植物基因編輯技術(shù)及其在果樹上的應(yīng)用

張春渝 許小瓊 賴鐘雄

收稿日期：2024-01-06

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31572088）；國家重點研發(fā)計劃（2019YFD1000901）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（香蕉）專

項資金（GARS-31-15）；福建省高原學(xué)科建設(shè)經(jīng)費（102/71201801101）

作者簡介：*為通訊作者：賴鐘雄（1966-），男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究工作，E-mail：

laizx01@163.com。張春渝（1999-），女，在讀博士生，主要從事果樹生物技術(shù)研究，E-mail：zcynhba@163.com

摘要：基因編輯技術(shù)不同于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以在不引入外源DNA片段的情況下快速、精確地對生物體基因組進行改造，具有較高的安全性?；蚓庉嫾夹g(shù)在水稻、玉米、馬鈴薯等農(nóng)作物以及擬南芥等模式植物中已經(jīng)進行了大量的研究，近年來在果樹上也取得了一定成就，在果樹育種上顯示出巨大的應(yīng)用潛力。據(jù)此介紹了植物基因編輯技術(shù)的種類及基本原理，總結(jié)了果樹基因編輯技術(shù)研究進展，分析了存在的問題，并對果樹基因編輯技術(shù)的應(yīng)用前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：果樹；基因編輯；現(xiàn)狀；展望

中圖分類號：S667? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2095-5774（2024）01-0001-16

Plant Gene Editing Technology and its Applications in Fruit Trees

Zhang Chunyu，Xu Xiaoqiong，Lai Zhongxiong*

（Institute of Horticultural Biotechnology/Institute of Subtropical Fruits，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，

Fuzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Abstract：Compared with traditional transgenic technology，gene editing technology can rapidly and precisely modify the genome of an organism without introducing exogenous DNA fragments，and presents higher security. In recent years，gene editing technology has been widely used in many crops，such as rice，maize and potatoes and model plant Arabidopsis thaliana，which has also been successfully applied in fruit trees，showing great potential in fruit tree breeding. In this paper，we introduced the types and basic principles of plant gene editing technology，summarized the research progress of this technology in fruit trees，analysed the existing problems and looked forward to the prospect of the applications of gene editing technology in fruit trees.

Key words：Fruit tree；Gene editing；Current situation；Prospect

基因編輯技術(shù)根據(jù)序列特異性核酸酶的不同，可以分為3類：鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFNs）技術(shù)［1］、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator like effector nucleases，TALENs）技術(shù)［2］以及CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技術(shù)?；蚓庉嫾夹g(shù)的原理是利用特定的酶和RNA序列，精確地識別和切割目標(biāo)DNA序列，觸發(fā)DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB），隨后激活細胞自身的修復(fù)系統(tǒng)來誘導(dǎo)目標(biāo)基因的失活或突變，或?qū)胪庠椿?。細胞自身的修?fù)系統(tǒng)主要包括非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)與同源定向修復(fù)（Homology directed repair，HDR）途徑。在大多數(shù)情況下，NHEJ能夠引起隨機插入或刪除（indels），如果損傷發(fā)生在基因的編碼區(qū)，則可能導(dǎo)致移碼突變，從而實現(xiàn)基因敲除。當(dāng)有與DSB周圍序列具有同源區(qū)域的模板時，DNA損傷可以被HDR修復(fù)，利用這一機制可以實現(xiàn)精確的基因修飾或基因插入［3］?？偟膩碚f，ZFNs、TALENs和CRISPR技術(shù)都能夠?qū)ι矬w基因組特定目標(biāo)進行修飾，這些技術(shù)的發(fā)展為植物功能基因組學(xué)研究和遺傳改良提供了技術(shù)支撐。

植物基因編輯技術(shù)能夠精確定向改良植物性狀，可操作性強，安全性高，已經(jīng)在植物中得到廣泛的應(yīng)用。本文在介紹基因編輯技術(shù)的種類及基本原理的基礎(chǔ)上，總結(jié)了果樹基因編輯技術(shù)應(yīng)用情況，分析了存在的問題，并對果樹基因編輯技術(shù)的應(yīng)用前景進行了展望，以期為果樹基因編輯的研究與應(yīng)用提供參考。

1. 植物基因編輯技術(shù)及其工作原理

1.1 ZFNs技術(shù)

1996年，第一代基因編輯技術(shù)ZFNs技術(shù)問世［4］，這是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，由負責(zé)識別的鋅指模塊組成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和負責(zé)切割DNA鏈的FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域組成［5］。二者結(jié)合能夠造成DNA在特定位點斷裂，進一步誘發(fā)細胞自身的修復(fù)方式，從而實現(xiàn)基因編輯。鋅指DNA結(jié)合域一般包含3個獨立的鋅指重復(fù)結(jié)構(gòu)，每個鋅指結(jié)構(gòu)能夠識別3個堿基，也就是說一個鋅指DNA結(jié)合域可以識別9 bp長度的特異性序列（ZFN二聚體包含6個鋅指，可以識別18bp長度的特異性序列）［6］，這說明增加鋅指的數(shù)量可以擴大ZFN特異性識別DNA序列的長度，從而獲得更強的序列特異性。一般通過模塊化組合單個ZF，來獲得特異性識別足夠長的DNA序列的鋅指DNA結(jié)合域。目前，ZFNs技術(shù)在擬南芥［7］、玉米［8］等多種植物中都得到了應(yīng)用。但是ZFNs技術(shù)也存在局限性，包括有限的鋅指蛋白類別只可識別有限的DNA序列導(dǎo)致可編輯的靶基因位點有限，編輯的效率低，操作復(fù)雜，成本高，容易脫靶等。

1.2 TALENs技術(shù)

繼ZFNs技術(shù)之后，TALENs技術(shù)又一次點燃了基因編輯革命［9］。典型的TALEN由一個包含核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）的N端結(jié)構(gòu)域、一個包含可識別特定 DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域，以及一個具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成。TALEs作為一個重要的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶，最初在黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)的，其一旦進入植物細胞，就能夠定位到細胞核，與目標(biāo)啟動子結(jié)合并誘導(dǎo)基因表達。TALEs的N端結(jié)構(gòu)域包含細菌分泌信號（Type III secretion signal，T3SS）和4個非典型的重復(fù)序列（Non-canonical repeats，NCR）［10-12］，它們的C端包含一個植物轉(zhuǎn)錄因子TFIIA的相互結(jié)合位點（Transcription factor binding site，TFB）、兩個功能性核定位信號（Nuclear localization signals，NLS）和一個酸性激活結(jié)構(gòu)域（Acidic activation domain，AD）［13-15］（圖 1）。TALEN的DNA識別域是由一些非常保守的重復(fù)氨基酸序列模塊組成，每個模塊由33～35 aa串聯(lián)重復(fù)的氨基酸組成，其中第12和13位的氨基酸種類為可變的（Repeat-variable di-residues，RVDs）［16］，這些RVD中有些能特異性識別單個核苷酸序列，有些則可以識別2～4個核苷酸序列（其中NG可以識別T，NI可以識別A，NN可以識別G或A，HD可以識別C，NS可以識別A或G或C或T），如果重新排列這些重復(fù)序列，TALEs和TALEN的DNA結(jié)合特異性可以隨意改變［9］。TALENs技術(shù)的工作原理是將識別特異DNA序列的TALE與內(nèi)切核酸酶FokI偶聯(lián)，然后通過DNA識別模塊將TALEN元件靶向特異性的DNA位點并結(jié)合，兩個鄰近的FokI形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個靶位點之間打斷目標(biāo)基因［17］。誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機制，借助于細胞內(nèi)固有HDR或NHEJ修復(fù)機制來完成對基因的修飾過程。

1.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)

1987年，人們在大腸桿菌的基因組中首次發(fā)現(xiàn)了一個特殊的重復(fù)間隔序列——聚集規(guī)律間隔短回文重復(fù)（CRISPR）序列［18］。CRISPR是大多數(shù)細菌和古細菌基因組的一個顯著特征，被認(rèn)為與噬菌體的抗性相關(guān)［19-20］。CRISPR-Cas系統(tǒng)是CRISPR序列與Cas蛋白組合形成的一個以RNA為指導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其中CRISPR基因座主要由前導(dǎo)區(qū)（leader）、重復(fù)序列區(qū)（repeat）和間隔區(qū)（spacer）構(gòu)成。Cas基因則位于CRISPR基因附近或分散于基因組其他地方，編碼的蛋白包括Cas1-Cas10。CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠根據(jù)干涉階段切割靶標(biāo)所用 Cas 效應(yīng)物為單體酶還是多亞基復(fù)合物分為2類［21］（圖2）：第1類CRISPR-Cas系統(tǒng)中具有由多個Cas蛋白組成的效應(yīng)模塊，它們形成一個crRNA結(jié)合復(fù)合體，共同作用于靶標(biāo)的結(jié)合和加工，該類包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型；第2類CRISPR-Cas系統(tǒng)具有一個單一的、多結(jié)構(gòu)域的crRNA結(jié)合蛋白，該類包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型［21］。目前，我們使用的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)屬于第2類，第 2 類 CRISPR-Cas 系統(tǒng)是目前植物基因編輯應(yīng)用最廣泛的系統(tǒng)，還包含了CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13編輯技術(shù)。雖然它們都屬于第2類CRISPR-Cas系統(tǒng)，但是CRISPR-Cas9（II型）與CRISPR-Cas12（V型）以及CRISPR-Cas13（VI型）技術(shù)還存在許多不同之處。CRISPR-Cas9系統(tǒng)利用sgRNA（single-guide RNA，由crRNA和tracrRNA 組成）特異性靶向dsDNA［22］。Cas9一旦感知到正確的堿基配對，就能夠結(jié)合到與PAM（Protospacer adjacent motif）相鄰的sgRNA間隔序列互補的DNA序列上［23］，從而激活RuvC和HNH核酸酶來切割非靶標(biāo)和靶標(biāo)DNA鏈，造成靶位點DNA雙鏈斷裂［22］。CRISPR-Cas9系統(tǒng)切割類型為平末端，大小為1000～1600個氨基酸。CRISPR-Cas12a系統(tǒng)也被稱為CRISPR-Cpf1系統(tǒng)，Cas12a能夠由crRNA引導(dǎo)靶向ssDNA和dsDNA。Cas12a結(jié)合到與crRNA間隔序列互補的DNA序列上，通過正確的堿基配對來激活其RuvC核酸酶以獲得一般的ssDNA酶活性，從而切割非靶DNA鏈和靶DNA鏈以及反式ssDNA底物［24］。CRISPR-Cas13a系統(tǒng)也被稱為CRISPR-C2c2，能夠靶向切割單鏈RNA，其由crRNA引導(dǎo)Cas13a，讓其與crRNA間隔序列互補的ssRNA序列結(jié)合。一旦Cas13a進行了正確的堿基配對就能夠激活HEPN核酸酶，從而獲得ssRNase活性來實現(xiàn)對單鏈RNA的切割過程［25-26］?？偟膩碚f，CRISPR-Cas9能夠切割dsDNA，CRISPR-Cas12a能夠切割ssDNA和dsDNA，CRISPR-Cas13a能夠?qū)崿F(xiàn)對ssRNA的切割，各有優(yōu)點。目前應(yīng)用較為廣泛的是CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a基因編輯技術(shù)。

1.3.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)

作為第三代基因編輯技術(shù)，CRISPR-Cas9相較于ZFNs、TALENs等基因編輯技術(shù)具有效率高、簡便、成本低、容易上手等優(yōu)點，因此成為當(dāng)今最主流的基因編輯系統(tǒng)。在眾多天然CRISPR-Cas系統(tǒng)中，第2類（class 2）系統(tǒng)只需要一個RNA指導(dǎo)的Cas核酸酶就能夠完成對靶點的切割［21］。其中Cas9核酸酶成為了第一個被用于基因組編輯的Cas效應(yīng)子［22］。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由Cas9、crRNA、tracrRNA三部分組成。其中，crRNA和tracrRNA通過局部堿基配對組成gRNA（guide RNA），gRNA與Cas9蛋白結(jié)合后引導(dǎo)Cas9蛋白識別和切割目標(biāo)DNA序列［22］。2012年，為了方便實驗設(shè)計并提高gRNA的穩(wěn)定性，Doudna和Charpentier團隊將crRNA和tracrRNA融合成一條RNA，并把其稱為sgRNA［27］。改造之后的CRISPR-Cas9系統(tǒng)成為了基因編輯研究的首選工具。一般來說，CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)的一切，原則上也可以使用ZFNs或TALENs技術(shù)來實現(xiàn)。然而，相對于ZFNs、TALENs技術(shù)來說，CRISPR-Cas9具有簡單性、高效性、成本低等多方面的明顯優(yōu)勢。CRISPR-Cas9系統(tǒng)因為不涉及蛋白質(zhì)工程，所以構(gòu)建起來十分快速。在此過程中，通過使用兩個互補的退火寡核苷酸進行體外轉(zhuǎn)錄，可以產(chǎn)生任意數(shù)量的gRNA。并且可以將多個sgRNA串聯(lián)對一個基因的多個位點進行編輯或同時對多個基因進行編輯［28］。然而，CRISPR-Cas9存在較為嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，可能會在錯位的基因位點切割DNA雙鏈，從而導(dǎo)致潛在風(fēng)險。與ZFNs和TALENs復(fù)雜的二聚體結(jié)構(gòu)不同，因為CRISPR-Cas9系統(tǒng)有別于ZFNs和TALENs技術(shù)形成復(fù)雜的二聚體，其擁有更簡單的單體結(jié)構(gòu)，可通過堿基配對識別同源位點，因此在識別和切割目標(biāo)DNA位點方面特異性低。因此，如何降低CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脫靶概率，提高編輯效率是基因編輯技術(shù)發(fā)展面臨的一個重要挑戰(zhàn)。2014年，研究者提出gRNA與Cas9蛋白可以預(yù)組裝成RNP（核糖核蛋白），RGENRNPs以高達79%的頻率誘導(dǎo)位點靶向編輯，同時減少與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相關(guān)的脫靶編輯，RGEN RNPs幾乎在轉(zhuǎn)染后立即切割染色體DNA，并在細胞中迅速降解，減少了脫靶效應(yīng)［29］。2021年，斯坦福大學(xué)亓磊團隊找到了一種分子量大小不到目前使用的CRISPR系統(tǒng)（例如Cas9或Cas12a）一半的新型Cas效應(yīng)蛋白（V-F Cas12f），并通過sgRNA設(shè)計和蛋白質(zhì)工程對Cas12f進行了優(yōu)化和修補，構(gòu)建出一個高效的微型Cas系統(tǒng)（CasMINI），其更容易傳遞到哺乳動物細胞中來應(yīng)用于CRISPR基因編輯的臨床治療［30］。2022年，研究者首先發(fā)現(xiàn)了CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)中脫靶背后的結(jié)構(gòu)機制，在此基礎(chǔ)上重新設(shè)計了Cas9蛋白——SuperFi-Cas9，其脫靶概率降低了數(shù)千倍，且編輯效率與原始版本的Cas9蛋白相同［31］。

1.3.2 CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統(tǒng)

基于Cas9的II型CRISPR系統(tǒng)被認(rèn)為是最簡單的CRISPR系統(tǒng)，最容易適應(yīng)基因組編輯，但V型Cpf1驅(qū)動系統(tǒng)的引入為CRISPR編輯系統(tǒng)提供了另一種選擇。2015年，Zetsche等從酸胺球菌和毛螺科中鑒定出兩個候選Cpf1酶，發(fā)現(xiàn)它們在人類細胞中具有高效的基因組編輯活性［24］。CRISPR- Cpf1被認(rèn)為是第2類CRISPR系統(tǒng)，但不同于CRISPR-Cas9系統(tǒng)，它被歸類為V型。與Cas9核酸酶一樣，Cpf1家族成員都含有一個RuvC-like核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，但缺少Cas9的第二個HNH核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。在II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，crRNA的成熟是由宿主內(nèi)護蛋白RNase III和與pre-crRNA堿基配對的tracrRNA共同完成的［32-33］。相反，Cas12a不需要tracrRNA，能夠?qū)⒆陨淼膒re-crRNA加工成成熟的crRNA［34］：當(dāng)pre-crRNA轉(zhuǎn)錄完成后，Cas12a在CRISPR重復(fù)序列形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)上游4 nt處將其切割，產(chǎn)生中間crRNA分子，這些中間crRNA分子在體內(nèi)進一步加工成成熟的crRNA。相較于Cas9，Cpf1可能更適合用于基因組編輯，CRISPR-Cpf1被稱為是新一代的基因組編輯系統(tǒng)。

Cpf1最顯著的特征在于它是由一個單crRNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶。Cas9需要tracrRNA加工crRNA陣列，并且需要crRNA和tracrRNA共同介導(dǎo)干擾［33］，Cpf1則不需要tracrRNA來加工crRNA，Cpf1-crRNA復(fù)合物能夠單獨切割靶DNA分子，不需要任何額外的RNA種類。Cpf1能夠在5'端進行交錯切割，產(chǎn)生一個粘性末端，與Cas9產(chǎn)生的平末端形成對比，這可能更有利于以精確方向整合DNA序列［35］。如果能對粘性末端的精確序列進行編程，就能將設(shè)計的DNA插入物以正確的方向整合到基因組中。在哺乳動物中證明這種裂解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)有利于促進基于非同源末端連接NHEJ的基因插入哺乳動物基因組［36］。此外，Cpf1還可能提高HDR效率，主要體現(xiàn)在Cas9僅在PAM位點上游切割3 bp，因此NHEJ途徑導(dǎo)致indel突變會破壞識別序列，阻止了后續(xù)的編輯。相比之下，由于Cpf1的切割位置相對遠離PAM（通常切割PAM位點下游18～23 bp的DNA），對識別序列并沒有造成破壞。識別序列的存在可能會賦予Cpf1再次切割的能力，并可能介導(dǎo)HDR，增加了進行所需基因組編輯的機會［24］。

Cpf1能夠識別富含T的PAM 序列，能夠在具有豐富AT基因組的生物體中進行基因組編輯，例如惡性瘧原蟲這種富含AT的結(jié)構(gòu)域控制的細菌基因組［37］，或?qū)T富集感興趣的領(lǐng)域（支架/基質(zhì)附著區(qū)和著絲粒DNA的難以延伸的DNA片段）。所以說與Cas9富含G的PAM要求相比，CRISPR- Cpf1系統(tǒng)為基因組目標(biāo)基因的選擇擴大了范圍。

1.3.3 基于CRISPR的堿基編輯器

堿基編輯器包括腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editor，ABE）、胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine base editor，CBE）和鳥嘌呤堿基編輯器（Guanine base editor，GBE），這些技術(shù)是在不產(chǎn)生DSB的情況下，為精確的基因組編輯提供了選擇，以此來避免基因組不穩(wěn)定和DNA修復(fù)導(dǎo)致的不可預(yù)測結(jié)果的風(fēng)險。2016年，DavidR. Liu實驗室首先提出CBE與ABE［38-39］，兩者都是依托于CRISPR的DNA定位能力，將堿基進行替換的過程。其中，CBE技術(shù)能夠在PAM 位點附近內(nèi)將胞嘧啶C轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，然后在DNA復(fù)制的過程中被當(dāng)作T，實現(xiàn)C到T轉(zhuǎn)換（相反鏈上的G到A的轉(zhuǎn)變）；ABE技術(shù)則是實現(xiàn)A到G的轉(zhuǎn)變（相反鏈上的T到C的轉(zhuǎn)變）。2020年，GBE堿基編輯器技術(shù)出現(xiàn)在大家的視野中［40-41］，這項技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)堿基C到G的突變。GBE與CBE技術(shù)的原理十分接近，都是將C先轉(zhuǎn)化為U，只不過GBE接下來直接用融合在Cas9蛋白另一端的Ugn酶將U堿基去除，隨后引發(fā)單堿基缺失修復(fù)反應(yīng)，提供C堿基向其它堿基突變的機會，但C會更傾向于突變?yōu)镚。

2植物基因編輯技術(shù)在果樹上的應(yīng)用

在園藝領(lǐng)域中，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)較為成功地被應(yīng)用于模式作物番茄的研究中［42］。D Ambrosi等［43］通過編輯2個類胡蘿卜素生物合成基因，編輯效率達到84%，說明CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種可以在番茄中產(chǎn)生有用突變的有效且快速的方法。目前，運用CRISPR-Cas9技術(shù)揭示了許多基因在番茄中的分子機制［44-45］，并通過編輯不同的基因來提高番茄產(chǎn)量和品質(zhì)［46］；提高番茄果實GABA［47-48］、番茄紅素的含量［49］；提高番茄對白粉病真菌［50］、果斑?。?1］、黃卷葉病毒［52］以及灰葡萄孢［53］的抗性。還能使用CRISPR-Cas9技術(shù)加速番茄的進化［54］，實現(xiàn)從頭馴化［55］，獲得矮化［56］、抗除草劑的番茄［57-58］，并能重新設(shè)計番茄果實形狀［59］。2021年，富含GABA的基因編輯番茄進入市場［60］；2022年，能夠積累維生素D3前體的基因編輯番茄被開發(fā)［61］。CRISPR-Cas9技術(shù)在番茄中的成功應(yīng)用可以為許多果樹基因編輯的研究提供參考。自2013年以來，基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用于許多果樹的遺傳改良，在柑橘［62-72］、香蕉［73-77］、草莓［78-82］、蘋果［83-87］、葡萄［88-94］、獼猴桃［95-100］等果樹中，均有基因編輯的相關(guān)報道?；蚓庉嫾夹g(shù)能夠改良果樹的植株形態(tài)、開花結(jié)果特性、果實品質(zhì)，調(diào)控果實成熟，提高抗病性和抗逆性等。

2.1柑橘

2014年，研究者發(fā)現(xiàn)將柑橘黃單胞菌亞種接種于柑橘葉片能夠顯著促進GUS的瞬時表達，并在技術(shù)基礎(chǔ)上通過Cas9/sgRNA成功對CsPDS進行了編輯［62］。2019年，鄧秀新院士團隊建立了山金柑CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，通過編輯PDS基因，導(dǎo)致葉片的白化表型，并通過編輯類胡蘿卜素裂解基因DIOXYGENASE 4（CCD4），獲得了兩個攜帶目標(biāo)突變的陽性T0苗［63］；同年，王年團隊在柑橘中首次建立CRISPR-Cas12a基因編輯系統(tǒng)［64］；Wang等［65］發(fā)現(xiàn)突變CsWRKY22基因能夠降低萬金橙對潰瘍病菌的敏感性；Yang等［66］證實內(nèi)含子多順反子 tRNA-gRNA （inPTG） 基因組編輯技術(shù)在柑橘的原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)和上胚軸穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中適用。研究者們在山金柑中實現(xiàn)了使用雙位點CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)進行基因組大片段高效敲除［67］。在多年生植物和無性繁殖的植物中，T0代植物的無轉(zhuǎn)基因基因組編輯是理想的，但具有挑戰(zhàn)性。核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）常被用于生產(chǎn)無轉(zhuǎn)基因植物。研究者通過使用Cas12a/crRNA核糖核蛋白轉(zhuǎn)化胚性原生質(zhì)體來編輯潰瘍易感性基因CsLOB1，在10個月內(nèi)開發(fā)出T0代的無轉(zhuǎn)基因耐潰瘍柑橘品系［68］，目前無轉(zhuǎn)基因抗?jié)儾「涕倨废狄勋@得美國農(nóng)業(yè)部動植物檢疫局的監(jiān)管批準(zhǔn)，不受美國環(huán)保局的監(jiān)管，這項研究為柑橘潰瘍病的控制提供了有效的解決方案以及有效的無轉(zhuǎn)基因基因組編輯策略。2023年3月，一種不依賴于RNP技術(shù)也被用于柑橘的基因編輯中，研究者利用CBE/gRNA對ALS基因進行堿基編輯，使植株具有抗除草劑表型的選擇標(biāo)記；使用Cas12a/crRNA編輯目標(biāo)基因；GFP用于檢測是否為轉(zhuǎn)基因植株，并運用此技術(shù)在番茄、煙草、馬鈴薯和柑橘中有效獲得T0代無轉(zhuǎn)基因基因編輯植物［69］。此外，堿基編輯器技術(shù)也被應(yīng)用在柑橘中。2022年，研究者利用ABE技術(shù)編輯了甜橙LOB1基因啟動子區(qū)的TATA-box，編輯過的植株對潰瘍病病原體柑橘黃單胞菌亞種具有抗性，還運用CBE技術(shù)編輯柑橘中的ALS基因，編輯植株對除草劑氯磺隆具有抗性，并且這種轉(zhuǎn)基因不會遺傳給后代［70］?；蚓庉嫾夹g(shù)也被用于柑橘品質(zhì)的改良，2023年徐強團隊通過基因編輯技術(shù)發(fā)現(xiàn)，CitPH4基因的敲除能夠顯著地降低檸檬酸的積累，表明CitPH4能夠促進檸檬酸的積累［71］；張飛等［72］發(fā)現(xiàn)CsLMI1基因具有能夠調(diào)控油胞發(fā)育的功能。

2.2香蕉

2017年廣東農(nóng)科院胡春華建立了香蕉CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)體系，定點敲除八氫番茄紅素脫氫酶MuPDS［73］。Tripathi等［74］利用基于CRISPR-Cas的基因編輯技術(shù)控制香蕉的細菌性病害香蕉黃單胞菌枯萎病。2023 年8月，Hu等［75］報道了香蕉高效非轉(zhuǎn)基因的REG-2啟動子驅(qū)動的基因刪除系統(tǒng)；同年12月，研究人員發(fā)現(xiàn)香蕉早期結(jié)節(jié)蛋白樣3（MusaENODL3）基因的靶向敲除，能夠使香蕉獲得抗黃單胞菌枯萎病功能。在基因編輯香蕉產(chǎn)業(yè)應(yīng)用上［76］，2023年5月菲律賓同意推廣抗褐變的基因編輯香蕉［77］。

2.3草莓

商業(yè)化草莓是八倍體，其基因編輯是巨大挑戰(zhàn)。Xing等［78］報道CRISPR-Cas9編輯靶向FvPDS、FvUF3GT（Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase）、FvF3H（Naringenin，2-oxoglutarate 3-dioxygenase）、和FvLDOX（Leucoanthocyanidin dioxygenase）在野生草莓（Fragaria vesca）中產(chǎn)生的編輯效率高達10%。Zhou等［79］在野生草莓中，利用CRISPR-Cas9和兩個gRNA編輯輔助素生物合成和信號相關(guān)基因FveTAA1和FveARF8，編輯成功的部分原因可能是使用了U6啟動子，該啟動子能增強引導(dǎo)序列的表達并提高突變率。Martín-Pizarro等［80］針對八倍體草莓（Fragaria × ananassa Duch. cv. Camarosa）進行花發(fā)育調(diào)節(jié)因子FaTM6的編輯，證明在八倍體草莓的編輯也是可行的；并使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)瞬時表達，敲除R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子（FvMYB10）和FvCHS基因，造成花青素積累的減少。此外，CRISPR-Cas9編輯草莓FaPG1基因能夠提高草莓果實硬度［81］。產(chǎn)業(yè)應(yīng)用上，Rasa Aridi報道J R Simplot 植物科學(xué)公司宣布利用基因編輯技術(shù)開發(fā)更耐貯藏的草莓［82］。

2.4蘋果

在蘋果的基因編輯研究中，最早是使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)突變了PDS基因［83］。2018年，在蘋果中報道了CRISPR-Cas9能夠直接遞送CRISPR-Cas9 RNPs的方法，用于獲得無外源DNA的編輯方法［84］。TFL1是一個參與花期抑制子，CRISPR介導(dǎo)的基因敲除TFL1會導(dǎo)致93%的編輯蘋果提前開花［85］。此外，CRISPR-Cas9技術(shù)還被用于提高蘋果的抗性，由Erwinia amylovora細菌引起的火疫病是商業(yè)蘋果園的主要病害之一。通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)敲除嘎啦和金美中的類激酶受體DIPM 4，可顯著降低火疫病的易感性，編輯過的植株中壞死組織減少了50%［86］。2023年，研究報道了國產(chǎn)蘋果利用CRISPR-Cas9編輯AGAMOUS-like基因［87］。

2.5葡萄

目前還沒有關(guān)于 TALENs或 ZFNs介導(dǎo)的葡萄基因編輯的報道，可能是由于許多栽培品種轉(zhuǎn)化困難。葡萄基因組有多達3500萬個靶位點可用，意味著有多達3500萬個目標(biāo)位點可用于基因編輯，這使得使用單個引導(dǎo)基因有可能同時針對多個性狀［88］。在‘霞多麗（chardonnay）中，使用CRISPR-Cas9 編輯 L-亞酮酸脫氫酶基因（L-IdnDH），基因編輯效率約為100%，這是一個很有希望的發(fā)現(xiàn)［89］。葡萄的基因編輯效率受到多種因素的影響，據(jù)報道，通過靶向編輯PDS基因獲得了白化葉片再生植株，與新出現(xiàn)的上部葉片相比，較低、較老的葉片中突變細胞的比例更高［90］，此外，GC含量較高的gRNA可以提高編輯效率［91］。2018年，Wang等［92］對葡萄轉(zhuǎn)錄因子VvWRKY52進行編輯，結(jié)果產(chǎn)生了15個雙等位基因品系和7個雜合品系，編輯效率高達64%。2021年，Ren等［93］證明VvU3/U6和UBQ2啟動子可以通過改善sgRNA的表達，顯著提高葡萄的編輯效率。此外，還使用此系統(tǒng)對TMT1和TMT2進行編輯，總體編輯效率高于10%，并導(dǎo)致糖分水平降低，這表明這2個基因在葡萄糖分積累中的作用。2023年，Ren等［94］使用CRISPR-LbCas12a編輯系統(tǒng)，在葡萄中敲除了TMT1和DFR1基因，此外，基因編輯技術(shù)還被應(yīng)用于研究葡萄的花青素積累。

2.6獼猴桃

目前，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)成功運用于獼猴桃的基因功能研究，加速了獼猴桃的育種進程。在中華獼猴桃中，CEN和CEN4的雙等位基因突變產(chǎn)生了快速開花的雄性植物，CEN4和SyGl的雙編輯植株產(chǎn)生了快速開花的雌雄同體植株，且雌蕊和雄蕊均可育［95］。此外，利用CRISPR-Cas9技術(shù)，發(fā)現(xiàn)AcNAC1基因的突變，能夠?qū)е芦J猴桃果實中的檸檬酸水平顯著下降，利用這些材料，通過自交選育有望獲得非轉(zhuǎn)基因的低酸獼猴桃［96］。編輯AcBFT2基因有可能減少植物休眠，而不會對開花產(chǎn)生不利影響，這為選育更適合氣候變化的品種提供可能［97］。AcFLCL基因編輯株系在4周后仍處于休眠狀態(tài)，說明AcFLCL的正確表達對獼猴桃腋芽的正常萌發(fā)至關(guān)重要［98］。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了一種比CRISPR-Cas9系統(tǒng)更適用于獼猴桃基因編輯的技術(shù)——Polycistronic tRNA-gRNA（PGT）-Cas9基因編輯技術(shù)［99］，相比與傳統(tǒng)CRISPR-Cas9系統(tǒng)其具有更高的突變效率。在獼猴桃毛狀根中利用PTG系統(tǒng)編輯已報道的CEN4基因和AeCBL3基因，編輯效率都可以達到50%以上，其中純合突變率達20%以上［100］。

2.7基因編輯技術(shù)在其他果樹中的應(yīng)用

除了上述幾種果樹之外，基因編輯技術(shù)也被應(yīng)用于其他多種果樹的遺傳改良。2022年，研究人員以CRISPR-Act3.0為基本骨架，在梨中構(gòu)建了基于CRISPR-dCas9的基因轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，對PybZIPa、PyMYB114、PyMYB10、PybHLH3、PyDFR、PyANS和PyUFGT這些花青苷生物合成的重要基因進行了單基因或多基因激活，證明它們能夠顯著促進花青苷積累［101］。在藍莓中，利用CRISPR-Cas技術(shù)通過敲除PDS基因［102］、gusA基因［103］來評估敲除效率。在可可中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化將CRISPR-Cas9組分導(dǎo)入可可葉片和子葉細胞，通過編輯防御反應(yīng)的抑制因子TcNPR3，增強對病原菌熱帶疫霉感染的抵抗力［104］。在石榴中利用CRISPR-Cas9技術(shù)靶向兩種udp依賴性糖基轉(zhuǎn)移酶：PgUGT84A23和PgUGT84A24，在ugt84a23 ugt84a24雙編輯系里中觀察到?jīng)]食子酸3-O和4-O糖苷的特異性積累［105］。2022年，歐洲板栗中也報道了CRISPR-Cas9技術(shù)能夠以RNP的方式對原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化［106］。CRISPR-Cas9介導(dǎo)的PDS基因編輯使核桃芽出現(xiàn)了白化現(xiàn)象［107］；WOX11的編輯則調(diào)控了核桃樹中的不定根和營養(yǎng)生長［108］。此外，最近許小瓊基于龍眼胚性愈傷組織體胚發(fā)生系統(tǒng)的CRISPR-Cas9技術(shù)編輯BX1基因，BX1表達量顯著下降（尚未發(fā)表）。

3存在問題與展望

3.1 存在問題

雖然基因編輯技術(shù)已經(jīng)在果樹研究中得到了廣泛的應(yīng)用，但是還存在著許多問題。1）木本植物的再生體系難建立，轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不夠完善。2）一些果樹遺傳背景不夠清楚，性狀復(fù)雜，控制性狀的基因和調(diào)控機制不夠明確。3）獲得無外源DNA的編輯植株比較困難。多數(shù)木本果樹存在原生質(zhì)體再生難等技術(shù)問題，難以采用RNP介導(dǎo)的Cas9和sgRNA的傳遞方法；傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9組分導(dǎo)入細胞往往借助DNA形式，常見的有將編碼Cas9和sgRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)，再培養(yǎng)成苗，如此獲得的編輯植株帶有外源DNA。4）基因編輯系統(tǒng)本身的局限性，編輯效率不夠高。目前最常用的CRISPR-Cas9系統(tǒng)雖然應(yīng)用很多，但該系統(tǒng)本身也存在一些局限性，比如PAM位點選擇有限、脫靶問題等。5）缺乏高質(zhì)量參考基因組。高質(zhì)量的基因組信息是設(shè)計精準(zhǔn)的sgRNA靶標(biāo)位點和評估脫靶效應(yīng)的重要遺傳基礎(chǔ)，目前多數(shù)果樹缺乏高質(zhì)量參考基因組。6）脫靶是基因編輯的一個常見問題，需要開發(fā)新的技術(shù)來提高果樹基因編輯的特異性。7）實現(xiàn)全基因組編輯的堿基編輯器技術(shù)有待于開發(fā)，才能真正做到分子設(shè)計育種。

8）利用CRISPR-Cas9技術(shù)進行大片段序列精準(zhǔn)敲入技術(shù)還有待于開發(fā)，該技術(shù)對于研究果樹基因功能有重要意義。

3.2 展望

隨著越來越多高質(zhì)量參考基因組的發(fā)表，比如香蕉［109］、蘋果［110］、獼猴桃［111］、龍眼［112，113］等，為基因編輯設(shè)計精準(zhǔn)的靶位點提供了高質(zhì)量的基因組信息，果樹的精準(zhǔn)分子設(shè)計育種將逐步實現(xiàn)。當(dāng)然，在后基因組時代，基因編輯系統(tǒng)也同樣需要進一步優(yōu)化：1）擴展基因編輯系統(tǒng)的多功能性，實現(xiàn)基因的敲除、敲入、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（基因敲低和轉(zhuǎn)錄激活、表觀遺傳修飾等）。2）開發(fā)大片段序列精準(zhǔn)敲入技術(shù)有助于研究果樹基因的功能。3）建立多基因編輯系統(tǒng)。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)宗媛教授團隊在小麥上實現(xiàn)同時編輯8個基因的編輯系統(tǒng)［114］，但在果樹上還有待于開發(fā)。4）開發(fā)堿基編輯工具，實現(xiàn)更精準(zhǔn)的基因編輯。要提高果樹基因編輯的特異性，特別是要開發(fā)實現(xiàn)全基因組編輯的堿基編輯器技術(shù)，才能真正做到果樹分子設(shè)計育種。5）開發(fā)無外源DNA的基因編輯技術(shù)，關(guān)鍵是要建立果樹的高效原生質(zhì)體再生體系。植物DNA-free的基因編輯方法包括瞬時表達CRISPR-Cas9質(zhì)粒DNA/RNA、體外轉(zhuǎn)錄CRISPR-Cas9以及由純化好的Cas9蛋白和sgRNAs組成的預(yù)組裝核糖核酸復(fù)合物RNP遞送，相比于前面二者，RNP具有簡單易行、成本低等優(yōu)點，不僅明顯降低脫靶效應(yīng)，還能成功避免了外源DNA片段整合到基因組中的潛在風(fēng)險。

CRISPR-Cas基因編輯是一種有效的全基因組篩選工具。構(gòu)建大型的CRISPR文庫已成為正向（forword）遺傳篩選的重要手段，它可以在基因組范圍內(nèi)高精度地引入突變［115］；依賴CRISPR的堿基編輯技術(shù)能夠鑒定具有單堿基分辨率的功能元件［116-117］。此外，CRISPR篩選可與單細胞測序相結(jié)合，為解析基因功能提供新的方法［118］。目前在番茄上已開發(fā)了全基因組CRISPR突變體文庫［119］。CRISPR突變體文庫的開發(fā)利用將成為果樹功能基因組學(xué)研究的有力手段，加速果樹的育種進程。

隨著AI技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)該考慮將基因編輯技術(shù)與AI相結(jié)合：堿基編輯技術(shù)的出現(xiàn)讓基因編輯變得更加可操作性，但編輯部位堿基的準(zhǔn)確性，以及編輯部位上下文序列對編輯的影響，一直難以預(yù)測。2021年，蘇黎世大學(xué)建立了一種深度學(xué)習(xí)算法BE-DICT，該算法能夠高精度地預(yù)測堿基編輯結(jié)果［120］。同年，研究人員開發(fā)了一個C-to-G堿基編輯器，其修改的目標(biāo)序列的上下文可通過機器學(xué)習(xí)方法進行預(yù)測；同時還開發(fā)了一個深度學(xué)習(xí)模型，可以準(zhǔn)確預(yù)測具有特定序列上下文的目標(biāo)位點的OPTI-CGBE編輯系統(tǒng)，該方法有助于開發(fā)果樹的堿基編輯器［121］。

參考文獻：

［1］Takatsuji H. Zinc-finger proteins： the classical zinc finger emerges in contemporary plant science ［J］. Plant Molecular Biology，1999，39（6）： 1073-1078.

［2］Li T，Huang S，Jiang WZ，et al. TAL nucleases （TALNs）： hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain ［J］. Nucleic Acids Research，2011，39（1）： 359-372.

［3］Bortesi L，F(xiàn)ischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond ［J］. Biotechnology Advances，2015，33（1）： 41-52.

［4］Kim YG，Cha J，Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes： zinc finger fusions to Fok I cleavage domain ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93（3）： 1156-1160.

［5］Jo YI.，Kim H，Ramakrishna S. Recent developments and clinical studies utilizing engineered zinc finger nuclease technology ［J］. Cellular and Molecular Life Sciences，2015，72（20）： 3819-3830.

［6］Pavletich NP，Pabo CO. Zinc finger-DNA recognition： crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A ［J］. Science，1991，252（5007）： 809.

［7］Zhang F，Voytas DF. Targeted mutagenesis in Arabidopsis using zinc-finger nucleases ［J］. Methods in Molecular Biology，2011，701： 167-177.

［8］Shukla VK，Doyon Y，Miller JC，et al. Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases ［J］. Nature，2009，459（7245）：437-441.

［9］Becker S，Boch J. TALE and TALEN genome editing technologies ［J］. Gene and Genome Editing，2021，2： 100007.

［10］Szurek B，Rossier O，Hause G，et al. Type III-dependent translocation of the Xanthomonas AvrBs3 protein into the plant cell ［J］. Molecular Microbiology，2002，46（1）： 13-23.

［11］Kay S，Hahn S，Marois E，et al. Bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator ［J］. Science，2007，318（5850）： 648-651.

［12］Gao H，Wu X，Chai J，et al. Crystal structure of a TALE protein reveals an extended N-terminal DNA binding region ［J］. Cell Research，2012，22（12）： 1716-1720.

［13］Ackerveken GVD，Marois E，Bonas U. Recognition of the bacterial avirulence protein AvrBs3 occurs inside the host plant cell ［J］. Cell，1996，87（7）： 1307-1316.

［14］Zhu W，Yang B，Chittoor JM，et al. AvrXa10 contains an acidic transcriptional activation domain in the functionally conserved C terminus ［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions，1998，11（8）： 824-832.

［15］Yuan M，Ke Y，Huang R，et al. A host basal transcription factor is a key component for infection of rice by TALE-carrying bacteria ［J］. eLife，2016，5： e19605.

［16］Sakuma T，Ochiai H，Kaneko T，et al. Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity ［J］. Scientific Reports，2013，3： 3379.

［17］Nemudryi AA，Valetdinova KR，Medvedev SP，et al. TALEN and CRISPR/Cas genome editing systems： tools of discovery ［J］. Acta Naturae，2014，6（3）： 19-40.

［18］Ishino Y，Shinagawa H，Makino K，et al. Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli，and identification of the gene product ［J］. Journal of Bacteriology，1987，169（12）： 5429-5433.

［19］Barrangou R，F(xiàn)remaux C，Deveau H，et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes ［J］. Science，2007，315（5819）： 1709-1712.

［20］Marraffini LA，Sontheimer EJ. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in Staphylococci by targeting DNA ［J］. Science，2008，322（5909）： 1843-1845.

［21］Makarova KS，Wolf YI，Iranzo J，et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems： a burst of class 2 and derived variants ［J］. Nature Reviews Microbiology，2020，18（2）： 67-83.

［22］Knott GJ，Doudna JA. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering ［J］. Science，2018，361： 866-869.

［23］Marraffini LA.，Sontheimer EJ. CRISPR interference： RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea ［J］. Nature Reviews Genetics，2010，11（3）： 181-190.

［24］Zetsche B，Gootenberg JS，Abudayyeh OO，et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system ［J］. Cell，2015，163（3）： 759-771.

［25］Abudayyeh OO，Gootenberg JS，Konermann S，et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector ［J］. Science，2016，353（6299）： aaf5573.

［26］East-Seletsky A，O'Connell MR，Knight SC，et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection ［J］. Nature，2016，538（7624）： 270-273.

［27］Jinek M，Chylinski K，F(xiàn)onfara I，et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity ［J］. Science，2012，337（6096）： 816-821.

［28］O'Connell MR，Oakes BL，Sternberg SH，et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9 ［J］. Nature，2014，516（7530）：263-266.

［29］Kim S，Kim D，Cho S，et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins ［J］. Genome Research，2014，24（6）： 1012-1019.

［30］Xu，X.，Chemparathy，A.，Zeng，L.，et al. Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing ［J］. Molecular Cell，2021，81（20）： 4333-4345.

［31］Bravo JPK，Liu MS，Hibshman GN，et al. Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR/Cas9 ［J］. Nature，2022，603（7900）：343–347.

［32］Charpentier E，Richter H，van der Oost J，et al. Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity ［J］. Fems Microbiology Reviews，2015，（3）： 428-441.

［33］Deltcheva E，Chylinski K，Sharma CM，et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III ［J］. Nature，2011，471（7340）： 602-607.

［34］Fonfara I，Richter H，BratoviM，et al. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA ［J］. Nature，2016，532（7600）： 517.

［35］Barrangou R，Horvath P. A decade of discovery： CRISPR functions and applications ［J］. Nature microbiology，2017，2： 17092.

［36］Maresca M，Lin VG，Guo N，et al. Obligate ligation-gated recombination （ObLiGaRe）： Custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining ［J］. Genome Research，2013，23（3）： 539-546.

［37］Gardner MJ，Shallom SJ，Carlton JM，et al. Sequence of Plasmodium falciparum chromosomes 2，10，11 and 14 ［J］. Nature，2002，419（6906）： 531-534.

［38］Komor AC，Kim YB，Packer MS，et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage ［J］. Nature，2016，533（7603）： 420-424.

［39］Gaudelli NM，Komor AC，Rees HA，et al. Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNA cleavage ［J］. Nature，2017，551（7681）： 464-471.

［40］Kurt IC，Zhou R，Iyer S，et al. CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells ［J］. Nature Biotechnology，2021，39（1）： 41-46.

［41］Zhao D，Li J，Li S，et al. Glycosylase base editors enable C-to-A and C-to-G base changes ［J］. Nature Biotechnology，2021，39（1）： 35-40.

［42］Brooks C，Nekrasov V，Lippman ZB，et al. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system ［J］. Plant Physiology，2014，166（3）： 1292-1297.

［43］D'Ambrosio C，Stigliani AL，Giorio G. CRISPR/Cas9 editing of carotenoid genes in tomato ［J］. Transgenic Research，2018，27（4）： 367-378.

［44］Li R，Zhang L，Wang L，et al. Reduction of tomato-plant chilling tolerance by CRISPR-Cas9-mediated SlCBF1 mutagenesis ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2018，66（34）： 9042-9051.

［45］Yang Q，Wan X，Wang J，et al. The loss of function of HEL，which encodes a cellulose synthase interactive protein，causes helical and vine-like growth of tomato ［J］. Horticulture Research，2020，7（1）： 180.

［46］ermák T，Baltes NJ，egan R，et al. High-frequency，precise modification of the tomato genome ［J］. Genome Biology，2015，16： 232.

［47］Li R，Li R，Li X，et al. Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of γ-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum ［J］. Plant Biotechnol Journal，2018，16（2）： 415-427.

［48］Nonaka S，Arai C，Takayama M，et al. Efficient increase of -aminobutyric acid （GABA） content in tomato fruits by targeted mutagenesis ［J］. Scientific Reports，2017，7（1）： 7057.

［49］Li X，Wang Y，Chen S，et al. Lycopene is enriched in tomato fruit by CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing ［J］. Frontiers in Plant Science，2018，9： 559.

［50］Nekrasov V，Wang C，Win J，et al. Rapid generation of a transgene-free powdery mildew resistant tomato by genome deletion ［J］. Scientific Reports，2017，7（1）：482.

［51］Ortigosa A，Gimenez-Ibanez S，Leonhardt N，et al. Design of a bacterial speck resistant tomato by CRISPR/Cas9-mediated editing of SlJAZ2 ［J］. Plant Biotechnology Journal，2018，17（3）： 665-673.

［52］Tashkandi M，Ali Z，Aljedaani F，et al. Engineering resistance against tomato yellow leaf curl virus via the CRISPR/Cas9 system in tomato ［J］. Plant Signaling & Behavior，2018，13（10）： e1525996.

［53］Jeon JE，Kim JG，F(xiàn)ischer CR，et al. Pathogen-responsive gene cluster for highly modified fatty acids in tomato ［J］. Cell，2020，180（1）： 176-187.e19.

［54］Li T，YangX，Yu Y，et al. Domestication of wild tomato is accelerated by genome editing ［J］. Nature Biotechnology，2018，36（12）： 1161-1163.

［55］Zsgn A，ermák T，Naves ER，et al. De novo domestication of wild tomato using genome editing ［J］. Nature Biotechnology，2018，36： 1211-1216.

［56］Tomlinson L，Yang Y，Emenecker R，et al. Using CRISPR/Cas9 genome editing in tomato to create a gibberellin-responsive dominant dwarf DELLA allele ［J］. Plant Biotechnol Journal，2019，17（1）： 132-140.

［57］Danilo B，Perrot L，Mara K，et al. Efficient and transgene-free gene targeting using Agrobacterium-mediated delivery of the CRISPR/Cas9 system in tomato ［J］. Plant Cell Reports，2019，38（4）： 459-462.

［58］Veillet F，Perrot L，Chauvin L，et al. Transgene-free genome editing in tomato and potato plants using Agrobacterium-mediated delivery of a CRISPR/Cas9 cytidine base editor ［J］. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（2）： 402.

［59］Zhu Q，Deng L，Chen J，et al. Redesigning the tomato fruit shape for mechanized production ［J］. Nature Plants，2023，9（10）： 1659-1674.

［60］Waltz E. GABA-enriched tomato is first CRISPR-edited food to enter market ［J］. Nature Biotechnology，2022，40（1）： 9-11.

［61］Li J，Scarano A，Gonzalez NM，et al. Biofortified tomatoes provide a new route to vitamin D sufficiency ［J］. Nature Plants，2022，8（6）： 611-616.

［62］Jia H，Wang N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA ［J］. PLoS One，2014，9（4）： e93806.

［63］Zhu C，Zheng X，Huang Y，et al. Genome sequencing and CRISPR/Cas9 gene editing of an early flowering mini citrus （Fortunella hindsii） ［J］. Plant Biotechnology Journal，2019，17（11）： 2199–2210.

［64］Jia H，Orbovi V，Wang N. CRISPR-LbCas12a-mediated modification of citrus ［J］. Plant Biotechnol Journal，2019，17（10）： 1928-1937.

［65］Wang L，Chen S，Peng A，et al. CRISPR/Cas9-mediated editing of CsWRKY22 reduces susceptibility to Xanthomonas citri subsp. citri in Wanjincheng orange （Citrus sinensis （L.） Osbeck） ［J］. Plant Biotechnology Reports，2019，13（5）： 501-510.

［66］Yang W，Ren J，Liu W，et al. An efficient transient gene expression system for protein subcellular localization assay and genome editing in citrus protoplasts ［J］. Horticultural Plant Journal，2023，9（3）： 425-436.

［67］Xu Y，Zhang L，Lu L，et al. An efficient CRISPR/Cas9 system for simultaneous editing two target sites in Fortunella hindsii ［J］. Horticulture Research，2022，9： uhac064.

［68］Su H，Wang Y，Xu J，et al. Generation of the transgene-free canker-resistant Citrus sinensis using Cas12a/crRNA ribonucleoprotein in the T0 generation ［J］. Nature Communications，2023，14（1）： 3957.

［69］Huang X，Jia H，Xu J，et al. Efficient transgene-free genome editing in plants in the T0 generation based on a co-editing strategy ［J/OL］. BioRxiv，2023，https：//doi.org/10.1101/2023.03.02.530790.

［70］Huang X，Wang Y，Wang N. Base editors for citrus gene editing ［J］. Frontiers in Genome Editing，2022，4： 852867.

［71］Huang Y，He J，Xu Y，et al. Pangenome analysis provides insight into the evolution of the orange subfamily and a key gene for citric acid accumulation in citrus fruits ［J］. Nature Genetics，2023，55（11）： 1964-1975.

［72］Wang H，Ren J，Zhou S，et al. Molecular regulation of oil gland development and biosynthesis of essential oils in Citrus spp. ［J］. Science，2024，383（6683）： 659-666.

［73］胡春華，鄧貴明，孫曉玄，等. 香蕉CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的建立［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（7）： 1294-1301.

［74］Tripathi JN，Ntui VO，Shah T，et al. CRISPR/Cas9-mediated editing of DMR6 orthologue in banana （Musa spp.） confers enhanced resistance to bacterial disease ［J］. Plant Biotechnology Journal，2021，19（7）： 1291-1293.

［75］Hu C，Liu F，Sheng O，et al. Efficient and transgene-free genome editing in banana using a REG-2promoter-driven gene-deletion system ［J］. Molecular Horticulture，2023，3（1）： 16.

［76］Ntui VO，Tripathi JN，Shah T，et al. Targeted knockout of early nodulin-like 3 （MusaENODL3） gene in banana reveals its function in resistance to Xanthomonas wilt disease ［J］. Plant Biotechnology Journal，2023： 1-12.

［77］Macaulay T. Browning bananas under threat as Philippines approves gene-edited version.［EB/OL］. 2023［2024-01-02］. https：//thenextweb.com/news/phillipines-approves-gene-editing-browning-bananas-tropic-biosciences.

［78］Xing S，Jia M，Wei L，et al. CRISPR/Cas9-introduced single and multiple mutagenesis in strawberry ［J］. Journal of Genetics and Genomics，2018，45（12）： 685-687.

［79］Zhou J，Wang G，Liu Z. Efficient genome editing of wild strawberry genes，vector development and validation ［J］. Plant Biotechnol Journal，2018，16（11）： 1868-1877.

［80］Martín-Pizarro C，Trivio JC，Posé D. Functional analysis of the TM6 MADS-box gene in the octoploid strawberry by CRISPR/Cas9-directed mutagenesis ［J］. Journal of Experimental Botany，2019，70（3）： 885-895.

［81］López-Casado G，Sánchez-Raya C，Ric-Varas PD，et al. CRISPR/Cas9 editing of the polygalacturonase FaPG1 gene improves strawberry fruit firmness ［J］. Horticulture Research，2023，10（3）： uhad011.

［82］AridiR. Using CRISPR technology，scientists plan to grow a more durable strawberry［EB/OL］. 2021［2024-01-02］. https：//www.smithsonianmag.com/smart-news/using-crispr-technology-scientists-plan-to-grow-a-more-durable-strawberry-180978981/.

［83］Nishitani C，Hirai N，Komori S，et al. Efficient genome editing in apple using a CRISPR/Cas9 system ［J］. Scientific Reports，2016，6：31481.

［84］Osakabe Y，Liang Z，Ren C，et al. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in apple and grapevine ［J］. Nature Protocols，2018，13（12），2844–2863.

［85］Charrier A，Vergne E，Dousset N，et al. Efficient targeted mutagenesis in apple and first time edition of pear using the CRISPR-Cas9 system ［J］. Frontiers in Plant Science，2019，10： 40.

［86］Pompili V，Dalla Costa L，Piazza S，et al. Reduced fire blight susceptibility in apple cultivars using a high-efficiency CRISPR/Cas9-FLP/FRT-based gene editing system ［J］. Plant Biotechnol Journal，2020，18（3）： 845-858.

［87］Jacobson S，Bondarchuk N，Nguyen TA，et al. Apple CRISPR-Cas9-A recipe for successful targeting of AGAMOUS-like genes in domestic apple ［J］. Plants，2023，12（21）： 3693.

［88］Wang Y，Liu X，Ren C，et al. Identification of genomic sites for CRISPR/Cas9-based genome editing in the Vitis vinifera genome ［J］. BMC Plant Biology，2016，16（1）： 96.

［89］Ren C，Liu X，Zhang Z，et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in Chardonnay （Vitis vinifera L.） ［J］. Scientific Reports，2016，6： 32289.

［90］Nakajima I，Ban Y，Azuma A，et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in grape ［J］. PLoS One，2017，12（5）： e0177966.

［91］Ren F，Ren C，Zhang Z，et al. Efficiency optimization of CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in grape ［J］. Frontiers in Plant Science，2019，10：612.

［92］Wang X，Tu M，Wang D，et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in grape in the first generation ［J］. Plant Biotechnology Journal，2017，16（4）：844–855.

［93］Ren C，Liu Y，Guo Y，et al. Optimizing the CRISPR/Cas9 system for genome editing in grape by using grape promoters ［J］. Horticulture Research，2021，8（1）： 52.

［94］Ren C，Gathunga EK，Li X，et al. Efficient genome editing in grapevine using CRISPR/LbCas12a system ［J］. Molecular Horticulture，2023，3（1）： 21.

［95］Varkonyi-Gasic E，Wang T，Cooney J，et al. Shy Girl，a kiwifruit suppressor of feminization，restricts gynoecium development via regulation of cytokinin metabolism and signalling ［J］. New Phytologist，2021，230（4）： 1461–1475.

［96］Fu BL，Wang WQ，Li X，et al. A dramatic decline in fruit citrate induced by mutagenesis of a NAC transcription factor，AcNAC1 ［J］. Plant Biotechnology Journal，2023，21（8）： 1695-1706.

［97］Herath D，Voogd C，Mayo-Smith M，et al. CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis of kiwifruit BFT genes results in an evergrowing but not early flowering phenotype ［J］. Plant Biotechnology Journal，2022，20（11）： 2064-2076.

［98］Voogd C，Brian LA，Wu R，et al. A MADS-box gene with similarity to FLC is induced by cold and correlated with epigenetic changes to control budbreak in kiwifruit ［J］.New Phytologist，2022，233（5）：2111-2126.

［99］Wang Z，Wang S，Li D，et al. Optimized paired-sgRNA/Cas9 cloning and expression cassette triggers high-efficiency multiplex genome editing in kiwifruit ［J］. Plant Biotechnology Journal，2018，16（8）： 1424-1433.

［100］Li P，Zhang Y，Liang J，et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated marker-free transformation and gene editing system revealed that AeCBL3 mediates the formation of calcium oxalate crystal in kiwifruit ［J］. Molecular Horticulture，2024，4（1）： 1.

［101］Ming M，Long H，Ye Z，et al. Highly efficient CRISPR systems for loss-of-function and gain-of-function research in pear calli ［J］. Horticulture Research，2022，9： uhac148.

［102］Vaia G，Pavese V，Moglia A，et al. Knockout of phytoene desaturase gene using CRISPR/Cas9 in highbush blueberry ［J］. Frontiers in Plant Science，2022，13： 1074541.

［103］Han X，Yang Y，Han X，et al. CRISPR Cas9- and Cas12a-mediated gusA editing in transgenic blueberry ［J］. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2022，148（2）： 217-229.

［104］Fister AS，Landherr L，Maximova SN，et al. Transient expression of CRISPR/Cas9 machinery targeting TcNPR3 enhances defense response in Theobromacacao［J］. Frontiers in Plant Science，2018，9： 268.

［105］Chang L，Wu S，Tian L. Effective genome editing and identification of a regiospecific gallic acid 4-O-glycosyltransferase in pomegranate（Punica granatum L.） ［J］. Horticulture Research，2019，6： 123.

［106］Pavese V，Moglia A，Abbà S，et al. First report on genome editing via ribonucleoprotein （RNP） in Castanea sativa Mill［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（10）： 5762.

［107］Walawage SL，Zaini PA，Mubarik MS，et al. Deploying genome editing tools for dissecting the biology of nut trees ［J］. Frontiers in Sustainable Food Systems，2019，3：100.

［108］Chang Y，Song X，Zhang Q，et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated gene editing of JrWOX11 manipulated adventitious rooting and vegetative growth in a nut tree species of walnut ［J］. Scientia Horticulturae，2022，303：111199.

［109］Li X，Yu S，Cheng Z，et al. Origin and evolution of the triploid cultivated banana genome ［J］. Nature Genetics，2024，56（1）： 136-142.

［110］Zhang L，Hu J，Han X，et al. A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour ［J］. Nature Communications，2019，10（1）： 1494.

［111］Huang S，Ding J，Deng D，et al. Draft genome of the kiwifruit Actinidia chinensis ［J］. Nature Communications，2013，4： 2640.

［112］Lin Y，Min J，Lai R，et al. Genome-wide sequencing of longan （Dimocarpus longan Lour.） provides insights into molecular basis of its polyphenol-rich characteristics ［J］. GigaScience，2017，6（5）： 1-14.

［113］Chen Y，Xie D，Ma X，et al. Genome-wide high-throughput chromosome conformation capture analysis reveals hierarchical chromatin interactions during early somatic embryogenesis ［J］. Plant Physiology，2023，193（1）： 555-577.

［114］Ni P，Zhao Y，Zhou X，et al. Efficient and versatile multiplex prime editing in hexaploid wheat ［J］. Genome Biology，2023，24（1）： 156.

［115］Smith I，Greenside G，Natoli T，et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map ［J］. PLoS Biology，2017，15（11）： e2003213.

［116］Cuella-Martin R，Hayward SB，F(xiàn)an X，et al. Functional interrogation of DNA damage response variants with base editing screens ［J］. Cell，2021，184（4）： 1081-1097.

［117］Hanna RE，Hegde M，F(xiàn)agre CR，et al. Massively parallel assessment of human variants with base editor screen ［J］. Cell，2021，184（4）： 1064-1080.

［118］Replogle JM，Norman TM，Xu A，et al. Combinatorial single-cell CRISPR screens by direct guide RNA capture and targeted sequencing ［J］. Nature Biotechnology，2020，38（8）： 954-961.

［119］Jacobs TB，Zhang N，Patel D，et al. Generation of a collection of mutant tomato lines using pooled CRISPR libraries ［J］. Plant Physiology，2017，174（4）： 2023-2037.

［120］Marquart KF，Allam A，Janjuha S，et al. Predicting base editing outcomes with an attention-based deep learning algorithm trained on high-throughput target library screens ［J］. Nature Communications，2021，12（1）： 5114.

［121］Yuan T，Yan N，F(xiàn)ei T，et al. Optimization of C-to-G base editors with sequence context preference predictable by machine learning methods ［J］. Nature Communications，2021，12（1）： 4902.

（責(zé)任編輯：賴瑞聯(lián)）