四倍體資陽香橙快繁體系的建立研究

摘" 要： 以四倍體資陽香橙幼芽和莖段為外植體，通過微扦插技術，對不同植物激素組合進行了優(yōu)化，以期建立高效的快速繁殖體系。結(jié)果表明：以幼芽為外植體，添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT的MT培養(yǎng)基，誘導芽效果最佳，45 d時誘導率高達91.67%，增殖系數(shù)為1.82；以莖段為外植體，添加1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT的MT培養(yǎng)基，腋芽分化效果最佳，45 d時腋芽分化率為76.67%，增殖系數(shù)為1.22；而2.0 mg/L NAA+0.2% AC（活性炭）的1/2MT培養(yǎng)基，誘導生根的效果最佳，60 d時生根率達92.59%；對獲得的46株組培苗進行移栽馴化，存活率為95.7%。經(jīng)根尖染色體壓片計數(shù)法鑒定，獲得的組培苗均為四倍體資陽香橙。該研究建立了高效的四倍體資陽香橙無性繁殖體系，可為后續(xù)多倍體研究和生產(chǎn)實踐提供材料。

關鍵詞： 四倍體；資陽香橙；生根率；增殖系數(shù)；馴化

中圖分類號： S335.1

文獻標識碼： A" 文章編號： 2096-3998（2024）02-0055-09

收稿日期：2023-07-26" 修回日期：2023-09-18

基金項目：陜西省重點研發(fā)計劃項目（2022NY-141）；陜西省教育廳協(xié)同中心項目（21JY006）；陜西理工大學秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室（培育）“市校共建”科研專項項目（SXC-2305）

*通信作者：蔣景龍（1980—），男，山東棗莊人，博士，教授，主要研究方向為植物細胞逆境和細胞工程。

引用格式： 王倩，蔣景龍，秦公偉，等.四倍體資陽香橙快繁體系的建立研究.陜西理工大學學報（自然科學版），2024，40（2）：55-63.

多倍體（polyploid）是指生物體細胞中含有染色體組3個及以上的個體。與正常的二倍體植株相比，多倍體植物常具有植株矮小粗壯、根系短粗、器官巨大和生長緩慢、育性低等特點。此外，一些研究表明，與二倍體相比，多倍體植物對逆境的耐受能力更強，更能適應環(huán)境的變化，在進化中占據(jù)優(yōu)勢，被認為具有更好的遺傳適應性和抗逆性。例如，四倍體的枳（Poncirus trifoliata（L.）Raf.）比二倍體的枳具有更強的耐干旱能力；四倍體的枳雀（Citrus wilsonii Tanaka）相比二倍體具有較強的光合作用、蛋白質(zhì)修飾和植物激素調(diào)控等能力，因而具有更強的抗旱性。同時，四倍體的大麥、水稻和柑橘也比二倍體具有更強的耐低溫、高溫、鹽和鉻毒性。因此，選育多倍體的柑橘，特別是作為砧木的柑橘品種，具有很大的應用潛力。在自然條件下，多胚性柑橘品種的珠心胚會發(fā)生一定頻率的基因組加倍現(xiàn)象，從而產(chǎn)生天然的四倍體后代，然而柑橘群體四倍體自然發(fā)生率極低，例如衢州香橙、酸橙和山金柑的四倍體群體自然發(fā)生率分別為0.75%、0.43%、0.62%。周銳等對柑橘四倍體的發(fā)掘中發(fā)現(xiàn)，無酸甜橙、紅江橙、貢柑、年橘、新會柑、滑皮金柑的群體自然發(fā)生率分別為0.93%、0.99%、0.37%、0.75%、1.42%、0.73%。彭瀅在對枳橙的研究中同樣發(fā)現(xiàn)枳橙的群體自然發(fā)生率為2.93%。如此低的四倍體發(fā)生率，嚴重限制了多倍體柑橘在生產(chǎn)實踐上的應用。

無性快速繁殖技術可在短期內(nèi)獲得大量的再生苗，而被廣泛應用在各種植物和作物的快速繁育中。例如，蘇甜等選用“水果黃瓜”G1001的子葉節(jié)為外植體，在添加有2 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中建立了高效再生體系；張健等以1年生的“魯麗蘋果”嫩莖為外植體，在添加0.8 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中，再生率高達96.5%；楊文靜等以含有腋芽的莖段進行再生苗的誘導，也成功建立了歐李高效再生體系。近年來，無性快繁技術也逐漸開始在柑橘品種當中應用，例如Kobayashi等以甜橙成熟的莖段為外植體，通過微芽嫁接技術成功獲得甜橙完整植株；敖小平等利用“大紅”甜橙實生苗上胚軸為外植體，同樣建立了“大紅”甜橙高效的再生體系；陳國華等也分別研究了紅江橙和沙糖橘的頂芽、側(cè)芽、莖段對芽增殖的影響，建立了一套完整的柑橘脫毒苗快繁體系。然而，快繁體系在柑橘多倍體砧木中的研究卻鮮有報道。因此，建立多倍體柑橘高效的快速繁殖體系尤為迫切。

資陽香橙（C.junos cv.Ziyang xiangcheng）屬蕓香科，柑橘屬，金柑類，軟枝蜜橙，是一種原產(chǎn)于中國西南地區(qū)的柑橘砧木種質(zhì)，被認為是宜昌橙和寬皮橘的雜交種，具有極強的抗堿性，有著“中國柑桔抗堿砧木之王”的美稱。因此，自20世紀80年代以來資陽香橙作為優(yōu)良抗堿砧木被廣泛應用。資陽香橙作為砧木能夠承受各種脅迫，如在pH值高達8.3的堿性土壤中，資陽香橙上生長的接穗并沒有出現(xiàn)葉片的黃化。近年來，資陽香橙因其對堿性脅迫和缺鐵的良好耐受性，被我國越來越多的堿性土壤地區(qū)作為柑橘砧木使用。此外，F(xiàn)U Xingzheng等研究表明，與三葉橙、紅橘和“沙田”柚的3種常用砧木相比，資陽香橙還對銅離子的毒性具有較強的耐受性。

前期，課題組利用形態(tài)初篩、流式細胞儀和根尖染色體壓片法，對794株資陽香橙實生苗進行鑒定，最終獲得了10株四倍體資陽香橙幼苗，然而，群體自然發(fā)生率僅為1.26%，無法滿足實驗研究與生產(chǎn)實踐的需要。因此，本文分別以2年生四倍體資陽香橙植株的幼芽和莖段為外植體，利用微扦插技術，通過比較不同的植物激素組合，建立高效的四倍體資陽香橙快速繁殖體系。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

選取已鑒定的2年生四倍體資陽香橙實生苗，采集新鮮的幼芽和莖段，用于無性快速繁殖實驗。

1.2" 實驗方法

1.2.1" 外植體處理

采集四倍體資陽香橙的幼芽和新梢（新梢去除葉片和尖刺），于自來水下輕輕沖洗30 min，蒸餾水沖洗3～4次后，轉(zhuǎn)至超凈工作臺中，使用質(zhì)量分數(shù)0.1 %的升汞進行6 min消毒處理，無菌水清洗3～4次，再用無菌濾紙吸干外植體表面水分，幼芽可直接用于實驗接種，新梢則需剪成1.5～2.0 cm長度的莖段（帶有腋芽）用于實驗接種。

1.2.2" 四倍體資陽香橙芽的誘導分化

將外植體接種到MT培養(yǎng)基，MT培養(yǎng)基的配制方法參照文獻。設置不同濃度6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L）和KT（0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L）及其正交組合。每種植物激素處理接種4瓶，每瓶接種5個外植體。培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光照強度3 000 Lux，光/暗周期16 h/8 h。幼芽接種45 d后，對其芽的誘導情況進行觀察，并分別統(tǒng)計誘導率和增殖系數(shù)。芽的誘導率（%）=（誘導出芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%；芽增殖系數(shù)=誘導出的芽總數(shù)/接種的外植體數(shù)；同樣，莖段接種45 d后，對其腋芽的分化情況進行觀察，并分別統(tǒng)計芽的分化率和增殖系數(shù)。芽的分化率（%）=（分化腋芽的莖段數(shù)/接種的莖段數(shù)）×100%；增殖系數(shù)=腋芽分化總數(shù)/接種的莖段數(shù)。

1.2.3" 芽的誘導生根

選擇生長至2 cm左右的四倍體資陽香橙再生芽，接種到分別含有不同濃度IBA（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L）和NAA（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L）的不同類型培養(yǎng)基（1/2MT、1/2MS、MT）內(nèi)進行培養(yǎng)。每種植物激素處理接種3瓶，每瓶接種3個獲得的再生芽。接種60 d后，對四倍體資陽香橙再生芽的生根狀況進行觀察并統(tǒng)計生根率。生根率（%）=（再生芽生根數(shù)/接種再生芽數(shù)）×100%；培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光照強度3 000 Lux，光/暗周期16 h/8 h。

1.2.4" 移栽和馴化

生根培養(yǎng)60 d后，挑選生長健壯的組培苗在培養(yǎng)間進行4 d的練苗，先從培養(yǎng)基中移出組培苗，用無菌水沖洗根部殘留的培養(yǎng)基，再移栽至滅過菌的培養(yǎng)基質(zhì)中（蛭石∶珍珠巖∶營養(yǎng)土=1∶1∶1）。" 馴化前先用蒸餾水澆透，馴化過程中保鮮膜輔助保濕，并每間隔2 d噴灑適量的蒸餾水。30 d后統(tǒng)計移栽成活率。移栽成活率（%）＝（移栽后成活的組培苗數(shù)/移栽的組培苗總數(shù)）×100%。培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光照強度3 000 Lux，光/暗周期16 h/8 h。

1.2.5" 四倍體鑒定

對獲得的再生苗利用根尖染色體計數(shù)法鑒定其倍性，具體方法參照LAN Hong等的鑒定方法。首先切取長度約0.2 mm的根尖，輕輕沖凈表面殘存土壤，放置在飽和的對二氯苯溶液中2 h，卡諾固定液固定2 h，1 mol/L HCl中60 ℃水浴中酸解1 min，用20%卡寶品紅溶液進行染色、壓片。最后在顯微鏡下對染色體進行計數(shù)、拍照。

1.2.6" 統(tǒng)計分析

使用Excel 2016和SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和單因素方差分析（ANOVA），使用GraphPad prism 9和Photoshop軟件進行圖版制作。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同植物激素對四倍體資陽香橙幼芽增殖的影響

本實驗選用MT為基本培養(yǎng)基，采用不同濃度的KT與6-BA對四倍體資陽香橙幼芽誘導芽的增殖。剛接種的新鮮幼芽（圖1A），在前25 d均處于生長伸長階段（圖1B），在同時添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L KT的MT培養(yǎng)基中35 d時開始出現(xiàn)芽的增殖（圖1C），45 d時生長最為旺盛（圖1D）；當6-BA濃度升高到2.0 mg/L時，與KT的組合在35 d產(chǎn)生愈傷組織（圖1E），第45 d植株枯黃死亡（圖1F）；當6-BA為3.0 mg/L時，與KT的組合也同樣出現(xiàn)愈傷組織和植株死亡的現(xiàn)象（圖1G、H）。

在MT培養(yǎng)基中單獨添加6-BA時，2.0 mg/L芽的誘導率和增殖系數(shù)顯著（P＜0.05）高于1.0、3.0 mg/L，分別為63.33%和0.6（圖2A、E）；在單獨添加KT時，0.5 mg/L芽的誘導率和增殖系數(shù)顯著（P＜0.05）高于0.1、1.0、1.5 mg/L，分別為53.33%和0.8（圖2B、F）；而在同時添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L KT時，芽增殖效果達到最佳，顯著（P＜0.05）高于1.0 mg/L 6-BA與0.5、1.0、1.5 mg/L KT濃度組合，誘導率高達91.67%，增殖系數(shù)為1.83（圖2C、G）；當6-BA濃度升高到2.0 mg/L時，誘導率和增值系數(shù)下降，在同時添加0.1 mg/L KT時誘導率與增殖系數(shù)最高，分別為48.33%和0.53（圖2D、H）。結(jié)果表明，以幼芽為外植體，同時添加1.0 mg/L 6-BA和0.1mg/L KT的MT培養(yǎng)基中芽增殖效果最佳。

A—D.不同植物激素濃度中（mg/L）幼芽45 d的誘導率（%）；

E—H.不同植物激素濃度中（mg/L）幼芽45 d的增殖系數(shù)

2.2" 不同植物激素對四倍體資陽香橙莖段腋芽分化的影響

外植體在培養(yǎng)3 d時開始出現(xiàn)芽點（圖3A），第10 d時分化出腋芽（圖3B）。在不添加任何激素的MT培養(yǎng)基中腋芽35 d時還在處于生長階段（圖3C），而在同時添加1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L KT的MT培養(yǎng)基中25 d時腋芽已完成生長（圖3D），35 d時新腋芽開始分化（圖3E），45 d時分化的腋芽持續(xù)生長（圖3F）。

A.外植體開始出現(xiàn)芽點（MT培養(yǎng)基，3 d）；" B.外植體開始分化腋芽（MT培養(yǎng)基，10 d）；

C.外植體分化腋芽開始伸長（MT培養(yǎng)基，35 d）；

D、E、F.在添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L KT 的MT培養(yǎng)基中腋芽各階段分化情況（25、35、45 d）

由不同濃度KT與6-BA對莖段腋芽分化的影響關系（見表1）可知，在單獨添加6-BA的培養(yǎng)基中，當6-BA濃度為1.0 mg/L時分化率為65%，增殖系數(shù)為0.87；在單獨添加KT的培養(yǎng)基中，當KT濃度為1.0 mg/L時分化率為51.67%，增殖系數(shù)為0.72；在同時添加1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L KT的MT培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，芽分化效果達到最佳，分化率達76.67%，增殖系數(shù)為1.22。結(jié)果表明，以莖段為外植體時，同時添加1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L KT的 MT培養(yǎng)基中腋芽分化效果最佳。

2.3" 比較不同培養(yǎng)基和不同生長素對四倍體資陽香橙誘導生根的影響

將已形成莖葉的組培苗轉(zhuǎn)入含有生長素的生根培養(yǎng)基中，誘導組培苗生根。本實驗選用1/2MS、1/2MT和MT三種類型培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的IBA、NAA和0.2% AC（活性炭）對四倍體資陽香橙進行60 d的生根培養(yǎng)（見圖4、圖5）。60 d后對四倍體資陽香橙組培苗根系觀察發(fā)現(xiàn)：在1/2MS培養(yǎng)基中添加IBA時根系多為短粗且無側(cè)根（圖4A、D）；在1/2MT培養(yǎng)基中添加IBA時根系多為單根且細長（圖4B、E）；在1/2MT培養(yǎng)基中添加NAA時根系均短粗且有側(cè)根（圖4C、F）；而在MT培養(yǎng)基中添加NAA時均生成短粗的簇狀根（圖5），且隨著NAA濃度增大上部莖葉生長受到明顯的抑制（圖5A、B、C），同時對根的生長抑制作用也增強（圖5D、E、F）。如表2所示，在未添加任何激素的3種培養(yǎng)基中，1/2MS培養(yǎng)基的誘導率為3.70%，最早出根天數(shù)為50 d；而1/2MT培養(yǎng)基的誘導率為7.41%，最早出根天數(shù)為45 d；MT培養(yǎng)基的誘導率為7.41%，最早出根天數(shù)為60 d。在1/2MS培養(yǎng)基中添加生長素NAA和在MT培養(yǎng)基中添加生長素IBA時均沒有生根。結(jié)果顯示，與1/2MS、MT培養(yǎng)基相比，1/2MT培養(yǎng)基誘導出根效果較好。綜上，以1/2MT為生根培養(yǎng)基，添加2.0 mg/L NAA和0.2% AC時，誘導效果最佳，最早出根天數(shù)為10 d，生根率高達92.59%。

2.4" 移栽馴化和四倍體鑒定

進行生根培養(yǎng)60 d后將生長狀態(tài)良好的四倍體資陽香橙組培苗進行移栽和馴化。組培苗移栽前在組培室中進行4 d練苗，瓶蓋半敞48 h，完全敞開48 h，之后用鑷子將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，蒸餾水沖洗干凈根部殘留的培養(yǎng)基。接著移栽至基質(zhì)中（基質(zhì)配比為蛭石∶珍珠巖∶營養(yǎng)土=1∶1∶1） （圖6A、C），蒸餾水澆透后用保鮮膜輕輕覆蓋保濕，此后每2 d噴灑適量的蒸餾水，持續(xù)14 d后完全去掉保鮮膜。經(jīng)60 d馴化的組培苗葉片翠綠，植株挺拔（圖6B、D）。染色體計數(shù)法鑒定顯示，馴化苗染色體數(shù)為36，是二倍體資陽香橙的兩倍（2n=4x=36）（圖6E、F）。本實驗共移栽組培苗46株，移栽成活率為95.7%。

3" 討論

柑橘多數(shù)品種珠心胚會發(fā)生基因組自然加倍而形成多倍體現(xiàn)象，但是頻率極低，限制了多倍體在生產(chǎn)上的應用，利用無性繁殖技術可以在短期內(nèi)獲得大量的多倍體個體。常見的無性繁殖技術包括扦插、嫁接和組織培養(yǎng)。無性繁殖因其繁殖速度快、周期短、且能保持親代的優(yōu)良性狀，多應用在瀕危植物及珍稀植物的種質(zhì)資源保存中。其中植物組織培養(yǎng)在一定程度上縮短植物生長周期、繁殖率高而被廣泛使用。但目前柑橘類的組織培養(yǎng)相關研究都僅限于在普通二倍體柑橘當中。

研究表明，柑橘芽的誘導率不僅與品種、植物激素類型及濃度、培養(yǎng)條件等相關外，還與選擇的外植體有著密切關系。本文分別選取四倍體資陽香橙的幼芽和莖段為外植體，利用相同的培養(yǎng)基和植物激素，通過微扦插發(fā)現(xiàn)，幼芽的芽增殖效果優(yōu)于莖段。文露清等以苗齡為35 d的金柑上胚軸為實驗材料，在添加有2.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L KT的MT培養(yǎng)基中芽誘導率為90%，陳國華等以紅江橙、沙糖桔的頂芽外植體為實驗材料，在MT培養(yǎng)基中附加3.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L KT芽誘導率為81%；而張家銀等選用椪柑成年態(tài)節(jié)間莖段為實驗材料時，在MS培養(yǎng)基中附加1.0 mg/L 6-BA的芽誘導率僅為12%。因此，選取實生苗的上胚軸誘導率最高，其次是頂芽，誘導率最低的為成年態(tài)節(jié)間莖段。這與本文的研究結(jié)果一致，選取幼芽為外植體時，增殖率高于莖段。

植物激素在植物生長過程中起著關鍵的調(diào)節(jié)作用，但過高的植物激素對植物生長有著抑制作用。賀紅等發(fā)現(xiàn)高濃度的6-BA不僅抑制芽的形成，還對植株本身產(chǎn)生毒害作用，這與本文的研究結(jié)果一致，當6-BA的濃度升至3 mg/L時，部分植株開始變黃、死亡，出芽率僅為13.33%（圖2A）。IBA和NAA作為可以促進根生長的生長素，在根的誘導中有著及其重要的作用。陳力耕研究發(fā)現(xiàn)，在添加有微量的NAA的培養(yǎng)基中生根效果最好；敖小平等在關于大紅甜橙的報道中總結(jié)到，培養(yǎng)基中加入高濃度的NAA時，不定芽基部顯著膨大，生根慢，白色根粗壯而短小呈簇狀，葉片逐漸枯亡；同樣，賀紅等在MT培養(yǎng)基中添加高濃度的NAA時發(fā)現(xiàn)，根的生長過于旺盛，產(chǎn)生簇狀根，從而嚴重影響上部莖葉的生長。因此，低濃度的NAA可以使誘導的不定根形態(tài)正常且不影響上半部植株的生長，高濃度的NAA會使葉片逐漸枯萎，植株死亡。本文采用附加有2.0 mg/L NAA的1/2MT培養(yǎng)基，誘導生根率為92.59%生根系數(shù)為1.33（見表2）。

除了生長素類型和濃度對生根有影響外，培養(yǎng)基與激素類型共同作用也存在著一定的影響。本研究中以1/2MS培養(yǎng)基添加NAA為生根培養(yǎng)基時，未出根。這可能是由于NAA在大量元素減半的MS培養(yǎng)基中對四倍體資陽香橙組培苗生根具有抑制作用，智邵川等在對構(gòu)樹的組培苗生根的研究中也發(fā)現(xiàn)，當MS培養(yǎng)基中的大量元素減少到1/4時，在添加NAA后也同樣出現(xiàn)根抑制生長的情況；而在MT培養(yǎng)基可能是由于無機鹽含量過高，本身不利于生根，與IBA協(xié)同作用抑制了根的生長。

4" 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，幼芽比莖段誘導增殖效果更佳，在MT+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT培養(yǎng)基中芽增殖效果最佳，誘導率和增殖系數(shù)分別為91.67%和1.83；在1/2MT+2.0 mg/L NAA+0.2% AC中生根效果最佳，生根率為92.59%，移栽成活率為95.7%。本研究為短期內(nèi)快速繁殖大量四倍體資陽香橙奠定了基礎。

［" 參" 考" 文" 獻" ］

SONG Can，LIU Shaojun，XIAO Jun，et al.Polyploid organisms.Science China Life Sciences，2012，55（4）：301-311.

黨江波，梁國魯，李彩，等.果樹多倍體砧木的研究現(xiàn)狀與展望.園藝學報，2019，46（9）：1701-1710.

韋同路.枳同源四倍體抗逆機理解析及兩個脅迫響應基因功能鑒定.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2020.

ALLARIO T，BRUMOS J，COLMENERO-FLORE J M，et al.Tetraploid Rangpur lime rootstock increases drought tolerance via enhanced constitutive root abscisic acid production.Plant Cell amp; Environment，2013，36（4）：856-868.

OUSTRIC J，MORILLON R，F(xiàn)RANCOIS L，et al.Tetraploid Carrizo citrange rootstock（Citrus sinensis Osb.×Poncirus trifoliata L. Raf.）enhances natural chilling stress tolerance of common clementine（Citrus clementina Hort. ex Tan）.Journal of Plant Physiology，2017，214：108-115.

ZHANG Xiaoyi，HU Chungen，YAO Jialing.Tetraploidization of diploid Dioscorea results in activation of the antioxidant defense system and increased heat tolerance.Journal of Plant Physiology，2010，167（2）：88-94.

LIU Beibei，SUN Genlou.microRNAs contribute to enhanced salt adaptation of the autopolyploid Hordeum bulbosum compared with its diploid ancestor.The Plant Journal，2017，91（1）：57-69.

RUIZ M，QUINONES A，MARTINEZ-ALCANTARA B，et al.Effects of salinity on diploid （2×） and doubled diploid （4×） Citrus macrophylla genotypes.Scientia Horticulturae，2016，207：33-40.

TU Yi，JIANG Aiming，GAN Lu，et al.Genome duplication improves rice root resistance to salt stress.Rice，2014，7（1）：15.

BALAL M R，SHAHID A M，VINCENT C，et al.Kinnow mandarin plants grafted on tetraploid rootstocks are more tolerant to crtoxicity than those grafted on its diploids one.Environmental and Experimental Botany，2017，140：8-18.

蔣景龍，陽妮，李麗，等.衢州香橙四倍體種質(zhì)發(fā)掘及形態(tài)特征性評價.果樹學報，2021，38（5）：655-663.

任可心，蔣景龍，陽妮，等.酸橙同源四倍體種質(zhì)發(fā)掘及形態(tài)特征分析.中國南方果樹，2022，51（5）：20-26.

張成磊，周銳，謝善鵬，等.山金柑實生后代四倍體發(fā)掘及形態(tài)和代謝評價.植物科學學報，2022，40（1）：47-53.

周銳，解凱東，王偉，等.依據(jù)多倍體形態(tài)特征快速高效發(fā)掘柑橘四倍體.園藝學報，2020，47（12）：2451-2458.

彭瀅.枳橙四倍體資源發(fā)掘、鑒定及耐旱性評價.贛州：贛南師范大學，2020.

蘇甜，許俊強，張應華，等.水果黃瓜再生體系的建立.現(xiàn)代園藝，2023，46（7）：4-5.

張健，王璐，袁嘉瑋，等.魯麗蘋果植株再生體系的建立.種子，2022，41（9）：127-133.

楊文靜，王占軍，甘曉燕，等.歐李高效再生體系的建立.中國農(nóng)學通報，2022，38（13）：60-65.

KOBAYASHI A K，BESPALHOK J C，PEREIRA L，et al.Plant regeneration of sweet orange （Citrus sinensis） from thin sections of mature stem segments.Plant Cell Tissue and Organ Culture，2003，74（1）：99-102.

敖小平，熊興耀，胡新喜，等.高效的“大紅”甜橙實生苗上胚軸離體培養(yǎng)與植株再生體系的建立.植物生理學通訊，2007，43（4）：689-692.

陳國華，陳冬怡，馬文卿，等.柑橘脫毒快繁及微芽嫁接技術試驗研究.農(nóng)業(yè)工程，2017，7（2）：129-132.

TAN Fengquan，TU Hong，LIANG Wujun，et al.Comparative metabolic and transcriptional analysis of a doubled diploid and its diploid citrus rootstock （C.junos cv.Ziyang xiangcheng） suggests its potential value for stress resistance improve-ment.BMC Plant Biology，2015，15：89.

計長遠，彭長江.中國柑桔抗堿砧木之王——資陽香橙.四川農(nóng)業(yè)科技，2008（11）：38-39.

WU Juxun，CAO Junying，SU Mei，et al.Genome-wide comprehensive analysis of transcriptomes and small RNAs offers insights into the molecular mechanism of alkaline stress tolerance in a citrus rootstock.Horticulture Research，2019，6：33.

FU Xingzheng，ZHANG Xiaoyong，QIU Jieya，et al.Whole-transcriptome rna sequencing reveals the global molecular responses and ceRNA regulatory network of mRNAs，lncRNAs，miRNAs and circRNAs in response to copper toxicity in Ziyang xiangcheng （Citrus junos sieb. ex tanaka）.BMC Plant Biology，2019，19：509.

AI S，HALEH HS，AMIR M，el al.A reliable and efficien protocol for inducing haiy roots in Papaver bracteamtum.Plant Cell Tissue and Organ Culture，2013，113（1）：1-9.

LAN Hong，CHEN Chunli，MIAO Yin，et al.Fragile sistes of ‘Valencia’ sweet orange（Citrus sinensis）chromosomes are relate with active 45s rDNA.PloS one，2016，11（3）：e0151512.

蘭彥平，顧萬春.林木無性繁殖研究進展.世界林業(yè)研究，2002（6）：7-13.

文露清，楊莉，胡威等.金柑高效再生體系的建立.中國園藝文摘，2011，27（2）：10-12.

張家銀，郭琛，謝玉明，等.椪柑成年態(tài)節(jié)間莖段再生體系的建立.湖南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2008，34（2）：182-185.

賀紅，韓美麗，何亞文，等.紅江橙不同外植體離體培養(yǎng)的研究（簡報）.熱帶亞熱帶植物學報，1997（2）：85.

陳力耕.柑桔實生苗大量增殖研究.亞熱帶植物通訊，1990（2）：40-45.

智邵川，石嶺.不同培養(yǎng)基對構(gòu)樹組培苗生根的影響.山西農(nóng)業(yè)科學，2020，48（8）：1207-1210.

［責任編輯：謝 平］

Establishment of a tetraploid Citrus.junos cv.Ziyang orange rapid propagation system

WANG Qian1，" JIANG Jinglong1，2，" QIN Gongwei1，2，3，" WEI Lina1，3，" HU Jia1

1.School of Biological Sciences and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723000， China;

2.Shaanxi Key Laboratory of Bio-resources， Hanzhong 723000， China;

3.Qinba State Key Laboratory of Biological Resources and Ecological Environment （Incubation）， Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000， China

Abstract：" Using tetraploid Citrus.junos cv.Ziyang orange bud and stem segments were used as explants， different plant hormone combinations were optimized through micro cutting technology to establish an efficient rapid propagation system. The results shows that the germination proliferation is the best when MT medium with 1.0 mg/mL 6-BA+0.1 mg/mL KT and the proliferation rate is up to 91.67% and the proliferation coefficient is 1.82 after 45 days. With stem segments as explants， MT medium with 1.0 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL KT hads the best axillary bud differentiation， the axillary bud differentiation rate is 76.67% and proliferation coefficient is 1.22 after 45 days. The 1/2 MT medium with 2.0 mg/mL NAA+0.2% AC （activated carbon） has the best effect on inducing rooting， with a rooting rate of 92.59% after 60 days. 46 seedlings are transplanted and domesticated with the result of 95.7% survival rate . With the root tip chromosome compression counting method， the tissue cultured seedlings obtained are tetraploid Citrus.junos cv.Ziyang orange. A high-efficiency sexual reproductive system for tetraploid Citrus.junos cv.Ziyang orange is built in this research， providing a reference for subsequent polyploid research and production practice.

Key words：" tetraploid; Citrus.junos cv.Ziyang orange; rooting rate; proliferation coefficient; domestication