黃芪多糖作為疫苗佐劑的免疫活性研究進(jìn)展

沈冠男 宛傳奇 楊 揚(yáng) 吳肖葦 何煜舟

接種疫苗是預(yù)防和控制傳染病傳播的最有效策略，但單一抗原成分的疫苗引出的免疫反應(yīng)無法給機(jī)體提供有效的免疫保護(hù)，因此需要在疫苗中添加佐劑以提升人體免疫效果[1]。佐劑是增強(qiáng)和調(diào)節(jié)疫苗抗原免疫反應(yīng)的免疫刺激物，與抗原共同注射機(jī)體后，可延長(zhǎng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫時(shí)間，增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬呈遞作用以及刺激淋巴細(xì)胞的增殖分化，以提高疫苗的有效性[2]。鋁佐劑是最早被發(fā)現(xiàn)的佐劑，自1932 年首次應(yīng)用于人體以來，在傳染病的預(yù)防中發(fā)揮了重大作用，研究表明氫氧化鋁一般只誘導(dǎo)Th2 型免疫反應(yīng)，近年來也有研究稱鋁佐劑可誘導(dǎo)Th1 型免疫反應(yīng)但是受接種途徑的影響[3]。之后發(fā)現(xiàn)的油乳劑雖然可以同時(shí)誘導(dǎo)Th1 和Th2 型免疫反應(yīng)但同時(shí)存在發(fā)燒、頭痛、惡心、炎癥等不良反應(yīng)[4]。近年來中藥多糖的免疫學(xué)活性被發(fā)掘，其中黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是備受關(guān)注的一種多糖，諸多學(xué)者證實(shí)APS 可被用作疫苗佐劑。本文基于這些研究對(duì)于APS 作為一種疫苗佐劑的免疫活性研究進(jìn)展作以下綜述。

1 中藥多糖佐劑分子機(jī)制

從中藥植物提取的多糖，具有生物相容性、可降解性和安全的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。研究表明，從黃芪、枸杞、板藍(lán)根、茯苓和肉蓯蓉中提取的多糖成分可以作為佐劑應(yīng)用在疫苗中刺激免疫應(yīng)答[6]。中藥植物多糖疫苗佐劑分子機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面[7]：（1）激活巨噬細(xì)胞吞噬與呈遞功能；（2）促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟與分化；（3）促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和活化；（4）降低Tregs 細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T 細(xì)胞增殖的抑制作用。但由于中藥來源廣泛，提取工藝不同，不同來源的多糖結(jié)構(gòu)存在較大差異，這種差異對(duì)多糖的免疫活性產(chǎn)生的影響未知[8]。

2 APS 的構(gòu)成

黃芪首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有“補(bǔ)氣圣藥”的美稱，來源為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 膜 莢 黃 芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。黃芪中提取的主要化學(xué)成分——APS 是近年來研究的熱點(diǎn)，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血糖、抗衰老和抗炎等藥理作用[9-10]。APS 的有效成分主要由多種單糖和葡聚糖（glucan，Glu）構(gòu)成。根據(jù)已有研究，APS 含有的單糖組分包括葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、半乳糖醛酸、甘露糖、巖藻糖及來蘇糖。Glu 是基于吡喃葡萄糖基的多糖，根據(jù)其單糖殘基結(jié)構(gòu)，可以是α-D-Glu、β-D-Glu 或α，β-D-Glu[11]。APS 的分子量分布較廣，大致可分為4 段，＞1000 kDa、100～1000 kDa、10～100 kDa 和＜10 kDa[12]。受不同提取方式的影響，APS 的性質(zhì)與生物學(xué)活性也有很大差別。以往研究表明糖苷鍵和單糖的鏈接方式對(duì)多糖生物活性的影響大于單糖的組成，分支度過大或過小都無法使多糖生物活性達(dá)到理想狀態(tài)。Jiang 等[13]先采用沸水浸提APS，之后分別采用不同濃度的乙醇分級(jí)醇沉（20%、40%、60%、80%）得到4 種APS，對(duì)這4 種APS的分子量采用高效凝膠滲透色譜法聯(lián)合示差折光檢測(cè)器測(cè)定，得到結(jié)果分別為257.7、40.1、15.3 和3.2 kDa。其中，APS1 只含有葡萄糖，APS2 只含有阿拉伯糖，APS3 含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，摩爾比為1∶10.76∶6.55∶12，APS4 含有半乳糖和阿拉伯糖，摩爾比為3.02∶1。將這四種多糖進(jìn)行生物活性研究，發(fā)現(xiàn)只有APS2 和APS3 具有免疫學(xué)活性，可刺激淋巴細(xì)胞增殖，這說明不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)APS 生物活性存在影響。李宏全等[14]使用微波輔助提取技術(shù)提取得到APS，進(jìn)一步分離純化后利用柱前衍生化HPLC 法測(cè)試APS 的單糖組成。結(jié)果顯示APS 由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖構(gòu)成，其物質(zhì)的量比為1.19∶72.01∶5.85∶20.95，相對(duì)分子質(zhì)量為1.1×104，葡萄糖以α-型糖苷鍵連接成其主鏈，并含有少量β-糖苷鍵。該團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)APS 作為疫苗佐劑可提高雞新城疫和傳染性腔上囊病疫苗免疫力和免疫器官增重[15]，但并未證實(shí)不同糖苷鍵對(duì)APS 的免疫學(xué)活性存在影響。

3 APS 的免疫調(diào)節(jié)作用

3.1 對(duì)巨噬細(xì)胞的影響 當(dāng)巨噬細(xì)胞受到抗原刺激后極化成M1 型巨噬細(xì)胞和M2 型巨噬細(xì)胞，前者能夠分泌相應(yīng)的促炎性細(xì)胞因子，在炎癥發(fā)生的早期具有重要意義，后者在炎癥消退、組織改造、功能修復(fù)等方面起到重要作用；識(shí)別并消滅病原體、清除衰亡細(xì)胞、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)是巨噬細(xì)胞吞噬功能的主要表現(xiàn)形式[16]。巨噬細(xì)胞處理外源性抗原和內(nèi)源性抗原后，具有免疫原性的小分子肽段與主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatiblity complex，MHC）結(jié)合形成肽-MHC 復(fù)合物并表達(dá)于細(xì)胞表面，T 細(xì)胞識(shí)別這些肽-MHC 復(fù)合物后被激活。羅晶晶等[17]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的活化和吞噬功能以及巨噬細(xì)胞表面細(xì)胞活化標(biāo)志分子的水平受APS 影響。在加入了不同濃度的APS（0.1、1、10、50 和100 μg/mL，對(duì)照組為0 μg/mL）培養(yǎng)基中，使用100 μg/mL 的APS 處理過的巨噬細(xì)胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子的表達(dá)水平、細(xì)胞吞噬率及單個(gè)細(xì)胞吞噬能力最高。在免疫抑制狀態(tài)下，APS 依舊可以刺激巨噬細(xì)胞活化，且與劑量呈正相關(guān)。史晶晶等[18]建立了環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠，給予不同劑量的APS（0.02、50、100、200 mg/kg），小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)隨APS 劑量增加而增加，在給予200 mg/kg APS 時(shí)作用最強(qiáng)。Bamodu 等[19]發(fā)現(xiàn)，用APS 與人單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞（human monocyte-derived macrophage，MDM）共培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞培養(yǎng)基中，暴露于16 mg/mL APS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后極化成M1 型巨噬細(xì)胞的MDM 從處理前的1.59%上升到78.1%，相反的是M2 極化呈下調(diào)趨勢(shì)。該團(tuán)隊(duì)稱此實(shí)驗(yàn)首次證明了APS 對(duì)巨噬細(xì)胞M1 極化有優(yōu)先調(diào)節(jié)作用。Zhu 等[20]發(fā)現(xiàn)APS（10～80 μg/mL）通過增加MHC-Ⅱ、CD40、CD80 和CD86 的 表 達(dá) 促 進(jìn)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的成熟。

3.2 對(duì)樹突狀細(xì)胞（DC）的影響 DC 是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，是機(jī)體最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞。DC 根據(jù)存在狀態(tài)分可分為成熟狀態(tài)和未成熟狀態(tài)，未成熟DC 具有免疫監(jiān)視、檢測(cè)潛在抗原等重要作用，成熟DC 具有啟動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答作用，當(dāng)受到抗原刺激后，它們捕捉并加工抗原，以MHC-多肽復(fù)合物的形式呈現(xiàn)于細(xì)胞表面，通過MHC-多肽復(fù)合物激活T 細(xì)胞與B 細(xì)胞[21-22]。An 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，APS 可以刺激人外周血DC 活化，增加DC 表面MHC-Ⅱ、CD86和CD9 等各種免疫相關(guān)抑制因子的表達(dá)，從而增強(qiáng)DC 與T 細(xì)胞之間的相互作用。另一項(xiàng)研究[24]發(fā)現(xiàn)，APS 處理的漿細(xì)胞DC（pDC）在緩解期比未經(jīng)處理的慢性粒細(xì)胞白血病（CML）組分泌更多的干擾素-α（IFN-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），這表明APS 可以促進(jìn)pDC 在CML 中的功能,并促進(jìn)pDC 向DC 轉(zhuǎn)化。Hwang 等[25]研究了鼻內(nèi)給予APS 對(duì)注射了B16 黑色素瘤細(xì)胞（0.5×106/100 μL）的小鼠黏膜免疫細(xì)胞活化的影響，發(fā)現(xiàn)APS 的鼻內(nèi)治療刺激了小鼠腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，mLN）中DC 增長(zhǎng)，其作用機(jī)制為上調(diào)CC-趨化因子受體7 的表達(dá)來發(fā)揮作用。此外，鼻內(nèi)治療APS 激活了DC，這進(jìn)一步刺激了mLN中的自然殺傷細(xì)胞和T 細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)表明，APS可作為局部黏膜佐劑，增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗癌作用。

3.3 對(duì)T/B 淋巴細(xì)胞的影響 T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞是人體最為重要的免疫細(xì)胞，兩者相互協(xié)作，具有免疫識(shí)別功能。T 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，分化成熟后識(shí)別并直接殺死靶細(xì)胞。Th1 細(xì)胞和Th2 細(xì)胞是輔助性T 細(xì)胞的兩種亞型，是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，Th1 細(xì)胞特征在于分泌干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），Th2 細(xì)胞特征在于分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和白細(xì)胞介素-13（IL-13）。CD3+T 細(xì)胞代表總T 細(xì)胞水平，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物不同，T淋巴細(xì)胞又分為CD4+T 和CD8+T 淋巴細(xì)胞兩個(gè)主要亞群，CD4+T 淋巴細(xì)胞可提高免疫功能，而CD8+T 淋巴細(xì)胞則相反[26]。劉艷玲等[27]使用APS 高、中、低劑量（400、200、100 mg/kg）給予肺癌模型小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠脾組織白細(xì)胞介素-2（IL-2）和IFN-γ 含量顯著升高，IL-4 和IL-10 含量顯著降低，且呈劑量依賴性。此外APS 可顯著提高肺癌小鼠免疫功能，主要表現(xiàn)在APS 劑量依賴性提高小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞水平和CD4+/CD8+比值。Jin 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，APS 硫酸化淫羊藿多糖（APSsulfated epimedium polysaccharide，APS-sEPS）對(duì)新生仔豬外周血淋巴細(xì)胞和腸黏膜具有免疫作用，可增強(qiáng)外周血和空腸黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-10、分泌型免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）的濃度，并刺激仔豬T 淋巴細(xì)胞增殖。

B 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)體液免疫，基本功能是產(chǎn)生抗體、呈遞抗原和分泌細(xì)胞因子。參與體液免疫應(yīng)答過程的Ig 主要有3 種, 即IgA、IgG 和IgM，因此檢測(cè)Ig 濃度是監(jiān)測(cè)體液免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一。舒迎霜等[29]發(fā)現(xiàn)APS 可提高比格犬血清IgA、IgG、IgM 和IFN-γ 水平，能增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答。研究[30-32]發(fā)現(xiàn)APS 可以提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫力，促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的增殖，刺激IgA、IgG、IgM、IL-6、IFN-γ、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、TNF-α 產(chǎn)生，刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及提高免疫器官指標(biāo)。

3.4 對(duì)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Terg）的影響 Treg 細(xì)胞是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T 細(xì)胞亞群，能夠抑制其他細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Du 等[33]研究表明，APS 通過抑制Treg 細(xì)胞活性來增強(qiáng)小鼠乙型肝炎病毒（HBV）疫苗的免疫反應(yīng)，高效刺激細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的活性。Li 等[34]研究表明，APS 可通過上調(diào)IFNγ，下調(diào)IL-4 和IL-10 的表達(dá)，抑制FOXp3 mRNA的表達(dá)，降低Treg 細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境下的免疫抑制作用。

4 APS 作為疫苗佐劑的免疫調(diào)節(jié)作用

APS 作為疫苗佐劑在動(dòng)物模型中起到明顯的免疫增強(qiáng)效果，研究涉及新城疫病毒、乙型肝炎病毒、手足口病、流感等多種疫苗。Xue 等[35]在新城疫病毒疫苗動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)，新城疫疫苗聯(lián)合APS 可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，顯著提高血清抗NDV 抗體滴度和IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-6 濃度，提高外周血中CD4+和CD8+T 細(xì)胞濃度?？傮w結(jié)果表明，雞用新城疫活疫苗聯(lián)合APS 可以刺激新孵雛雞體液和細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)。Du 等[33]研究了APS 作為乙型肝炎病毒疫苗佐劑對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)APS 可增強(qiáng)乙型肝炎病毒疫苗對(duì)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過增加MHC-Ⅰ/Ⅱ和共刺激分子（CD40、CD80 和CD86）的表達(dá)，從而促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟。Li 等[36]研究發(fā)現(xiàn)手足口病疫苗聯(lián)合APS 能上調(diào)INF-γ 和IL-6 基因表達(dá)，并上調(diào)特異性抗體滴度，這表明APS 可用作手足口病疫苗的免疫調(diào)節(jié)劑提供更好的抗手足口病病毒保護(hù)。有研究[37]發(fā)現(xiàn)，APS作為甲型流感（H3N2）疫苗佐劑可通過誘導(dǎo)Th1/Th2 平衡和IL-17 和IgG1 抗體的產(chǎn)生增強(qiáng)瑞士白化病小鼠的免疫應(yīng)答。Abdullahi 等[38]聯(lián)合使用APS和H5N1 流感疫苗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明APS 組雛雞血清中IL-2、IL-10、TNF-α 和IFN-β 的表達(dá)增強(qiáng)，說明APS 能刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞活化，聯(lián)合使用APS 可能對(duì)雞致命的H5N1 流感病毒感染有更好的保護(hù)作用。

5 小 結(jié)

APS 提取自天然植物黃芪，具有毒性低、安全性好的優(yōu)點(diǎn)，然而受到不同提取手段影響，APS 分子結(jié)構(gòu)、分子量、單糖組成及糖鏈連接上均有差異。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)APS 對(duì)免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用，是一種很有開發(fā)潛力的新型疫苗佐劑。但目前APS 作為疫苗佐劑大多應(yīng)用于動(dòng)物疫苗，用于人類疫苗的研究存在空白，今后開發(fā)人用APS 疫苗佐劑仍需作進(jìn)一步深入探討。此外APS 作為多組分物質(zhì)，提純和結(jié)構(gòu)研究限制了其作為臨床疫苗佐劑的發(fā)展[39]。因此今后研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)在于闡明APS 的高級(jí)結(jié)構(gòu)并分析寡糖片段及相對(duì)應(yīng)的生物活性，進(jìn)一步探討糖結(jié)構(gòu)作用的有效靶點(diǎn)及其機(jī)制。