神黃豆種子休眠及解除方法研究

楊江敏 李富榮 余貴湘 張恩向 董詩凡 蔡文良 刀保輝

摘要 為探究神黃豆種子的休眠原因及解除方法，對(duì)神黃豆種子的生物學(xué)特性和萌發(fā)抑制物進(jìn)行觀測(cè)，采用熱水、濃硫酸和赤霉素（GA3）浸泡處理，打破種子休眠。結(jié)果表明：神黃豆種子為橢圓形，種皮黃褐色，千粒重為378.66 g，含水量為9.97%，種子生活力為100%，發(fā)芽潛力較大。完整種子浸泡215 h后，吸水率僅為0.57%，透水性較差。種皮和種胚的甲醇浸提液，對(duì)白菜種子的萌發(fā)和幼苗根長(zhǎng)的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。經(jīng)98%濃硫酸浸泡10 min，種子發(fā)芽率最高（53.33%），用不同溫度熱水浸泡至自然冷卻，萌發(fā)促進(jìn)作用較小，發(fā)芽率最高僅為5.56%，GA3浸泡處理種子未萌發(fā)。種皮吸水障礙是神黃豆種子休眠的主要原因。4 ℃層積過程中，可溶性糖含量變化較小，25 ℃層積過程中，可溶性糖含量先上升后下降，可溶性蛋白質(zhì)和粗脂肪含量總體呈下降趨勢(shì)，且25 ℃層積過程中的減少速率更快，說明種子解除休眠過程中需要消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

關(guān)鍵詞 神黃豆；種子休眠；解除休眠

中圖分類號(hào) S722? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）10-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.10.028

Study on Dormancy and Release of Cassia agnes Brenan Seed

YANG Jiang-min，LI Fu-rong，YU Gui-xiang et al

（Dehong Prefecture Forestry Science Research Institute，Ruili，Yunnan 678600）

Abstract In order to explore the dormancy reason and dormancy release method of Cassia agnes seeds，in this research，we mainly studied the biological characteristics and germination inhibitors of C.agnes seeds，hot water，concentrated sulfuric acid and gibberellin （GA3） were used to break the seed dormancy.The results showed that the seed was elliptic，the seed skin was yellowish-brown，smooth and hard，the 1 000-seed weight was 378.66 g，the water content was 9.97%，the seed viability was 100%，and the germination potential was great.After soaking the whole seeds for 215 h，the water absorption rate was only 0.57%，which was significantly different from that of seeds broken skin.The methanol extract from the seed coat and seed embryo of C.agnes had significant inhibitory effects on the germination of Chinese cabbage seeds and the growth of seedling roots.The germination rate was higher （53.33%） when the seeds were soaked in 98% concentrated sulfuric acid for 10 min.Soaking seeds in the water with different temperature until natural cooling had little promoting effect on germination，and the highest germination rate was only 5.56%.The seeds soaked in gibberellin （GA3） can not promote the germination of seeds.The main reasons of C.agnes seeds dormancy were the water absorption barrier.During the stratification at four temperature，the soluble sugar content had little change，in the process of stratification at twenty-five temperature，the soluble sugar content first increased and then decreased，while the soluble protein and crude fat contents showed a decrease trend and the rate of decrease at twenty-five temperature stratification was faster，indicating that a large amount of nutrients were needed in the process of seed dormancy removal.

Key words Cassia agnes Brenan;Seed dormancy;Broken dormancy

基金項(xiàng)目 熱帶珍貴樹種種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 楊江敏（1990—），女，云南芒市人，工程師，碩士，從事林業(yè)草原培育和經(jīng)營(yíng)研究。*通信作者，工程師，碩士，從事林業(yè)草原培育和經(jīng)營(yíng)研究。

收稿日期 2023-08-18；修回日期 2023-10-25

神黃豆（Cassia agnes Brenan）為豆科（Leguminosae）決明屬（Cassia）喬木植物［1］，產(chǎn)于云南、廣西等省區(qū)以及中南半島的山地林中，喜高溫、陽光充足的環(huán)境［2］。神黃豆生長(zhǎng)快，抗性強(qiáng)，樹形優(yōu)美，夏季盛開時(shí)花團(tuán)錦簇，具有濃郁的芳香，花期較長(zhǎng)，具有較高的觀賞價(jià)值，是優(yōu)良的園林綠化樹種，同時(shí)還具有一定的藥理作用［3-6］。神黃豆的合理開發(fā)與推廣應(yīng)用對(duì)于豐富城市園林景觀及推進(jìn)植物藥理研究具有積極意義。神黃豆在云南地區(qū)有天然分布，多生于茂密的叢林中，自然條件下種子萌發(fā)比較困難，不利于進(jìn)一步開發(fā)利用。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)神黃豆的研究主要集中在果實(shí)、莖葉和莖部所含化合物的分離鑒定、藥理作用分析、引種栽培評(píng)價(jià)和樹種分類鑒別上，而有關(guān)神黃豆種子休眠原因及解除方法的研究鮮見報(bào)道。Nikolaeva［7］將種子休眠分為4種類型：種皮的阻礙作用引起休眠，種子成熟時(shí)胚未發(fā)育完全，種胚自身生理所致，混合因素引起的休眠。機(jī)械損傷種皮、熱水、濃硫酸、激素浸泡等方式能有效解除種子休眠［8-11］，層積處理能促進(jìn)種胚發(fā)育成熟，改變內(nèi)源激素含量，增強(qiáng)種子內(nèi)的呼吸作用等，打破種子休眠［12］。因此，筆者對(duì)神黃豆種子休眠原因、解除方法和層積過程中的生理指標(biāo)變化進(jìn)行研究，探索打破神黃豆種子休眠方法，以進(jìn)一步豐富神黃豆植物學(xué)研究方面的新資料，為基礎(chǔ)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2019年10月采自云南省瑞麗市武甸村的神黃豆種子為試驗(yàn)材料，采種后敲打莢果，取出帶瓤的種子，再剝?nèi)シN瓤，得出凈種，備用。該試驗(yàn)所用的種子均為同一家系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子形態(tài)特征。

隨機(jī)選取100粒種子，觀察其形狀、顏色和光滑度，總結(jié)種子形態(tài)特征。用游標(biāo)卡尺測(cè)定種子的長(zhǎng)度、寬度和厚度（精確到0.01 mm）。采用百粒法測(cè)量種子的千粒重［13］，測(cè)定9組。用SPSS 13.0進(jìn)行種子的形態(tài)變異分析。

1.2.2 種子含水量和吸水率。

隨機(jī)選取20粒種子進(jìn)行稱重，記為W1，烘干至種子重量保持不變，記為W2，重復(fù)3次。種子含水量（%）=（W1-W2）/W1×100%。

分別選取完整種子、破皮種子各20粒，稱重，于25 ℃的恒溫水浴箱中浸泡，間隔4 h取出稱重，夜晚8～10 h，直至重量穩(wěn)定，依次記錄。吸水率=［（濕重-干重）/干重］×100%。

1.2.3 種子生活力。

參考李炎坤等［14］的研究方法，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法測(cè)定種子生活力。隨機(jī)取30粒種子，破皮處理后，用蒸餾水浸泡32 h，使種子充分吸脹，再將種子剖成2瓣，露出種胚，取其中一半放入0.1% TTC溶液中，避光染色12 h，染色結(jié)束后立即觀察染色情況，對(duì)照種子用蒸餾水煮沸15 min，重復(fù)3次。

1.2.4 種子萌發(fā)特性。

參考閆芳［15］的方法，選取600粒種子，將種子分為2組，每組300粒，其中1組擦破種皮。將完整種子和破皮種子分別置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，黑暗條件下于培養(yǎng)箱（溫度25 ℃，濕度10%）中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。種子發(fā)芽以露白為標(biāo)志［16］，萌發(fā)期內(nèi)按時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。參考蔡年輝等［17］的方法計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、日均發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、平均發(fā)芽系數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、峰值、發(fā)芽值。

1.2.5 種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的粗提及生物測(cè)定。

參考趙敏等［18］的方法，將種子剝離為種皮和胚乳（含胚）2部分，分別制備0.1 g/mL浸提液，選取90粒白菜種子（云南祺合農(nóng)業(yè)科技有限公司，醉貴妃Q-6，純度95.0%，凈度98.0%，發(fā)芽率85%以上），分為3組，每組30粒，均勻放置在培養(yǎng)皿中，分別加入4 mL不同濃度（50%、75%、100%）的浸取液，重復(fù)3次，在恒溫培養(yǎng)箱（18 ℃）中進(jìn)行萌發(fā)，以蒸餾水處理為對(duì)照，24 h后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率（當(dāng)胚根長(zhǎng)度達(dá)到種子長(zhǎng)度的1/2時(shí)，記為發(fā)芽），72 h后測(cè)量白菜幼苗的莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)。

1.2.6 不同處理方法對(duì)神黃豆種子萌發(fā)的影響。

參考前人研究方法［19-21］，分別用3種不同溶液對(duì)種子進(jìn)行處理，熱水（100、90、80 ℃）浸泡至自然冷卻；濃硫酸溶液（98%、80%、70%）浸泡10 min，期間用玻璃棒持續(xù)攪拌，處理后在流水下沖洗種子1 h；GA3溶液（700、500、300mg/L）避光浸泡72 h，每個(gè)處理90粒種子，每組30粒，重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。以上試驗(yàn)以清水處理為對(duì)照，胚根突破種皮露白作為發(fā)芽標(biāo)志，每天記錄發(fā)芽情況。

1.2.7 不同溫度層積處理對(duì)生理指標(biāo)的影響。

取一定量的神黃豆種子放入50%多菌靈可濕性粉劑800倍液浸泡4 h，用清水沖洗后，按照3∶1的比例將種子與沙子混勻（含水量保持在50%左右），分別放入4和25 ℃的恒溫箱中進(jìn)行層積處理，每30 d取樣1次，分別測(cè)定種子可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脂肪的含量變化?？扇苄蕴呛坎捎幂焱壬y(cè)定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，粗脂肪含量使用索氏提取法測(cè)定［22］。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用Microsoft Excel 2003進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，方差分析選用SPSS 13.0，采用Tukey法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果分析

2.1 種子生物學(xué)特性

2.1.1 種子形態(tài)特征。

神黃豆種子為橢圓形，種皮黃褐色，光滑堅(jiān)硬，長(zhǎng)度為（10.79±0.55）mm，寬度為（8.19±0.53）mm，厚度為（5.74±0.65） mm，種子厚度的變異系數(shù)最大，達(dá)11.24%，長(zhǎng)度和寬度相對(duì)穩(wěn)定，千粒重為（378.66±2.61）g，9組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)為0.69%，無明顯的變異趨勢(shì)，顆粒重量較平均（表1）。

2.1.2 種子含水量。經(jīng)測(cè)定，

神黃豆種子的平均干種子重7.782 g，平均烘干重7.005 g，平均含水量為9.97%，含水量變化較小。

2.1.3 種子生活力。經(jīng)TTC染色法測(cè)定，參試的神黃豆種子生活力100%（圖1），發(fā)芽潛力高。

2.1.4 種子萌發(fā)特性。

破皮處理和完整的神黃豆種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、平均發(fā)芽系數(shù)、日均發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、峰值和發(fā)芽值差異極顯著（P＜0.01），平均發(fā)芽時(shí)間差異不顯著（P＞0.05）。破皮處理種子的平均發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽系數(shù)、日均發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、峰值和發(fā)芽值在發(fā)芽期內(nèi)均大于完整種子，說明破皮處理能有效促進(jìn)種子萌發(fā)（表2）。

2.2 神黃豆種子休眠原因

2.2.1 種子吸水率。破皮處理和完整種子吸水率差異極顯著（P＜0.01）。破皮種子吸水率隨浸種時(shí)間的延長(zhǎng)呈拋物線型變化，在0～48 h為快速吸水期，該階段吸水率達(dá)到116.7%，占吸水總量的75.8%，浸種167 h后，吸水量逐漸趨于飽和；完整種子浸泡215 h后，吸水率僅為0.57%，說明種子存在吸水障礙（圖2）。

2.2.2 種皮、種胚甲醇浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響。

由表3可知，種皮和種胚的甲醇浸提液對(duì)白菜種子的發(fā)芽率和幼苗根長(zhǎng)的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用（P＜0.05），且隨著浸提液濃度的升高抑制作用逐漸增強(qiáng)。種胚甲醇浸提液對(duì)白菜種子的萌發(fā)抑制作用高于種皮，浸提液濃度為0.100 g/mL時(shí)，白菜種子的萌發(fā)率分別為15.56%和10.00%，相比CK分別下降了82.27百分點(diǎn)和88.61百分點(diǎn)，白菜幼苗的根長(zhǎng)為3.27和5.46 mm，相比CK分別縮短了11.35和9.16 mm；種皮和種胚甲醇浸提液對(duì)白菜幼苗莖長(zhǎng)的抑制作用不明顯。

2.3 種子休眠解除方法

經(jīng)100、90、80 ℃熱水浸泡至自然冷卻，各處理間差異不顯著（P＞0.05），100 ℃熱水處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)為5.56%、3.33%、0.23，萌發(fā)促進(jìn)作用較??；98%、80%、70%濃硫酸處理10 min，期間用玻璃棒不斷攪拌，98%濃硫酸處理與80%濃硫酸處理間發(fā)芽勢(shì)的差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），98%濃硫酸、80%濃硫酸處理與70%濃硫酸處理間的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)差異顯著（P＜0.05），98%濃硫酸處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)最高，分別達(dá)到53.33%、36.66%、2.37，總體發(fā)芽情況較好；經(jīng)GA3浸泡的種子觀測(cè)期內(nèi)均未萌發(fā)（表4）。

2.4 不同溫度層積過程中生理指標(biāo)的變化

2.4.1 可溶性糖含量的變化。

從圖3可知，不同溫度層積處理可溶性糖含量變化差異極顯著（P＜0.01）。25 ℃層積過程中，0～30 d可溶性糖含量快速增加，30～60 d可溶性糖含量緩慢增加，在60 d時(shí)達(dá)到最大值86.7 mg/g，60～90 d可溶性糖含量迅速下降，120 d時(shí)下降至最小值3.3 mg/g。前期由于淀粉和脂肪的降解轉(zhuǎn)化，可溶性糖含量逐漸增加，第60天開始，部分種子開始萌發(fā)，種子呼吸作用增強(qiáng)，可溶性糖被胚利用或被種子呼吸作用消耗而降低。4 ℃層積過程中可溶性糖含量變化較小。

2.4.2 可溶性蛋白質(zhì)含量的變化。

從圖4可知，不同溫度層積處理蛋白質(zhì)含量變化差異極顯著（P＜0.01），層積過程中，可溶性蛋白質(zhì)含量總體呈下降趨勢(shì)，且25 ℃層積過程中下降速率較快，可溶性蛋白質(zhì)含量持續(xù)減少，說明可溶性蛋白質(zhì)被水解利用，為種子萌發(fā)提供能量。

2.4.3 粗脂肪含量的變化。

由圖5可知，不同溫度層積處理粗脂肪含量變化差異極顯著（P＜0.01）。

4 ℃層積過程中，0～30 d粗脂肪含量下降較快，與層積前相比下降約42.2%；25 ℃層積過程中，0～30 d粗脂肪含量與層積前相比下降約67.7%。粗脂肪含量前期快速下降，后期變化幅度較小，且25 ℃層積過程中的下降速率大于4 ℃層積處理，說明粗脂肪不斷分解轉(zhuǎn)化，為種子萌發(fā)提供能量。

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)的第一步是吸水［23］。曹運(yùn)梅等［9］報(bào)道了銅錢樹種子果殼和種皮存在機(jī)械障礙，未經(jīng)處理種子較難萌發(fā)。神黃豆完整種子浸泡215 h，吸水率僅為0.57%，說明種皮結(jié)構(gòu)致密，透水性差，阻礙了種子的吸水。種子內(nèi)源抑制物也是引起休眠的主要原因之一［24-25］。劉洋等［26］報(bào)道了烏蘇里鼠李種子內(nèi)部物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)存在抑制作用。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，神黃豆種皮和種胚的甲醇浸提液對(duì)白菜種子的萌發(fā)和幼苗根長(zhǎng)的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且隨著濃度的升高抑制作用逐漸增強(qiáng)，說明神黃豆種皮和種胚均存在抑制白菜種子萌發(fā)的物質(zhì)，至于該物質(zhì)成分及其對(duì)神黃豆自身萌發(fā)是否具有抑制作用有待于后續(xù)研究。王付娟等［27-28］研究表明，熱水和濃硫酸浸泡能夠有效促進(jìn)野生大豆、美麗決明和絨果決明種子萌發(fā)。神黃豆種子經(jīng)不同溫度熱水浸泡至自然冷卻，最高發(fā)芽率僅為5.56%；98%濃硫酸和80%濃硫酸浸泡處理種子10 min能有效提高種子萌發(fā)率；經(jīng)不同濃度GA3溶液浸泡處理后，種子均未萌發(fā)，可能是種皮阻礙了激素的作用。賴小連等［29］研究表明，刻傷夏蠟梅的種皮能夠有效提高發(fā)芽率。萌發(fā)試驗(yàn)中，擦破神黃豆種皮，種子萌發(fā)率達(dá)到99.33%，說明種皮的不透水性阻礙了種子萌發(fā)。淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等種內(nèi)貯藏物質(zhì)在相應(yīng)酶的作用下分解并轉(zhuǎn)化助力種子萌發(fā)，為種胚及幼苗的成長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與能量［30］。層積過程中，可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和粗脂肪含量總體呈下降趨勢(shì)，為種子萌發(fā)提供了能量來源。

綜上所述，擦破種皮和98%濃硫酸、80%濃硫酸浸泡處理10 min，能夠有效提高神黃豆種子的發(fā)芽率。種皮堅(jiān)硬、透性差是導(dǎo)致神黃豆種子休眠的主要原因，種皮和種胚甲醇浸提液對(duì)白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)影響試驗(yàn)中，雖然存在一定的抑制作用，但對(duì)神黃豆種子休眠的影響還需進(jìn)一步確定?？扇苄蕴?、可溶性蛋白質(zhì)和粗脂肪不斷分解轉(zhuǎn)化，表明貯藏物質(zhì)參與并調(diào)節(jié)了神黃豆種子休眠解除的過程，但不同溫度層積處理后種子發(fā)芽率與各生理指標(biāo)的內(nèi)在聯(lián)系還需進(jìn)一步試驗(yàn)和研究。

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