煙堿對腸缺血再灌注損傷大鼠凝血功能的影響

[摘要]"目的"觀察膽堿能激動劑煙堿對大鼠腸缺血再灌注損傷后凝血功能的影響。方法"選取32只體質(zhì)量250～300g雄性健康SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法將它們分為四組（n=8）：假手術(shù)（sham"operation，S）組、腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）組、煙堿（nicotine，NIC）組、α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7"nicotinic"acetylcholine"receptor，α7nAchR）拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）組。大鼠腸缺血再灌注損傷模型采取腸系膜上動脈夾閉45min后恢復(fù)再灌注120min的方法建立。α-BGT組在腸系膜上動脈夾閉前45min和30min分別腹腔注射α-BGT"1μg/kg，煙堿400μg/kg；NIC組用等容量生理鹽水替代α-BGT，"S組和IR組用等容量生理鹽水替代α-BGT和煙堿，其余均同α-BGT組。在大鼠恢復(fù)再灌注120min后經(jīng)腹主動脈取血樣，檢測血漿腫瘤壞死因子-α（plasma"tumor"necrosis"factor，TNF-α）、組織因子（tissue"factor，TF）、抗凝血酶（antithrombin，AT）、組織型纖溶酶原激活物（tissue"plasminogen"activator，tPA）、纖溶酶原激活物抑制物-1（fiber"plasminogen"activator"inhibitor-1，PAI-1）、D-二聚體水平和血小板計數(shù)（platelet"count，PLT）。取遠(yuǎn)端回腸采用Chiu評分法評估小腸組織受損程度。結(jié)果"與S組和NIC組比較，IR組和α-BGT組血漿TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平均出現(xiàn)顯劇升高，血漿AT水平下降，血小板計數(shù)下降（Plt;0.05），小腸組織Chiu評分增加（Plt;0.05）。結(jié)論"煙堿能夠抑制大鼠腸缺血再灌注損傷導(dǎo)致的凝血功能過度激活；其作用機(jī)制可能為外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合，引起膽堿能抗炎通路的激活，進(jìn)而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的釋放減少，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

[關(guān)鍵詞]"腸缺血再灌注損傷；血液凝固；煙堿

[中圖分類號]"R656""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.14.010

Effect"of"nicotine"on"coagulation"and"fibrinolysis"in"intestinal"ischemia-reperfusion"injury"rats

WANG"Haisong，"XU"Linmei，"CHEN"Zhenyi，"GAO"Haiying，"CAI"Dongmiao

Department"of"Anesthesiology，"the"First"Affiliated"Hospital"of"Xiamen"University，"Xiamen"361003，"Fujian，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effect"of"nicotine"on"coagulation"in"intestinal"ischemia-reperfusion"injury"rats."Methods"32"male"Sprague-dawley"rats，"weighing"250-300g，"were"randomly"divided"into"4"groups"（n=8）："sham"operation"group"（S），"intestinal"ischemia-reperfusion"（IR）"group，"nicotine"（NIC）"group，"α7"nicotinic"acetylcholine"receptornbsp;（α7nAchR）"antagonist"group"α-bungarotoxin"（α-BGT）"group."Intestinal"IR"was"induced"by"clamping"superior"mesenteric"artery"for"45min"and"120min"of"reperfusion."In"group"NIC"nicotine"400μg/kg"was"injected"intraperitoneally"at"30min"before"superior"mesenteric"artery"occlusion."In"group"α-BGT"1μg/kg"was"injected"intraperitoneally"at"15min"before"superior"mesenteric"artery"occlusion."Plasma"tumor"necrosis"factor-α"（TNF-α），"tissue"factor"（TF），"antithrombin"（AT），"tissue"plasminogen"activator"（tPA），"fiber"plasminogen"activator"inhibitor-1"（PAI-1），"D-dimer"levels"and"platelet"count"（PLT）"were"measured"after"120min"reperfusion."Chiu’s"count"was"used"to"assess"the"changes"in"intestinal"mucosal"pathlolgical"morphology."Results"Compared"with"group"S"and"group"NIC，"the"plasma"TNF-α，TF，"tPA，"PAI-1"and"D-dimer"levels"were"significantly"increased，"and"plasma"AT"level"and"platelet"count"were"significantly"decreased，"in"group"IR"and"group"α-BGT（Plt;0.05），Chiu’s"scores"were"significantly"increased（Plt;0.05）."Conclusion"Nicotine"can"inhibit"the"excessive"activation"of"coagulation"function"in"intestinal"ischemia-reperfusion"injury"rats."Its"mechanism"may"be"related"to"activation"of"cholinergic"antiinflammatory"pathway，"reducing"the"release"of"pro-inflammatory"cytokines"thereby"reducing"endothelial"cell"injury.

[Key"words]"Intestinal"ischemia-reperfusion"injury;"Blood"coagulation;"Nicotine

腸缺血再灌注損傷是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克和腸移植等疾病常見的并發(fā)癥，具有較高的發(fā)生率和病死率[1-2]。腸道屏障功能受損和細(xì)菌移位是腸缺血過程中的常見并發(fā)癥，常導(dǎo)致活性氧和炎性細(xì)胞因子的過度釋放，甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。炎性細(xì)胞因子大量的釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，造成內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而引起抗凝和纖容抑制，導(dǎo)致血管內(nèi)外纖維蛋白沉積，出現(xiàn)凝血和纖溶功能紊亂，使得微循環(huán)障礙進(jìn)一步加劇，最終導(dǎo)致多器官衰竭[3-4]。前期研究表明，大鼠內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的凝血和纖溶功能紊亂，可以通過電刺激足三里穴使膽堿能抗炎通路激活，進(jìn)而導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放減少從而得到明顯的改善[5]。因此，本研究擬通過夾閉腸系膜上動脈復(fù)制大鼠腸缺血再灌注損傷動物模型，探討膽堿能激動劑煙堿對大鼠腸缺血再灌注損傷時凝血功能的影響。

1""材料與方法

1.1""實驗動物與分組

SPF級健康雄性Sprague"Dawley"大鼠32只，年齡6～8月，體質(zhì)量250～300g，由廈門大學(xué)實驗動物中心提供[實驗動物許可證號：SYXK（閩）2018-0009]。將實驗動物采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組8只：①假手術(shù)（sham"operation，S）組；②腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）組；③煙堿（nicotine，NIC）組；④α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7"nicotinic"acetylcholine"receptor，α7nAchR）拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）組。

1.2""模型制備

大鼠腸缺血再灌注損傷模型采用參考文獻(xiàn)[6]中結(jié)扎腸系膜上動脈的方法制備。動物自由飲水，在實驗開始前12h停止進(jìn)食。通過腹腔注射50mg/kg"的1%戊巴比妥納對大鼠進(jìn)行麻醉，大鼠麻醉成功后仰臥固定于鼠板上，經(jīng)常規(guī)消毒后鋪巾，沿著腹部正中切開約3.5cm的切口進(jìn)入腹腔，游離大鼠腸系膜上動脈后，用無損傷動脈夾將其夾閉，45min后松開動脈夾以恢復(fù)再灌注。待腸系膜上動脈重新恢復(fù)搏動后將腸管回納入腹腔并逐層關(guān)腹。S組僅分離不夾閉腸系膜上動脈，α-BGT組在腸系膜上動脈夾閉前45min和30min分別腹腔注射α-BGT"1μg/kg，煙堿400μg/kg。NIC組用等容量生理鹽水替代α-BGT，"S組和IR組用等容量生理鹽水替代α-BGT和煙堿，余均同α-BGT組。

1.3""標(biāo)本采集

在大鼠恢復(fù)再灌注120min后，通過腹腔注射50mg/kg"1%戊巴比妥納麻醉大鼠，將2.7ml取自于腹主動脈的血樣于含枸櫞酸鈉抗凝管中并持續(xù)靜置15min，再在4℃的離心機(jī)（3000g）離心10min，收集離心后的上清液，貯存于–20℃冰箱中待用，血漿中瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor，TNF-α）、組織因子（tissue"factor，TF）、抗凝血酶（antithrombin，AT）、組織型纖溶酶原激活物（tissue"plasminogen"activator，tPA）、纖溶酶原激活物抑制物-1（fiber"plasminogen"activator"inhibitor-1，PAI-1）、D-二聚體水平采用ELISA法來測定。取血1ml置于含乙二胺四乙酸二鉀鹽抗凝采血管中，使用全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血小板計數(shù)。取離回盲瓣5cm處小腸組織制成標(biāo)本，進(jìn)行小腸組織損傷病理評分。

1.4""小腸組織損傷病理評分

采用10%甲醛溶液固定遠(yuǎn)端回腸，進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)制備HE染色切片，并在光學(xué)顯微鏡下觀察小腸病理損傷情況，參考文獻(xiàn)[7]采用Chiu評分法評判小腸黏膜損傷程度。

1.5""統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS"20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

IR組和α-BGT組血漿中的TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平與S組相比均出現(xiàn)明顯升高，而AT水平則降低，血小板計數(shù)減少（Plt;0.05），小腸組織Chiu評分增加（Plt;0.05）；IR組和α-BGT組血漿中的TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平與NIC組相比均出現(xiàn)明顯升高，AT水平降低，血小板計數(shù)（platelet，PLT）減少（Plt;0.05），小腸組織Chiu評分增加（Plt;0.05）。見表1，表2。

3""討論

腸缺血再灌注損傷是導(dǎo)致臨床危重癥患者出現(xiàn)多器官衰竭的重要原因，其病理生理機(jī)制主要是過度釋放炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和氧自由基，從而造成局部和遠(yuǎn)隔器官受損，同時伴有血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[8-9]。研究顯示，腸缺血再灌注時血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而激活凝血系統(tǒng)，抑制纖溶系統(tǒng)，最終出現(xiàn)微循環(huán)功能障礙[2]。

機(jī)體的主要抗凝系統(tǒng)為AT系統(tǒng)和TF系統(tǒng)，其中AT在缺血再灌注損傷時直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞上的糖胺的表達(dá)和凝血酶的蛋白水解活性，其是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。在感染時，AT因為合成受阻及消耗過多等原因常常導(dǎo)致其水平下降[3，10]。當(dāng)腸缺血再灌注損傷發(fā)生時，機(jī)體釋放大量的炎性細(xì)胞因子TNF-α，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞過度的釋放TF、TF與凝血因子FⅦa或Ⅹa形成復(fù)合物激活外源性的凝血系統(tǒng)[11]。TF-FVIIα復(fù)合物又可以引起TNF-α的合成和釋放。TNF-α激活炎性細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)TF表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)與凝血反應(yīng)的相互作用，形成一個持續(xù)不斷的惡性循環(huán)[12]。在生理性凝血過程中血小板起著關(guān)鍵性的作用，在急性炎癥反應(yīng)時，凝血功能出現(xiàn)異常，是由于血小板大量被消耗所致。本實驗結(jié)果顯示，IR組小腸組織Chiu評分、血漿TNF-α和TF明顯高于S組，AT和血小板較S組降低，證明模型制備成功。

在正常生理狀態(tài)下，血液中的tPA水平維持在一個特定的水平內(nèi)，當(dāng)出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)時，TNFα刺激血液中PAI-1水平升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量的tPA入血，隨后tPA與PAI-1形成復(fù)合物，抑制纖溶功能，導(dǎo)致血管內(nèi)纖維蛋白降解物D-二聚體增[13]。

本實驗選擇給予煙堿的時機(jī)和劑量是根據(jù)文獻(xiàn)[14]來確定的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠小腸組織Chiu評分在腸缺血再灌注損傷后顯劇升高，血漿中TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平上升，而AT含量與血小板計數(shù)下降，大鼠小腸組織Chiu評分在給予煙堿處理后明顯低于IR組，且與IR組相比血漿中TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平降低，AT水平及血小板計數(shù)增加，這說明煙堿對大鼠腸缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，并使紊亂的凝血功能得到改善。而在預(yù)先給予α7煙堿型乙酰膽堿受體拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素后，煙堿對大鼠炎癥和凝血功能的改善被阻斷，表明煙堿對腸缺血再灌注大鼠凝血功能的影響主要通過與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合而發(fā)揮作用的。

煙堿對腸缺血再灌注損傷時凝血功能的影響可能是通過與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體相結(jié)合，導(dǎo)致膽堿能抗炎通路被激活，從而抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致紊亂的凝血和纖溶功能得到改善。炎癥系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)在腸缺血再灌注損傷時相互激活，其中炎性細(xì)胞因子TNF-α在激活凝血系統(tǒng)時發(fā)揮了關(guān)鍵作用。有研究表明，TNF-α可造成機(jī)體組織因子過度表達(dá)，進(jìn)而引起凝血系統(tǒng)的激活，并抑制抗凝血和纖溶功能[15-16]。研究證明，α7煙堿型乙酰膽堿受體激動劑能夠抑制腸上皮細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下發(fā)生的炎癥反應(yīng)和氧化損傷，其主要機(jī)制是通過膽堿能抗炎通路的激活來實現(xiàn)的[4]。劉薇等[14]經(jīng)研究后發(fā)現(xiàn)，煙堿對內(nèi)毒素大鼠凝血和纖溶功能具有明顯的改善作用，其機(jī)制可能是煙堿與α7煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合，通過膽堿能抗炎通路的激活來抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮作用。

綜上所述，預(yù)先給予煙堿，可以有效地改善腸缺血再灌注損傷大鼠凝血功能，其作用機(jī)制可能是煙堿與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合，繼而激活膽堿能抗炎通路，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放減少，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

• 錄亞鵬，"劉洋，"郝偉，"等."細(xì)胞焦亡在腸缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展[J]."中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，"2021，"26（12）："1437–1443."
• 張偉，"王迎斌，"曹璐，"等."自噬在腸缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展[J]."中國臨床藥理學(xué)與治理學(xué)，"2022，"9："1061–1066
• 侯小煜，"冷玉芳，"曹雪芬，"等."Nrf2信號通路在腸缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J]."蘭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），"2022，"48（10）："81–85."
• WANG"H"S，"CAI"D"M，"CHEN"Z"Y，"et"al."GTS-21"promotes"α7"nAChR"to"alleviate"intestinal"ischemia-"reperfusion-induced"apoptosis"and"inflammation"of"enterocytes[J]."Med"Sci"Monit，"2020，"26："e921618."
• 汪海松，"蔡東妙，"徐林梅，"等."電針足三里穴對大鼠腸缺血再灌注時凝血功能的影響[J]."中華麻醉學(xué)雜志，"2017，"07："865–868."
• 李青文，"謝景遠(yuǎn)，"崔珊珊，"等."PI3K/Akt信號通路在丙泊酚減輕大鼠腸缺血再灌注損傷中的作用[J]."中華麻醉學(xué)雜志，"2019，"39（3）："319–322