理（Plt;0.05）。如圖3a，在一級代謝通路中，存在差異的代謝途徑為有機系統（Organismalsystems），其中CK 顯著高于Lp+As（Plt;0.05）。這些代謝特征反映了不同生草措施對土壤細菌群落功能的不同調控。

2.4 不同生草措施下有機獼猴桃園耕層土壤微生物群落共現網絡和屬性的變化

篩選出相對豐度大于0.1% 的菌種，基于Spearman相關性分析（Plt;0.05）運用網絡結構分析了不同生草措施下土壤細菌屬水平的共現模式（圖4）。本研究中構建的網絡結構的平均聚類系數和特征路徑長度的值均高于他們的隨機網絡結構（表4），這表明構建的網絡結構的凝聚性是有意義的，揭示了群落中物種非隨機的交互，說明構建的網絡結構中擁有典型的小世界和模塊特性;并且每個網絡結構的模塊度都大于0.4，也說明了網絡結構含有模塊結構[21]。具有小世界和模塊化的細菌網絡共現結構可能對微生物維持生態(tài)系統功能的能力具有重要影響[22]。

如表4所示，本研究統計了不同處理下微生物網絡的拓撲學性質。CK 處理的平均聚類系數最低（0.541），平均路徑長度最高（3.678），模塊化程度最高（0.72）。與CK相比，人工生草措施增加了微生物網絡的連接數，Lp+As，Lp+Gm，Lp+Vv處理的總連接數分別增加了70.57%，41.29%，8.74%，正向連接比例增加了70.20%，42.97%，41.79%，Lp+As和Lp+Gm處理的負向鏈接增加了72.45%，32.64%，Lp+Vv處理的負向鏈接降低了77.07%。

果園行間生草顯著改變了影響細菌網絡的關鍵物種。本研究根據微生物屬水平之間的介數中心性評分劃分重點物種（表5）。在Lp+As處理中關鍵微生物屬為野野村放線菌（Nonomuraea）、丙酸桿菌（Propionivibrio）、玻囊菌（Hyalangium）;Lp+Gm處理中關鍵微生物屬為產卟啉桿菌（Porphyrobacter）、短波單胞菌（Brevundimonas）、丙酸桿菌（Propionivibrio）;Lp+Vv處理中關鍵微生物屬為農桿菌（Agrobacterium）、Stella、泛菌（Pantoea）;CK 處理中關鍵微生物屬為濱田氏菌（Hamadaea）、浮霉菌（Planctomycetacia_）、Aureimonas。

2.5 不同生草措施下有機獼猴桃園耕層土壤細菌群落和環(huán)境因子的關系

如圖5a，基于Spearman相關性系數構建環(huán)境因子與細菌門水平的網絡圖。共有36個節(jié)點，79條連線。網絡中包含的環(huán)境因子有CAT，URE，SOM，pH，ALP。ALP具有最大的連通度（節(jié)點度=7），其次是pH 具有較大的連通度（節(jié)點度=6），說明ALP，pH 與細菌的相關性大。與ALP相連的主要為浮霉菌門（Planctomycetes），與pH 相連的細菌主要為腸桿菌門（Entotheonellaeota）、變形菌門。如圖5b，PLS-PM 結果揭示了土壤環(huán)境因子、細菌群落多樣性、網絡結構復雜性的相互影響關系，適配度=0.752，證明該模型整體解釋能力較高。土壤pH 對SOM 有顯著的正向影響（路徑系數=0.7691，Plt;0.05），SOM 對土壤酶活性有顯著的正向影響（路徑系數=-0.8526，Plt;0.05）。

3 討論

3.1 不同生草措施對有機獼猴桃園耕層土壤理化性質與酶活性的影響

在本研究中，與清耕處理相比，Lp+As，Lp+Gm 處理提高了土壤有機質的含量，這與Tu等[23]的研究結果一致，其認為生草覆蓋能夠顯著增加土壤有機質的含量。本研究中生草處理的pH 值與對照相比顯著升高，該結果與Wang等[24]在寧夏棗園中的研究結果一致。土壤微生物通過分泌特定的胞外酶代謝和轉化有機物，將大分子有機物降解[25]。土壤過氧化氫酶活性在一定程度上反映了土壤微生物過程的強度。土壤脲酶活性常用于表征土壤的氨態(tài)氮供應狀況。堿性磷酸酶能夠促進有機磷化合物的水解，提高土壤磷循環(huán)的有效性[26]。本研究中Lp+Gm，Lp+Vv處理下3種酶活性均顯著提升，表明Lp+Gm，Lp+Vv土壤的養(yǎng)分循環(huán)能力得到了提升，有助于提供植物所需的養(yǎng)分。Lp+As處理的堿性磷酸酶活性顯著低于對照處理，Lp+As可能以其它方式降低環(huán)境的磷限制。SEM 分析（圖5b）表明土壤有機質對土壤酶活性有正向影響，生草對土壤有機質含量的提升對酶活性有促進作用。

3.2 不同生草措施對有機獼猴桃園耕層土壤細菌多樣性的影響

本研究表明，不同生草措施不僅影響細菌群落多樣性，且改變了細菌群落的組成。與CK 處理相比，人工生草處理細菌的beta多樣性更高，可能是因為人工生草處理相比于自然生草根系性狀的改變、營養(yǎng)物質的增加、地表徑流和土壤侵蝕的減少導致的土壤環(huán)境異質性[23，27-28]。在本研究中，相比于對照，芽單胞菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、酸桿菌門豐度增加。厚壁菌門具有移動性、還原性乙酰輔酶A途徑（固碳途徑）和纖維素分解特性，主要參與秸稈聚合物的初始分解，而Lp+Gm處理中擬桿菌門的豐度增加，可能在后期負責半纖維素聚合物的分解[29]。變形菌門屬于富營養(yǎng)型類群，參與土壤有機質的分解[30]，芽單胞菌門相對豐度與土壤有機質含量呈正相關，是植物促生長細菌，與植物相互作用進行生物固氮，誘導植物分泌植物激素[31-32]，證明人工生草有助于提升土壤養(yǎng)分。LEfSe分析表明，Lp+Gm 處理的差異細菌為生絲單胞菌，屬變形菌門，變形菌門能分解有機物質從而獲取生命活動所需的物質和能量。在本研究中，細菌參與了多種代謝途徑，在一級代謝通路中主要存在差異的代謝途徑為有機系統。相比于對照，人工生草處理的根系更加發(fā)達，其根際效應導致不同處理土壤的細菌類型表現出代謝功能的差異。在本研究中，CK的二級差異代謝通路的代謝功能最高，可能是CK處理中受人為種植黑麥草和綠肥作物選擇較少，導致其相對功能多樣性更高。

3.3 不同生草措施對有機獼猴桃園耕層土壤細菌共現網絡的影響

研究土壤細菌網絡結構有助于了解微生物如何協同工作來影響土壤生態(tài)系統的功能，包括養(yǎng)分循環(huán)、有機質降解和土壤生產力等[33]。較高的聚類系數代表微生物群落更加活躍和多樣化、結構更加穩(wěn)定[34]，較短的平均路徑長度表示微生物之間的共現關系更緊密，微生物之間更容易進行交互和合作[35]。本研究網絡分析表明，人工生草降低了網絡的平均路徑長度和模塊化程度，提升了網絡的平均聚類系數，說明人工生草處理提高了微生物的相互作用程度，有助于維持群落的平衡。在微生物共現網絡結構中，正向連接代表微生物之間是共發(fā)生關系，負向連接代表微生物之間是共排斥關系。在本研究中，與自然生草相比。人工生草增加了細菌網絡的總連接數，特別是正向連接，這與已有研究結果一致[14，36]，這說明果園人工生草措施可以促進土壤細菌類群之間的相互作用關系，特別是共發(fā)生關系。植物通過光合作用固定的碳約有17%通過根系滲出釋放到根際土壤中[37]，因此，人工生草處理土壤中含有更豐富的碳源，這些外源輸入的碳源促進了細菌類群之間的共存，減少了細菌類群之間的競爭。Lp+As處理產生了最多的正向連接和負向連接，這可能是因為該處理的SOM 含量最高，更有利于土壤細菌的生長[38]。

在本研究中，人工生草處理改變了網絡結構中的關鍵物種。人工生草相比于自然生草將土壤中關鍵微生物物種轉化為以變形菌門為主的物種，表明變形菌門在人工生草處理的網絡結構中起著關鍵作用。放線菌門包括一大批腐生絲狀細菌，能參與植物凋落物的腐爛和土壤有機質降解，在分解土壤中的纖維素、幾丁質等其他頑固性化合物方面發(fā)揮著重要作用[38-39]。

4 結論

與自然生草相比，人工生草措施提高了關中地區(qū)有機獼猴桃園耕層土壤的pH、有機質含量、酶活性;增加了細菌群落的多樣性，改變了土壤細菌組成，降低了差異代謝通路的代謝功能，促進了細菌群落之間的相互作用關系;相關性分析表明，pH 和ALP對細菌群落結構的影響較大。綜上，人工生草措施對于改善關中地區(qū)有機獼猴桃園土壤質量和微生態(tài)環(huán)境有重要作用，其中一年生黑麥草+毛苕子和一年生黑麥草+紫云英的效果尤佳。