桑黃菌母種培養(yǎng)基配方優(yōu)化研究

連燕萍 周群 柯麗娜 趙光輝 吳漢瓊 吳振強(qiáng) 陳天賜 劉俊斌 袁濱

收稿日期：2023-12-23

基金項(xiàng)目：財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS—20）

作者簡(jiǎn)介：連燕萍（1991-），女，助理研究員，主要從事食藥用菌育種和栽培研究工作，E-mail：657280841@qq.com

摘要：【目的】為培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)的桑黃菌，篩選適宜的母種培養(yǎng)基配方?！痉椒ā繉⑸｜S菌種接種到不同配方培養(yǎng)基進(jìn)行初篩、復(fù)篩，通過(guò)形態(tài)比較，從菌絲長(zhǎng)勢(shì)及長(zhǎng)速等方面綜合考慮，選出最優(yōu)母種培養(yǎng)基配方。【結(jié)果】初篩結(jié)果表明，選擇桑黃菌絲生長(zhǎng)快且濃密、不易老化、不吐黃水的蔗糖和葡萄糖為較佳碳源；選擇生長(zhǎng)快且不易老化、長(zhǎng)勢(shì)好、不吐黃水的蛋白胨和胰蛋白胨作為較佳氮源。復(fù)篩結(jié)果表明，以1/4葡萄糖 + 3/4蔗糖為配方的母種培養(yǎng)基，桑黃菌絲的長(zhǎng)勢(shì)最好、濃密、長(zhǎng)速較快。【結(jié)論】生產(chǎn)上推薦桑黃菌母種培養(yǎng)基采用配方為1/4葡萄糖+ 3/4蔗糖，即馬鈴薯200 g、葡萄糖5 g、蔗糖15 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。

關(guān)鍵詞：桑黃；篩選；母種培養(yǎng)基；配方

中圖分類號(hào)：S567.39? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2095-5774（2024）01-0071-05

Study on Formula Optimization of Mother Culture Medium of Sanghuangporus

Lian Yanping1，Zhou Qun2，Ke Lina1，Zhao Guanghui3，Wu Hanqiong3，Wu Zhenqiang1，

Cheng Tianci1，Liu Junbin1，Yuan Bin1

（1 Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences，Zhangzhou，F(xiàn)ujian 363005，China;

2 Zhangzhou Meteorological Bureau，Zhangzhou，F(xiàn)ujian 363000，China;

3 Fuzhou Institute of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350014，China）

Abstract：［Objective］To screen the best mother medium of Sanghuang for cultivating high-quality Sanghuangporus. ［Method］Sanghuangporus strain was inoculated into the medium with different formulas for preliminary screening and re-screening. Through morphological comparison，the optimal mother culture medium formula was selected from the aspects of hypha growth vigor，growth rate and others. ［Result］The results of preliminary screening showed that sucrose and glucose were selected as the best carbon sources with fast growth，not easy to aging，no yellow water，and dense growth. Peptone and tryptone were selected as the best nitrogen source with fast growth，not easy to aging，good growth vigor and no yellow water. The results of re-screening showed that the hypha had good growth vigor，dense and fast growth when formula of 1/4 glucose + 3/4 sucrose was used. ［Conclusion］The formula of 1/4 glucose + 3/4 sucrose is recommended in production，containing 200 g potato，5 g glucose，15 g sucrose，20 g agar and 1 000 mL water.

Key words：Sanghuangporus；Screening；Mother culture medium；Formulation

桑黃（Sanghuangporus Sanghuang），又名桑臣、桑耳，屬擔(dān)子菌亞門(mén)（ Basidiomycotina） ，傘菌綱（Agaricomycetes），繡革孔菌目（Hymenochaetales），銹革孔菌科 （ Hymenochaeyaceae ） ，桑黃屬（Sanghuangporus）［1］。桑黃主要寄生于桑樹(shù)、楊樹(shù)、松樹(shù)、白樺樹(shù)的枝干上，在我國(guó)主要分布黑龍江、吉林、臺(tái)灣、廣東、云南、四川、西藏等地［2］。桑黃含有香豆素類活性物質(zhì)、多種酚類、黃酮、多糖、生物堿等眾多有效成分物質(zhì)［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，桑黃具有超過(guò)15種的藥理學(xué)功能，包括降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、抑菌消炎、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)癌癥患者的正常細(xì)胞不被損傷等［4-6］?！吨兴幋筠o典》有關(guān)于桑黃的收錄，寫(xiě)明可以醫(yī)治痢疾、冷汗、脫肛、閉經(jīng)、瀉血、血崩、淋病、崩漏帶下、臍腹?jié)吹燃膊。?］。桑黃的價(jià)格高昂，是藥制劑與保健品行業(yè)研究與開(kāi)發(fā)的藥用真菌藥材，具有廣闊的市場(chǎng)前景。目前野生桑黃形成子實(shí)體周期很長(zhǎng)，子實(shí)體在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，需要氧氣、光照、碳源、氮源、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)水分的需求量較高，我國(guó)野生桑黃分布雖廣，產(chǎn)量卻很少，僅零星生長(zhǎng)于個(gè)別深山老林中，隨著市場(chǎng)對(duì)桑黃的需求增加，野生桑黃被過(guò)度采摘，資源越來(lái)越少，因此，桑黃的栽培就顯得十分重要。已有研究表明，利用固體培養(yǎng)法獲得的桑黃菌絲有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景，培養(yǎng)基可為桑黃菌絲生長(zhǎng)繁殖和合成代謝產(chǎn)物提供營(yíng)養(yǎng)，不同培養(yǎng)基配比也會(huì)影響桑黃菌絲體的產(chǎn)量及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。前人更多的是對(duì)桑黃的液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了相關(guān)研究，以期得到更多活性物質(zhì)。蔣寧等［8］以菌絲體生物量、粗多糖產(chǎn)量和黃酮產(chǎn)量為指標(biāo)，篩選出鮑氏針層孔菌最適氮源、最適碳源為玉米粉、豆粕、蔗糖。楊菁等［9］研究表明，桑黃的最適氮源是蛋白胨。Hwang HJ等［10］研究了溫度、碳源、氮源等不同因素對(duì)桑黃菌絲體和胞外多糖產(chǎn)量的影響，得到最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為玉米粉。目前桑黃培養(yǎng)基的配方還處于優(yōu)化階段，即使是同屬不同種、不同來(lái)源的桑黃菌由于環(huán)境及種性的不同，所需的培養(yǎng)基條件也存在明顯差異，故開(kāi)展桑黃菌種培養(yǎng)條件研究，明確培養(yǎng)特性，對(duì)桑黃菌株開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。本研究擬通過(guò)對(duì)‘鮑魚(yú)桑黃不同母種培養(yǎng)基配方的篩選，選出適宜的母種培養(yǎng)基配方，為鮑魚(yú)桑黃的人工栽培奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的鮑魚(yú)桑黃菌種來(lái)自漳州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所食用菌研究室種質(zhì)資源庫(kù)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 碳源篩選試驗(yàn)

將蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖等4種碳源按配方用量分別加入，制作母種培養(yǎng)基，即：碳源20 g，蛋白胨2 g，硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。培養(yǎng)基上接種供試菌株，于25℃恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行碳源篩選試驗(yàn)，觀察不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2.2 氮源篩選試驗(yàn)

將蛋白胨、酵母浸膏、胰蛋白胨、玉米粉、麩皮等5種氮源按配方用量分別加入培養(yǎng)基中，進(jìn)行氮源篩選試驗(yàn)，即：氮源2 g，葡萄糖20 g，硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。母種培養(yǎng)基上接種供試菌株，于25℃恒溫培養(yǎng)，觀察不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響［11，12］，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2.3 復(fù)合篩選試驗(yàn)

通過(guò)培養(yǎng)基碳氮源試驗(yàn)篩選得到最佳碳源和氮源進(jìn)行復(fù)合設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)5個(gè)培養(yǎng)基優(yōu)化配方。觀察不同配方對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的影響。

2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

比較各配方培養(yǎng)基中菌絲濃密度，評(píng)價(jià)菌絲長(zhǎng)勢(shì)以“+”表示等級(jí)和梯度；觀察記錄菌絲生長(zhǎng)速度，以培養(yǎng)皿中菌落直徑大小作為菌絲生長(zhǎng)量指標(biāo)，計(jì)算菌絲日生長(zhǎng)速度［13-15］，V=R/2/D，其中R為菌落直徑（mm），D為培養(yǎng)天數(shù)（d）。試驗(yàn)結(jié)果采用 SPSS 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)基碳源篩選

從表1可得，桑黃菌絲在以葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖為碳源的培養(yǎng)基中都可正常生長(zhǎng)，但菌絲的生長(zhǎng)情況有一定差異。其中以蔗糖為碳源的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲濃密，顏色白，且無(wú)吐黃水現(xiàn)象；生長(zhǎng)速度最快，為4.55 mm/d，顯著高于其他3種碳源。以葡萄糖為碳源的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)次之。以乳糖為碳源的長(zhǎng)勢(shì)最差，菌絲生長(zhǎng)速度最慢，極顯著低于其他3種碳源。綜合分析，4種碳源中，加入蔗糖的培養(yǎng)基具有菌絲生長(zhǎng)速度最快、不易老化、不吐黃水等優(yōu)點(diǎn)，加入葡萄糖的培養(yǎng)基在菌絲的長(zhǎng)勢(shì)、濃密度和顏色比果糖、乳糖的表現(xiàn)更優(yōu)，因此選擇蔗糖和葡萄糖作為復(fù)篩碳源。

3.2 不同培養(yǎng)基氮源篩選

從表2可得，桑黃菌絲在以蛋白胨、酵母浸膏、胰蛋白胨、玉米粉、麩皮為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)差異較大。其中以玉米粉為氮源的培養(yǎng)基配方，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲濃密，生長(zhǎng)速度最快，為3.87 mm/d，但菌絲顏色黃，吐黃水和老化現(xiàn)象嚴(yán)重，這可能與玉米粉中含有能促進(jìn)菌絲體生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子有關(guān)［16］。在以酵母浸膏、胰蛋白胨、麩皮為氮源的培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)較快，菌絲較密，菌絲顏色均為黃色或微黃。在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)較快，菌絲密，且菌絲顏色白色，生長(zhǎng)速度較快。綜合分析，在5種氮源中，玉米粉培養(yǎng)基的桑黃菌絲雖生長(zhǎng)最快但吐黃水、老化現(xiàn)象嚴(yán)重；蛋白胨里的菌絲生長(zhǎng)快、顏色白且不吐黃水；胰蛋白胨的菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，顏色微黃，且不吐黃水，不易老化，因此選擇蛋白胨和胰蛋白胨作為復(fù)篩氮源。

3.4? 復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)初篩試驗(yàn)所得，選擇蔗糖、葡萄糖作為復(fù)篩碳源，及蛋白胨、胰蛋白胨作為復(fù)篩氮源，設(shè)計(jì)5個(gè)優(yōu)化的培養(yǎng)基處理進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)，分別為：1/4葡萄糖（5 g）+ 3/4蔗糖（15 g），1/2葡萄糖（10 g）+ 1/2蔗糖（10 g），3/4葡萄糖（15 g）

+ 1/4蔗糖（5 g），蛋白胨（2 g）+蔗糖（20 g），胰蛋白胨（2 g）+葡萄糖（20 g），各自再加入馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，以常規(guī)PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。

如表3所示，復(fù)篩的復(fù)合碳源培養(yǎng)基與初篩培養(yǎng)基相比，菌絲表現(xiàn)更佳，不同配方菌絲表現(xiàn)有一定的差異，其中配方1/4葡萄糖+3/4蔗糖的桑黃菌絲表現(xiàn)最優(yōu)，其菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好、濃密、長(zhǎng)速較快。同等條件下，復(fù)篩的復(fù)合碳氮源試驗(yàn)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)，菌絲濃密，但菌絲長(zhǎng)速較慢。因此，綜合考慮桑黃菌絲生長(zhǎng)情況和生產(chǎn)效率等因素，在生產(chǎn)上可以選用1/4葡萄糖+ 3/4蔗糖的配方，即馬鈴薯200 g、葡萄糖5 g、蔗糖15 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。

4 討論與結(jié)論

桑黃是近幾年新興的珍貴藥用菌，培養(yǎng)基作為菌種生長(zhǎng)發(fā)育或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合營(yíng)養(yǎng)料，包含多種營(yíng)養(yǎng)要素，不一樣的碳源和氮源對(duì)桑黃菌絲繁育會(huì)有影響［17］。碳源配比過(guò)高，菌絲生長(zhǎng)速度變慢，氮源配比過(guò)低，菌絲易變黃。對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源、氮源篩選試驗(yàn)是開(kāi)展菌種繁殖和開(kāi)發(fā)利用菌絲的基礎(chǔ)工作。試驗(yàn)結(jié)果表明，在供試的4種碳源中，添加不同碳源的桑黃菌絲生長(zhǎng)情況差異明顯，最佳碳源為蔗糖和葡萄糖，這與寧云山等人研究結(jié)果一致［18］。不同氮源對(duì)桑黃菌絲長(zhǎng)速和長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)有所差異［19］，在試驗(yàn)選擇的5種氮源中，玉米粉長(zhǎng)速最快但老化嚴(yán)重，生長(zhǎng)快且菌絲顏色白的是蛋白胨。復(fù)篩試驗(yàn)表明，與有碳源組相比，氮源組的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?、長(zhǎng)速變慢，說(shuō)明桑黃菌在繁殖發(fā)育階段需要的碳源比氮源多，也從另一方面反應(yīng)了桑黃菌在菌絲繁殖生長(zhǎng)階段同比碳源物質(zhì)的酶大于同化氮源的酶［20］。唐琳［21］研究表明，櫟生桑黃菌絲生長(zhǎng)的最適碳源為葡萄糖、氯化銨；滕成龍等［22］認(rèn)為，楊樹(shù)桑黃最適氮源為酵母膏和蛋白胨；唐思煜等［23］發(fā)現(xiàn)桑黃（鮑氏層孔菌）最適碳源為蔗糖，最適氮源為氯化銨；王一菲［24］研究表明，櫟生桑黃與小孔忍冬桑黃的最佳碳源為葡萄糖、最佳氮源為酵母浸粉，這可能是由于桑黃菌種在分類上的差異導(dǎo)致的不同地區(qū)桑黃菌篩選出的最佳固體培養(yǎng)基有所差異。根據(jù)此次試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，在母種培養(yǎng)基選擇采用1/4葡萄糖+ 3/4蔗糖的配方，即馬鈴薯200 g、葡萄糖5 g、蔗糖15 g、瓊脂20 g、水1000 mL，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好、菌絲濃密、菌絲長(zhǎng)速較快，菌絲潔白，不吐黃水。后續(xù)也將對(duì)此試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證并優(yōu)化。

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（責(zé)任編輯：黃雄峰）