煙堿對(duì)腸缺血再灌注損傷大鼠凝血功能的影響

汪海松 徐林梅 陳振毅 高海鷹 蔡?hào)|妙

[摘要]?目的?觀察膽堿能激動(dòng)劑煙堿對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷后凝血功能的影響。方法?選取32只體質(zhì)量250～300g雄性健康SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法將它們分為四組（n=8）：假手術(shù)（sham?operation，S）組、腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）組、煙堿（nicotine，NIC）組、α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7?nicotinic?acetylcholine?receptor，α7nAchR）拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）組。大鼠腸缺血再灌注損傷模型采取腸系膜上動(dòng)脈夾閉45min后恢復(fù)再灌注120min的方法建立。α-BGT組在腸系膜上動(dòng)脈夾閉前45min和30min分別腹腔注射α-BGT?1μg/kg，煙堿400μg/kg；NIC組用等容量生理鹽水替代α-BGT，?S組和IR組用等容量生理鹽水替代α-BGT和煙堿，其余均同α-BGT組。在大鼠恢復(fù)再灌注120min后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血樣，檢測(cè)血漿腫瘤壞死因子-α（plasma?tumor?necrosis?factor，TNF-α）、組織因子（tissue?factor，TF）、抗凝血酶（antithrombin，AT）、組織型纖溶酶原激活物（tissue?plasminogen?activator，tPA）、纖溶酶原激活物抑制物-1（fiber?plasminogen?activator?inhibitor-1，PAI-1）、D-二聚體水平和血小板計(jì)數(shù)（platelet?count，PLT）。取遠(yuǎn)端回腸采用Chiu評(píng)分法評(píng)估小腸組織受損程度。結(jié)果?與S組和NIC組比較，IR組和α-BGT組血漿TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平均出現(xiàn)顯劇升高，血漿AT水平下降，血小板計(jì)數(shù)下降（P<0.05），小腸組織Chiu評(píng)分增加（P<0.05）。結(jié)論?煙堿能夠抑制大鼠腸缺血再灌注損傷導(dǎo)致的凝血功能過(guò)度激活；其作用機(jī)制可能為外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合，引起膽堿能抗炎通路的激活，進(jìn)而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的釋放減少，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

[關(guān)鍵詞]?腸缺血再灌注損傷；血液凝固；煙堿

[中圖分類(lèi)號(hào)]?R656??????[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.14.010

Effect?of?nicotine?on?coagulation?and?fibrinolysis?in?intestinal?ischemia-reperfusion?injury?rats

WANG?Haisong，?XU?Linmei，?CHEN?Zhenyi，?GAO?Haiying，?CAI?Dongmiao

Department?of?Anesthesiology，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Xiamen?University，?Xiamen?361003，?Fujian，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?nicotine?on?coagulation?in?intestinal?ischemia-reperfusion?injury?rats.?Methods?32?male?Sprague-dawley?rats，?weighing?250-300g，?were?randomly?divided?into?4?groups?（n=8）：?sham?operation?group?（S），?intestinal?ischemia-reperfusion?（IR）?group，?nicotine?（NIC）?group，?α7?nicotinic?acetylcholine?receptor?（α7nAchR）?antagonist?group?α-bungarotoxin?（α-BGT）?group.?Intestinal?IR?was?induced?by?clamping?superior?mesenteric?artery?for?45min?and?120min?of?reperfusion.?In?group?NIC?nicotine?400μg/kg?was?injected?intraperitoneally?at?30min?before?superior?mesenteric?artery?occlusion.?In?group?α-BGT?1μg/kg?was?injected?intraperitoneally?at?15min?before?superior?mesenteric?artery?occlusion.?Plasma?tumor?necrosis?factor-α?（TNF-α），?tissue?factor?（TF），?antithrombin?（AT），?tissue?plasminogen?activator?（tPA），?fiber?plasminogen?activator?inhibitor-1?（PAI-1），?D-dimer?levels?and?platelet?count?（PLT）?were?measured?after?120min?reperfusion.?Chius?count?was?used?to?assess?the?changes?in?intestinal?mucosal?pathlolgical?morphology.?Results?Compared?with?group?S?and?group?NIC，?the?plasma?TNF-α，TF，?tPA，?PAI-1?and?D-dimer?levels?were?significantly?increased，?and?plasma?AT?level?and?platelet?count?were?significantly?decreased，?in?group?IR?and?group?α-BGT（P<0.05），Chius?scores?were?significantly?increased（P<0.05）.?Conclusion?Nicotine?can?inhibit?the?excessive?activation?of?coagulation?function?in?intestinal?ischemia-reperfusion?injury?rats.?Its?mechanism?may?be?related?to?activation?of?cholinergic?antiinflammatory?pathway，?reducing?the?release?of?pro-inflammatory?cytokines?thereby?reducing?endothelial?cell?injury.

[Key?words]?Intestinal?ischemia-reperfusion?injury;?Blood?coagulation;?Nicotine

腸缺血再灌注損傷是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克和腸移植等疾病常見(jiàn)的并發(fā)癥，具有較高的發(fā)生率和病死率[1-2]。腸道屏障功能受損和細(xì)菌移位是腸缺血過(guò)程中的常見(jiàn)并發(fā)癥，常導(dǎo)致活性氧和炎性細(xì)胞因子的過(guò)度釋放，甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。炎性細(xì)胞因子大量的釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，造成內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而引起抗凝和纖容抑制，導(dǎo)致血管內(nèi)外纖維蛋白沉積，出現(xiàn)凝血和纖溶功能紊亂，使得微循環(huán)障礙進(jìn)一步加劇，最終導(dǎo)致多器官衰竭[3-4]。前期研究表明，大鼠內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的凝血和纖溶功能紊亂，可以通過(guò)電刺激足三里穴使膽堿能抗炎通路激活，進(jìn)而導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放減少?gòu)亩玫矫黠@的改善[5]。因此，本研究擬通過(guò)夾閉腸系膜上動(dòng)脈復(fù)制大鼠腸缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，探討膽堿能激動(dòng)劑煙堿對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷時(shí)凝血功能的影響。

1??材料與方法

1.1??實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)健康雄性Sprague?Dawley?大鼠32只，年齡6～8月，體質(zhì)量250～300g，由廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（閩）2018-0009]。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組8只：①假手術(shù)（sham?operation，S）組；②腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）組；③煙堿（nicotine，NIC）組；④α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7?nicotinic?acetylcholine?receptor，α7nAchR）拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）組。

1.2??模型制備

大鼠腸缺血再灌注損傷模型采用參考文獻(xiàn)[6]中結(jié)扎腸系膜上動(dòng)脈的方法制備。動(dòng)物自由飲水，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前12h停止進(jìn)食。通過(guò)腹腔注射50mg/kg?的1%戊巴比妥納對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，大鼠麻醉成功后仰臥固定于鼠板上，經(jīng)常規(guī)消毒后鋪巾，沿著腹部正中切開(kāi)約3.5cm的切口進(jìn)入腹腔，游離大鼠腸系膜上動(dòng)脈后，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾將其夾閉，45min后松開(kāi)動(dòng)脈夾以恢復(fù)再灌注。待腸系膜上動(dòng)脈重新恢復(fù)搏動(dòng)后將腸管回納入腹腔并逐層關(guān)腹。S組僅分離不夾閉腸系膜上動(dòng)脈，α-BGT組在腸系膜上動(dòng)脈夾閉前45min和30min分別腹腔注射α-BGT?1μg/kg，煙堿400μg/kg。NIC組用等容量生理鹽水替代α-BGT，?S組和IR組用等容量生理鹽水替代α-BGT和煙堿，余均同α-BGT組。

1.3??標(biāo)本采集

在大鼠恢復(fù)再灌注120min后，通過(guò)腹腔注射50mg/kg?1%戊巴比妥納麻醉大鼠，將2.7ml取自于腹主動(dòng)脈的血樣于含枸櫞酸鈉抗凝管中并持續(xù)靜置15min，再在4℃的離心機(jī)（3000g）離心10min，收集離心后的上清液，貯存于–20℃冰箱中待用，血漿中瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor，TNF-α）、組織因子（tissue?factor，TF）、抗凝血酶（antithrombin，AT）、組織型纖溶酶原激活物（tissue?plasminogen?activator，tPA）、纖溶酶原激活物抑制物-1（fiber?plasminogen?activator?inhibitor-1，PAI-1）、D-二聚體水平采用ELISA法來(lái)測(cè)定。取血1ml置于含乙二胺四乙酸二鉀鹽抗凝采血管中，使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。取離回盲瓣5cm處小腸組織制成標(biāo)本，進(jìn)行小腸組織損傷病理評(píng)分。

1.4??小腸組織損傷病理評(píng)分

采用10%甲醛溶液固定遠(yuǎn)端回腸，進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)制備HE染色切片，并在光學(xué)顯微鏡下觀察小腸病理?yè)p傷情況，參考文獻(xiàn)[7]采用Chiu評(píng)分法評(píng)判小腸黏膜損傷程度。

1.5??統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS?20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

IR組和α-BGT組血漿中的TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平與S組相比均出現(xiàn)明顯升高，而AT水平則降低，血小板計(jì)數(shù)減少（P<0.05），小腸組織Chiu評(píng)分增加（P<0.05）；IR組和α-BGT組血漿中的TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平與NIC組相比均出現(xiàn)明顯升高，AT水平降低，血小板計(jì)數(shù)（platelet，PLT）減少（P<0.05），小腸組織Chiu評(píng)分增加（P<0.05）。見(jiàn)表1，表2。

3??討論

腸缺血再灌注損傷是導(dǎo)致臨床危重癥患者出現(xiàn)多器官衰竭的重要原因，其病理生理機(jī)制主要是過(guò)度釋放炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和氧自由基，從而造成局部和遠(yuǎn)隔器官受損，同時(shí)伴有血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[8-9]。研究顯示，腸缺血再灌注時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，從而激活凝血系統(tǒng)，抑制纖溶系統(tǒng)，最終出現(xiàn)微循環(huán)功能障礙[2]。

機(jī)體的主要抗凝系統(tǒng)為AT系統(tǒng)和TF系統(tǒng)，其中AT在缺血再灌注損傷時(shí)直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞上的糖胺的表達(dá)和凝血酶的蛋白水解活性，其是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。在感染時(shí)，AT因?yàn)楹铣墒茏杓跋倪^(guò)多等原因常常導(dǎo)致其水平下降[3，10]。當(dāng)腸缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，機(jī)體釋放大量的炎性細(xì)胞因子TNF-α，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度的釋放TF、TF與凝血因子FⅦa或Ⅹa形成復(fù)合物激活外源性的凝血系統(tǒng)[11]。TF-FVIIα復(fù)合物又可以引起TNF-α的合成和釋放。TNF-α激活炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)TF表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)與凝血反應(yīng)的相互作用，形成一個(gè)持續(xù)不斷的惡性循環(huán)[12]。在生理性凝血過(guò)程中血小板起著關(guān)鍵性的作用，在急性炎癥反應(yīng)時(shí)，凝血功能出現(xiàn)異常，是由于血小板大量被消耗所致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IR組小腸組織Chiu評(píng)分、血漿TNF-α和TF明顯高于S組，AT和血小板較S組降低，證明模型制備成功。

在正常生理狀態(tài)下，血液中的tPA水平維持在一個(gè)特定的水平內(nèi)，當(dāng)出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)時(shí)，TNFα刺激血液中PAI-1水平升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量的tPA入血，隨后tPA與PAI-1形成復(fù)合物，抑制纖溶功能，導(dǎo)致血管內(nèi)纖維蛋白降解物D-二聚體增[13]。

本實(shí)驗(yàn)選擇給予煙堿的時(shí)機(jī)和劑量是根據(jù)文獻(xiàn)[14]來(lái)確定的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠小腸組織Chiu評(píng)分在腸缺血再灌注損傷后顯劇升高，血漿中TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平上升，而AT含量與血小板計(jì)數(shù)下降，大鼠小腸組織Chiu評(píng)分在給予煙堿處理后明顯低于IR組，且與IR組相比血漿中TNF-α、TF、tPA、PAI-1和D-二聚體水平降低，AT水平及血小板計(jì)數(shù)增加，這說(shuō)明煙堿對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，并使紊亂的凝血功能得到改善。而在預(yù)先給予α7煙堿型乙酰膽堿受體拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素后，煙堿對(duì)大鼠炎癥和凝血功能的改善被阻斷，表明煙堿對(duì)腸缺血再灌注大鼠凝血功能的影響主要通過(guò)與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合而發(fā)揮作用的。

煙堿對(duì)腸缺血再灌注損傷時(shí)凝血功能的影響可能是通過(guò)與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體相結(jié)合，導(dǎo)致膽堿能抗炎通路被激活，從而抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致紊亂的凝血和纖溶功能得到改善。炎癥系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)在腸缺血再灌注損傷時(shí)相互激活，其中炎性細(xì)胞因子TNF-α在激活凝血系統(tǒng)時(shí)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。有研究表明，TNF-α可造成機(jī)體組織因子過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而引起凝血系統(tǒng)的激活，并抑制抗凝血和纖溶功能[15-16]。研究證明，α7煙堿型乙酰膽堿受體激動(dòng)劑能夠抑制腸上皮細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下發(fā)生的炎癥反應(yīng)和氧化損傷，其主要機(jī)制是通過(guò)膽堿能抗炎通路的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的[4]。劉薇等[14]經(jīng)研究后發(fā)現(xiàn)，煙堿對(duì)內(nèi)毒素大鼠凝血和纖溶功能具有明顯的改善作用，其機(jī)制可能是煙堿與α7煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合，通過(guò)膽堿能抗炎通路的激活來(lái)抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮作用。

綜上所述，預(yù)先給予煙堿，可以有效地改善腸缺血再灌注損傷大鼠凝血功能，其作用機(jī)制可能是煙堿與外周α7煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合，繼而激活膽堿能抗炎通路，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放減少，從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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