黃精種子萌發(fā)抑制物質(zhì)及其去除方法研究初探

邵財(cái) 劉繼永 劉寧 張亞玉

摘 要：為探討黃精種子抑制物質(zhì)生理活性及種子中抑制物質(zhì)的去除方法，采用乙酸乙酯、甲醇和水提取對(duì)黃精種子進(jìn)行浸提，并測(cè)定提取物對(duì)白菜幼苗生長(zhǎng)的抑制活性；用溫水浸種12，24，36 h，測(cè)定各處理黃精種子萌發(fā)率。結(jié)果表明，黃精種子浸提液（乙酸乙酯提取液除外）對(duì)白菜幼根及胚軸均有顯著抑制作用，且抑制物質(zhì)的活性隨著提取物濃度的增加而增強(qiáng)，其中水提取液的抑制活性高于甲醇提取液，黃精種子乙酸乙酯提取液對(duì)白菜幼苗無(wú)顯著抑制作用（P>0.05）；溫水浸種時(shí)間對(duì)黃精種子萌發(fā)時(shí)間及萌發(fā)率均產(chǎn)生顯著影響，其中溫水浸種24 h的種子，沙藏30 d種子完成萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)91%，而溫水浸種12 h和36 h處理組的種子，沙藏40 d種子完成萌發(fā)，萌發(fā)率分別為89%和79%。綜合分析表明，黃精種子中存在抑制物質(zhì)，用溫水浸泡可有效除去種子抑制物質(zhì)，以浸種24 h最佳。

關(guān)鍵詞：黃精；種子休眠；抑制物質(zhì)

中圖分類號(hào)：S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.005

Abstract： In order to study the bioassay of endogenous germination inhibitors and the removal method of inhibitors in Polygonatum sibiricum seeds， the P. sibiricum seeds were extracted by ethyl acetate， methanol and water， the effect of solvent extracts on Chinese cabbage seedlings was measured； the P. sibiricum seeds were presoaked 12， 24， 36 hours with the warm water， then the germination rate of each treatment was measured.The results showed that the extracts （except ethyl acetate extract） of P. sibiricum seeds had significant inhibitory effects on hypocotyl and radicle length of Chinese cabbage seedlings， and the inhibitory ratio was increased with the increase of extract concentration. The inhibitory effect of water extract was significant higher than methanol extract， and the ethyl acetate extract had no inhibition at any concentration（P>0.05）. The germination time and germination rate of P. sibiricum seeds were greatly influenced by the different soaking time of warm water. When the seeds were presoaked 24 h， the germination completed at 30 days in sand storage， and the germination rate was 91%. When the seeds were presoaked 12 h and 36 h ， the germination completed at 40 days， and the germination rates were 89% and 79%， respectively. These results suggested that there were inhibitory substances in P. sibiricum seeds and the inhibitors could be removed effectively by soaking with the warm water， and the optimum presoaked time was 24 h.

Key words： Polygonatum sibiricum； seed dormancy； inhibitors

黃精（Polygonatum sibiricum Red.）為百合科黃精屬多年生草本植物，俗稱“雞頭七”，“烏鴉七”，集藥用、食用和觀賞價(jià)值于一身，分布于東北、華北及陜西、寧夏、甘肅、山東等地[1]。黃精含有甾體皂苷、三萜皂苷、黃酮類、生物堿類、多糖類等多種成分[2]，2015版《中國(guó)藥典》收載，黃精以根莖入藥，具補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎的功效，可用于防治脾胃氣虛，體倦乏力，胃陰不足，口干食少，肺虛燥咳，勞嗽咳血，精血不足，腰膝酸軟，須發(fā)早白，內(nèi)熱消渴[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃精具有調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化及延緩衰老、降血糖、調(diào)血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[2]。近年來(lái)，由于對(duì)黃精的過(guò)度采挖，致使野生黃精資源銳減。為了滿足人們健康用藥的需要，人工栽培是解決黃精藥材短缺的主要途徑，但由于黃精種子存在休眠現(xiàn)象，多年來(lái)主要靠根莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，既浪費(fèi)商品藥材也導(dǎo)致其后代退化，而數(shù)量龐大的種子沒(méi)有被有效利用，不利于黃精大面積種植推廣。張躍進(jìn)等[4-5]針對(duì)黃精種子休眠問(wèn)題從種子外部形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)等方面已開(kāi)展了一定的研究工作，但關(guān)于種子抑制物質(zhì)活性方面報(bào)道較少。

本試驗(yàn)對(duì)黃精種子內(nèi)源抑制物質(zhì)活性及內(nèi)源抑制物質(zhì)去除方法進(jìn)行初步研究，以探討內(nèi)源抑制物質(zhì)對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響，為打破黃精種子休眠、提高其繁殖系數(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

2016年9月在吉林市左家鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)白山野生生物資源觀測(cè)站采集黃精種子；白菜種子購(gòu)于北京萬(wàn)隆裕豐種子有限公司。乙酸乙酯和甲醇為分析純，購(gòu)于北京化工廠。

1.2 方 法

1.2.1 黃精種子浸提物取 3份自然干燥的黃精種子（含水量為6.23%）各40 g，分別加入研缽研碎后，移入100 mL三角瓶中，分別加入50 mL乙酸乙酯、甲醇和蒸餾水，用封口膜密封，置于25 ℃，100 r·min-1搖床24 h，超聲波提取15 min；粗提液過(guò)濾后，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄔ俳?次；合并全部濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃減壓濃縮，最終定容50 mL，分別獲得乙酸乙酯、甲醇和水的提取液，質(zhì)量濃度均為0.8 g·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃精種子浸提物抑制活性測(cè)定 取上述0.8 g·mL-1種子浸提液，分別配制成質(zhì)量濃度為0.05，0.10，0.20，0.40 g·mL-14個(gè)濃度梯度的溶液，各取5.0 mL溶液至滅菌的培養(yǎng)皿（直徑11 cm，鋪有2層濾紙）中，待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后（水提液除外），每皿加入蒸餾水5 mL，對(duì)照組每皿加入蒸餾水5.0 mL（加入有機(jī)試劑揮干后的處理與蒸餾水對(duì)照組間無(wú)顯著性差異（P>0.05），數(shù)據(jù)未顯示），每皿放100粒白菜種子，每個(gè)處理重復(fù)3次，25 ℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量根長(zhǎng)及胚軸長(zhǎng)。

1.2.3 溫水浸種對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響 取3份自然干燥的黃精種子各60 g，放入250 mL三角瓶中，加入100 mL 蒸餾水，置于25 ℃，100 r·min-1搖床，每12 h更換一次蒸餾水，可獲得浸泡12，24，36 h的黃精種子，將種子置于22 ℃恒溫箱黑暗沙藏，分別于沙藏15，20，25，30，35，40 d取樣，測(cè)定黃精種子的萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SAS6.12軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，不同處理組間的差異顯著性分析采用Fishers LSD（least significant difference）法；抑制物質(zhì)活性計(jì)算參照Huang等[6]的方法進(jìn)行。

抑制活性=（1 - 處理組/對(duì)照組）×100% （1）

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精種子浸提物對(duì)白菜幼苗的影響

由表 1可知，黃精種子乙酸乙酯提取液在各個(gè)濃度對(duì)白菜的根長(zhǎng)和胚軸生長(zhǎng)均無(wú)抑制作用，表現(xiàn)為與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），而甲醇和水浸提液對(duì)白菜幼根和胚軸生長(zhǎng)均有顯著抑制作用，表明黃精種子中存在著生長(zhǎng)抑制物質(zhì)，且抑制物質(zhì)的活性隨著粗提物濃度的增大而增強(qiáng)。不同溶劑提取種子抑制物質(zhì)的活性以水提取液最強(qiáng)，甲醇提取液次之，當(dāng)提取液質(zhì)量濃度為0.05 g·mL-1時(shí)，水提取液顯著抑制白菜根長(zhǎng)（P<0.05），但對(duì)白菜胚軸生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用（P>0.05），水提取液與甲醇提取液之間對(duì)白菜幼苗的抑制活性無(wú)顯著性差異（P>0.05）；當(dāng)提取液質(zhì)量濃度為0.10 g·mL-1時(shí)，水提取液對(duì)白菜根長(zhǎng)抑制活性較甲醇提取液顯著提高了11.44個(gè)百分點(diǎn)（P<0.05），2種提取液均顯著抑制白菜胚軸的生長(zhǎng)（P<0.05），但二者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；當(dāng)提取液質(zhì)量濃度為0.40 g·mL-1時(shí)，水提取液較甲醇提取液對(duì)白菜胚根和胚軸的抑制活性分別顯著提高了9.79和14.04個(gè)百分點(diǎn)（P<0.05）?？梢?jiàn)，黃精種子浸提物對(duì)白菜幼根抑制作用高于對(duì)胚軸的抑制作用。

2.2 溫水浸種對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，溫水浸種時(shí)間對(duì)黃精種子萌發(fā)時(shí)間及萌發(fā)率產(chǎn)生明顯影響，其中溫水浸種24 h的處理在沙藏30 d時(shí)完成萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)到91%；而溫水浸種12 h和36 h處理組均在沙藏40 d完成萌發(fā)，萌發(fā)率分別為89%和79%。

3 結(jié)論與討論

王劍龍等[7]研究報(bào)道，黃精種子存在休眠特性。植物種子中存在萌發(fā)抑制物質(zhì)是導(dǎo)致種子休眠的一個(gè)主要因素[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃精種子含有活性較高的抑制物質(zhì)，對(duì)白菜幼根和胚軸均有顯著抑制作用，抑制物質(zhì)的生物活性隨質(zhì)量濃度（在試驗(yàn)范圍內(nèi)）的逐漸增大而增強(qiáng)，其中水提取液的抑制活性高于甲醇提取物，乙酸乙酯提取物對(duì)白菜幼苗無(wú)顯著抑制作用，故推斷黃精種子萌發(fā)抑制物質(zhì)為極性化合物。在植物種子休眠機(jī)制研究中，曾有報(bào)道推測(cè)植物種子中含有的不飽和內(nèi)酯、生物堿、氨、氰化物、有機(jī)酸、醛類、酚類等化合物可能是種子中的萌發(fā)抑制物質(zhì)[9]，明確黃精種子的萌發(fā)抑制物質(zhì)還需進(jìn)一步研究。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上根據(jù)一部分抑制物質(zhì)溶于水的特性，用水沖洗或浸洗種子來(lái)去除種子或果實(shí)中的抑制物質(zhì)。如防風(fēng)、桔梗、膜莢黃芪栽培生產(chǎn)一般播種前用40～45 ℃溫水浸種，間隔一段時(shí)間更換清水，可促進(jìn)種子提早萌發(fā)和出苗整齊，水浸種的作用不僅是軟化種皮提高其通透性，更重要的在于溫水浸種可浸泡出大量?jī)?nèi)源抑制物質(zhì)，降低內(nèi)源抑制物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用[10-12]。一些研究表明，對(duì)于非水溶性的抑制物質(zhì)，可以用有機(jī)試劑進(jìn)行沖洗或浸洗，如黃花烏頭、返魂草、狹葉柴胡等種子用乙醚、乙醇等浸種，再將種子用清水洗凈，可提高種子發(fā)芽率或提前出苗[13-15]，但是，能否用有機(jī)溶劑浸種來(lái)改變種皮透性及浸淋掉部分抑制物質(zhì)，并將其應(yīng)用到藥用植物栽培生產(chǎn)上，以及浸種對(duì)出苗后植株長(zhǎng)勢(shì)、入藥部位質(zhì)量安全性等方面的影響尚不明確，有待進(jìn)一步研究。本研究表明，溫水浸提種子可除去大部分抑制物質(zhì)，加快黃精種子的萌發(fā)，以浸泡24 h為最佳，浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能由于種子長(zhǎng)期處于缺氧條件而受到毒害，從而影響萌發(fā)率。

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