份香蕉種質(zhì)資源SRAP分子標(biāo)記親緣關(guān)系分析

周海琪　夏玲　呂順　曾莉莎　王芳　黃曉彥　陳東儀　劉文清　梁少麗　劉麗琴

關(guān)鍵詞：香蕉；SRAP；聚類分析；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)：S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

香蕉是目前世界上產(chǎn)量和貿(mào)易量最大的水果之一，也是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物[1]。香蕉味道香甜，營養(yǎng)豐富，物美價(jià)廉，深得人們喜愛，而且香蕉植株優(yōu)美，也常被人們用來裝點(diǎn)環(huán)境。我國是香蕉的原產(chǎn)地之一，具有豐富的種質(zhì)資源，同時(shí)也具有悠久的栽培歷史。目前香蕉的栽培品種主要有香牙蕉、龍牙蕉、貢蕉、粉蕉和大蕉，這些品種基本由尖葉蕉（Musaacuminata Colla，A 基因組）和長梗蕉（Musabalbisiana Colla，B 基因組）這2 個(gè)野生品種發(fā)展而來[2]，染色體倍性包含二倍體、三倍體（主要）和四倍體。由于來源、地域、育種手段等因素，不同的香蕉品種間的遺傳背景存在差異。香蕉一直沿用SIMMONDS[3]的分類方法來識(shí)別和分類不同的香蕉品種，但是隨著研究的深入和研究技術(shù)手段的更新，這種單一的、依靠形態(tài)特征的分類方法已經(jīng)無法滿足對(duì)香蕉親緣關(guān)系和遺傳多樣性等研究的需求，甚至對(duì)研究造成一定的阻礙，如香蕉品種的分類分組與基因組組成不完全一致[4]，影響香蕉種質(zhì)資源的合理利用。因此，結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)鑒定香蕉種質(zhì)資源、分析其親緣關(guān)系和研究遺傳多樣性是非常必要的。

國內(nèi)外關(guān)于運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)來研究香蕉種質(zhì)的報(bào)道眾多，SSR、AFLP、ISSR、RAPD、SRAP等分子標(biāo)記[5-9]被應(yīng)用在分析香蕉品種（系）的種群鑒定與分類、遺傳多樣性等方面。SRAP 技術(shù)是一種基于PCR 的分子標(biāo)記技術(shù)[10]，具有簡便、快速、引物設(shè)計(jì)簡便、多態(tài)性和信息量豐富等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于園藝植物遺傳育種[11]、作物改良[12]、果樹種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析[13-17]等方面。謝子四等[18]利用SRAP標(biāo)記對(duì)29 份香蕉材料進(jìn)行了基因組多態(tài)性分析，擴(kuò)增出324 條可辨認(rèn)條帶，多態(tài)性比率為80.86%；漆艷香等[9]應(yīng)用SRAP 標(biāo)記對(duì)21 份香蕉種質(zhì)的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析。但這些報(bào)道都以少量或地方代表的個(gè)別品種為試驗(yàn)材料，不夠系統(tǒng)和全面。本研究采用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)，以89 份來至國內(nèi)外的香蕉種質(zhì)，包括香牙蕉、龍牙蕉、貢蕉、大蕉、粉蕉和不同類型的野蕉等多種香蕉類型為材料，探討各類型、品種之間的親緣關(guān)系，為香蕉育種、品種鑒定、新品種保護(hù)等提供分子水平上的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試89 份材料取自東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心的香蕉種質(zhì)資源圃和麻涌試驗(yàn)基地，89 份香蕉種質(zhì)資源樣品的基因型和來源見表1，SRAP 引物序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，DL2000 DNA marker、dNTPs、Taq DNA 聚合酶，10×Buffer 等均購自TranGene 公司。

1.2 方法

1.2.1 香蕉基因組DNA 的提取及檢測(cè) 取香蕉幼嫩的新葉，采用改良的CTAB 法[19]提取DNA，經(jīng)蛋白核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA 濃度與純度后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量，最后將DNA 稀釋至所需濃度置于?20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP 引物的篩選及PCR 擴(kuò)增 運(yùn)用SRAP 分子標(biāo)記引物（10 個(gè)正向引物和10 個(gè)反向引物兩兩組合成100 對(duì)引物組合，表2），以5 份香蕉品種為模板，對(duì)100 對(duì)引物進(jìn)行篩選，每個(gè)引物重復(fù)2～3 次，篩選能擴(kuò)增出多態(tài)性好且條帶多的最適合引物組合。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-lePCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系：20 μL 的PCR 反應(yīng)體系含有10×buffer （含Mg²⁺）2 μL，0.2 mmol/LdNTPs（2.5 nmol/L）2 μL，上、下引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA（20 ng/L）2 μL 及Taq DNA 聚合酶1 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，加入4 μL 6×loading buffer，取8～10 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電極緩沖液為0.5×TBE，在凝膠成像儀中觀察并照相。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)過2～3 次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)穩(wěn)定可靠的多態(tài)性位點(diǎn)，擴(kuò)增條帶在同一位置不同樣品中，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，建立（0，1）矩陣，用Ntsys 軟件采用UPGMA（unweghed pair methodairthtnetic average）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 89 份香蕉種質(zhì)資源基因組DNA 的檢測(cè)

將提取的89 份香蕉樣品基因組DNA 采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示香蕉基因組DNA 主帶明顯，呈現(xiàn)一條完整發(fā)亮的譜帶，無降解拖尾現(xiàn)象。經(jīng)核酸蛋白儀檢測(cè)后，所得DNA母液OD₂₆₀/OD₂₈₀ 在1.8 左右，OD₂₆₀/OD₂₃₀≥2.0，濃度在1000～1800 ng/μL 之間，表明所提取的香蕉基因組DNA 完整性較好，純度高，無小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)的污染，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。將DNA 分裝至PCR 管中備用，用時(shí)稀釋至30 ng/μL。

2.2 香蕉SRAP 引物篩選及PCR 擴(kuò)增

利用表2 所列的正反引物各10 條，共100 對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，以其中擴(kuò)增條帶易于識(shí)別、帶型清晰、多態(tài)性高的13 對(duì)引物對(duì)供試材料進(jìn)行分析。結(jié)果表明，13 對(duì)引物共擴(kuò)增出170 條條帶，平均每對(duì)引物13.08 條，其中多態(tài)性帶共140 條（圖1，圖2）。各引物產(chǎn)生的多態(tài)性帶比例為64.3%～92.9%，平均為79.0%（表3）。

2.3 遺傳相似性系數(shù)分析

在遺傳相似系數(shù)矩陣中，89 份香蕉種質(zhì)資源的相似系數(shù)的變化范圍在0.241～1.000 之間，在這些香蕉種質(zhì)中，8818 與天寶野蕉、8818 與羅壩大蕉、羅壩大蕉與夫人指、畦頭大蕉與紅研2 號(hào)、矮大蕉與粵豐1 號(hào)的相似系數(shù)最低，為0.241。海貢和貢蕉相似性系數(shù)最高，為1.000，其SRAP 分子標(biāo)記帶型基本一致，但在田間表現(xiàn)中，海貢和貢蕉是有一定差異的，海貢具有枯萎病抗性，而貢蕉是感病品種。究其原因一方面可能我們采用的SRAP 分子標(biāo)記位點(diǎn)還比較少，不足以區(qū)分這2 個(gè)品種，另一方面也有可能樣品混淆，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。此外，分別來自于云南和廣西的云南那邦和廣西憑祥相似性系數(shù)為0.983，同時(shí)來自于云南的野蕉1 號(hào)與這2 個(gè)種質(zhì)資源的相似性系數(shù)也在0.900 以上，這3 個(gè)品種均為BB 類野蕉，親緣關(guān)系較近。五指山1 號(hào)和五指山2 號(hào)相似性系數(shù)為0.983，五指山3 號(hào)與五指山1 號(hào)和2 號(hào)的相似性系數(shù)相對(duì)較低，分別是0.81 和0.828，親緣關(guān)系也比較近，五指山1 號(hào)、五指山2 號(hào)及五指山3 號(hào)是課題組在海南五指山不同地點(diǎn)采的樣品，均為阿寬蕉類野生蕉。可見這些種質(zhì)資源的遺傳多樣性非常豐富，香蕉種質(zhì)資源的親緣關(guān)系很復(fù)雜，而并不是簡單的平行關(guān)系。

2.4 親緣關(guān)系聚類分析

采用NTSYSpc 2.10 t 軟件對(duì)SRAP 標(biāo)記統(tǒng)計(jì)后的綜合結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立樹狀圖（圖3）。在相似性系數(shù)為0.49 時(shí)，可以將89 份香蕉種質(zhì)資源分為六大類群。

第一大類群：主要包括香牙蕉、貢蕉、龍牙蕉、AA 型野蕉，基因型主要為AAA 型、AAB型和AA 型，共33 份種質(zhì)資源，在相似性系數(shù)為0.65 處可以將此大類分為四大亞類。第一亞類包括G30、NK4-1、海貢、貢蕉、河口龍牙（貴妃蕉）、夫人指、1442、漳選2 號(hào)、漳選8-2、1443、8818、巴西、天寶矮蕉、大蜜舍、泰國、菲律賓、粵優(yōu)抗1 號(hào)、泰國貢蕉、catas1、佳麗、LF、飛亞（飛亞-25）、粵豐1 號(hào)、catas5、金指、紫莖蕉、金沙香、玫瑰蕉、紅研2 號(hào)；第二亞類包括佛手蕉、過山香；第三亞類是千指蕉；第四亞類是紫花蕉（美葉芭蕉）。

第二大類群：主要包括粉蕉、粉大蕉、BB型野蕉，基因型主要為ABB 型，共21 份種質(zhì)資源；在相似性系數(shù)為0.64 處可以將此大類分為二大亞類。第一亞類包括粉雜1 號(hào)、孟加拉粉大蕉、千蒡培、灰大蕉、增城野蕉、云南那邦、廣西憑祥、野蕉1 號(hào)、孟加拉菜、五山野蕉、馬來西亞粉蕉、BB 野蕉、南海粉大蕉、東莞粉大蕉、銀豐1 號(hào)、棱指蕉、四方大蕉、大粉蕉；第二亞類包括天寶野蕉、東莞細(xì)粉、沙巴。

第三大類群：主要包括大蕉、阿寬蕉類野蕉以及芭蕉類野蕉，共32 份種質(zhì)資源。在遺傳距離為0.64 處可以將此大類分為五大亞類。第一亞類包括云南牛角蕉；第二亞類包括矮大蕉、羅壩大蕉、飯芭蕉、三江大蕉、番禺大蕉、廣西中把大蕉、封開大蕉、東莞高把大蕉、興隆酸蕉、木棉蕉、牛芭蕉、中山大蕉、潮州大蕉、海南芭蕉、柴蕉、巴馬高把大蕉、五指山1 號(hào)、五指山2 號(hào)、五指山3 號(hào)、防城大蕉、海南牛角蕉、畦頭大蕉；第三亞類包括阿寬野蕉、龍巖野蕉、三明野蕉、云南漾濞、廣寧野蕉；第四亞類包括賓陽野蕉、龍州野蕉；第五亞類包括盛2、芭蕉。

第四、五、六類群：都只包含了1 份種質(zhì)資源，分別是紅花蕉、地涌金蓮、蝎尾蕉。

3 討論

香蕉種質(zhì)資源豐富，種類品種繁多，然而由于特殊的生物學(xué)特性如多倍體、無性繁殖、營養(yǎng)結(jié)實(shí)、小染色體等[18]，使其種質(zhì)資源的分類及系統(tǒng)學(xué)研究一直是個(gè)難題。本研究以香牙蕉、龍牙蕉、大蕉、粉蕉和不同類型的野蕉，基因型主要包括AA、BB、AAA、AAB、ABB 和AAAA 等類型的89 份香蕉種質(zhì)資源為材料，運(yùn)用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)研究不同香蕉種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系。由10 個(gè)正向引物和10 個(gè)反向引物兩兩組合成100 對(duì)引物組合，從中篩選出13 對(duì)擴(kuò)增條帶易于識(shí)別、帶型清晰、多態(tài)性高的SRAP 引物，這13 對(duì)引物在89 個(gè)香蕉種質(zhì)資源間擴(kuò)增出170 條可辨認(rèn)條帶，其中表現(xiàn)出多態(tài)性的帶有140 條，多態(tài)性比率為79.00%。

在相似性系數(shù)為0.49 時(shí)，可以將這89 份香蕉種質(zhì)資源分成六大類，包括：香牙蕉、貢蕉、龍牙蕉、AA 型野蕉為主的第一大類（AAA、AA、AAB 基因型型），粉大蕉、粉蕉和BB 型野蕉為主的第二大類（ABB、BB 基因型），大蕉、阿寬蕉類野蕉為主的第三大類，紅花蕉、地涌金蓮、蝎尾蕉、分別所屬的第四、五、六類群，該方法的分類結(jié)果與傳統(tǒng)的基于形態(tài)的分類結(jié)果基本一致，說明用SRAP 標(biāo)記對(duì)香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行分類是可行的。但該研究中發(fā)現(xiàn)部分香蕉種質(zhì)的分類分組并沒有與品種的基因組組成一致，例如，以巴西為代表的AAA 型香牙蕉、以貢蕉為代表的AA 型及以龍牙蕉為代表的AAB 型聚類群體并不明顯，均分散在第一類。三者在遺傳上沒有太大的差異，說明栽培類香牙蕉、貢蕉和龍牙蕉具有相同的祖先，與AA 基因型野蕉親緣關(guān)系近，這與寧淑萍等[20]利用SSR 技術(shù)分析的結(jié)果一致。粉蕉及粉大蕉（ABB 型）聚為一類，可見二者遺傳背景相似，與BB 基因型的野蕉親緣關(guān)系較近，但無法明顯區(qū)別是否含A 基因組，這與郭計(jì)華[21]的研究結(jié)果相似。不同基因組成的香蕉品種聚到一起，也說明香蕉品種的親緣關(guān)系可能與起源有關(guān)。前人利用細(xì)胞遺傳學(xué)方法[22]、RFLP 分子標(biāo)記[23-24]和SSR分子標(biāo)記[25-26]方法對(duì)香蕉品種資源進(jìn)行分類分析，也發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用傳統(tǒng)SIMMONDS[3]分類法命名的基因組型結(jié)果不一致。香牙蕉（AAA）、大蕉（ABB）、粉蕉（ABB）和龍牙蕉（AAB）都是根據(jù)形態(tài)學(xué)性狀分類而籠統(tǒng)地確定基因組類型，難免會(huì)造成同物異名、同名異物的現(xiàn)象[27]，也說明使用單一的分類方法無法明確地把香蕉種質(zhì)區(qū)分，還需要從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)方面作進(jìn)一步的研究和鑒定。

早期研究認(rèn)為大蕉基因組為ABB 或者BBB，項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)大蕉倍性值（或DNA 相對(duì)含量）平均高于其他ABB 基因型資源，而且利用大蕉與長梗蕉人工雜交的后代均為四倍體，而粉蕉與長梗蕉的雜交后代為三倍體或四倍體[28]，說明大蕉與ABB 基因型資源有所差別。但是，項(xiàng)目組在進(jìn)行B 基因組相關(guān)的SCAR 標(biāo)記的研究中又發(fā)現(xiàn)大蕉是含有A 和B 基因組的[29]。在本研究中21 份大蕉和10 份阿寬蕉聚到同一類，說明大蕉和阿寬蕉親緣關(guān)系較近，但是從整個(gè)聚類圖中無法看出大蕉是否含有A 和B 基因組，可見，大蕉的遺傳背景及起源比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。