CsSSK1基因調(diào)控暹羅炭疽菌脅迫應(yīng)答和致病性的功能分析

魯婧文 關(guān)小靈 李瀟 張宇 繆衛(wèi)國(guó) 林春花

關(guān)鍵詞：暹羅炭疽菌；CsSSK1 基因；功能分析；藥劑敏感性；致病性

微生物在環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，必須通過一系列復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來感知并適應(yīng)各種環(huán)境壓力。雙組分系統(tǒng)（two-component signalingsystem， TCS）是細(xì)菌、真菌、粘菌及高等植物中普遍存在的一類信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在細(xì)胞應(yīng)答脅迫響應(yīng)、調(diào)控病原菌藥劑敏感性和毒力中發(fā)揮重要作用[1]。真核生物的TCS 通常由組氨酸激酶（histidine kinase， HK）、組氨酸基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（phosphotransferase， HPt）及應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（response regulator， RR）三部分構(gòu)成[2]，如模式生物酵母的雙組分系統(tǒng)由Sln1-Ypd1-Ssk1 組成[3]。已有研究顯示雙組分信號(hào)蛋白對(duì)真菌病原體脅迫反應(yīng)和抗藥性的重要性，如尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）中組氨酸激酶FHK1 缺失對(duì)高滲脅迫和氧脅迫敏感，增強(qiáng)對(duì)吡咯類藥劑的抗性[4]；稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）中同源的組氨酸激酶HIK1 的缺失突變體對(duì)高滲透壓有影響，但對(duì)致病力影響不大。同時(shí)發(fā)現(xiàn)稻瘟菌（M. oryzae）雙組分系統(tǒng)2 個(gè)RR 基因（MoSSK1 和MoSKN7）共同調(diào)控稻瘟菌對(duì)滲透壓和咯菌腈的敏感性[5-6]。

SSK1 是雙組分系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)控蛋白，在真核細(xì)胞中充當(dāng)接收和傳遞信號(hào)的功能[7-8]。大量研究顯示，病原真菌中的SSK1 與病原菌的形態(tài)建成、脅迫反應(yīng)、耐藥性和致病力有關(guān)，但在不同病原菌中其功能存在差異。如在稻瘟菌（M. oryzae）中的MoSSK1 參與對(duì)滲透脅迫的響應(yīng)以及對(duì)咯菌腈的敏感性調(diào)控[9]；在灰霉菌（Botrytis cinerea）中，SSK1 同源基因的缺失喪失產(chǎn)孢能力，對(duì)滲透脅迫和氧脅迫敏感，并且對(duì)異菌脲、咯菌腈和三唑酮敏感性增強(qiáng)[10]；在大麗輪枝菌（Vertilillium dahliae）中VdSsk1 基因與病原菌的壓力脅迫反應(yīng)、黑色素的合成和致病力相關(guān)，還與咯菌腈、異菌脲等殺菌劑敏感性調(diào)控有關(guān)[11]；而在白念珠菌（Candidaalbicans）中SSK1 缺失突變體對(duì)高鹽敏感并且參與氟康唑敏感性調(diào)控[12-13]；但在克魯氏乳酸酵母菌（Kluyveromyces lactis）中SSK1 基因不影響高滲敏感性[14]； 在絲狀真菌柄孢霉（Podosporaanserina）中PaSSK1 基因也不影響氟康唑敏感性[15]。此外，SSK1 在炭疽菌中的功能尚無報(bào)道。

炭疽菌（Colletotrichum spp.）是一類重要的植物病原絲狀真菌，引起許多果樹、蔬菜等重要經(jīng)濟(jì)作物的炭疽病[16]。暹羅炭疽菌（C. siamense）是膠孢炭疽菌復(fù)合群中的一個(gè)種，是我國(guó)橡膠樹炭疽病的田間優(yōu)勢(shì)病原種，也是許多熱帶、亞熱帶作物的主要病原菌，如芒果[17]、荔枝[18]、咖啡[19]、檳榔[20]等。本課題組前期已克隆了暹羅炭疽菌CsSSK1 基因序列，本研究基于已有基礎(chǔ)，利用同源重組替換技術(shù)，構(gòu)建暹羅炭疽菌的雙組分系統(tǒng)中CsSSK1 基因缺失突變體和回補(bǔ)菌株，并進(jìn)行表型觀察，研究結(jié)果不僅有助于進(jìn)一步了解暹羅炭疽菌中的CsSSK1 基因功能，還可為深入了解病原菌如何應(yīng)答脅迫反應(yīng)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株和質(zhì)粒：暹羅炭疽菌（C. siamense）HN08 菌株分離自海南省瓊中新進(jìn)農(nóng)場(chǎng)橡膠樹病葉，由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存，重組載體pCX62-S（含抗性基因ILV1）由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存；酵母感受態(tài)XK-125、回補(bǔ)載體pXY203（S-tag 標(biāo)簽、潮霉素抗性基因HPH）由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基、PDS 培養(yǎng)基、CM 培養(yǎng)基、DCM 培養(yǎng)基、TB3 培養(yǎng)基、YPD 培養(yǎng)基、SD/-Trp培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基，配置方法參照參考文獻(xiàn)[8]。

供試藥劑：99.5%氯化鈉（NaCl）、98%山梨醇（sorbitol）、98%葡萄糖（glucose）、99.7%蔗糖（sucrose），均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；Congo red（剛果紅）購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。使用前將99.3%咯菌腈原藥（廣州碩普生物科技有限公司） 用無菌水溶解， 配置成50 mg/mL 的母液；99%氟康唑原藥（海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司）用無菌水溶解，配置成5 mg/mL 的母液；97%戊唑醇原藥（海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司）用無菌水溶解，配置成50 mg/mL 的母液。

試劑：限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ、T4 連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；通用型DNA 純化回收試劑盒、DNA 提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega 公司；溶壁酶購(gòu)自廣州微生物研究所；潮霉素、DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit Ⅰ購(gòu)于Roche公司；引物合成和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

主要儀器：高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf 公司（德國(guó)）；PCR 擴(kuò)增儀，BIO-RAD 公司（美國(guó)）；臺(tái)式恒溫振蕩器，美國(guó)精騏有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ΔCsSSK1 基因缺失突變菌株構(gòu)建及驗(yàn)證根據(jù)前人的研究方法[21]，利用基因同源重組法，構(gòu)建缺失突變體ΔCsSSK1（圖1），引物序列見表1。首先用帶有ILV1 基因接頭的引物對(duì)SSK1-UF/UR、SSK1-DF/DR 從野生型HN08 DNA 中擴(kuò)增出CsSSK1 目的基因上下游片段，用引物S2R/S1F 從pCX62-S 載體中擴(kuò)增出ILV1 基因全長(zhǎng)，再利用融合PCR體系將擴(kuò)增出的基因上下游片段與ILV1 基因片段連接起來，最后以連接的片段作為模板，用引物SSK1-UF/SSK1-DR 大量擴(kuò)增融合片段，使用通用型DNA 純化回收試劑盒回收后，獲得同源重組片段。利用PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體和同源重組的方法[22]，將片段轉(zhuǎn)入野生型HN08 原生質(zhì)體中，在含有50 μg/mL 氯嘧磺隆的DCM 平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。

初篩得到的轉(zhuǎn)化子再在含100 μg/mL 氯嘧磺隆的DCM 平板上復(fù)篩后，提取轉(zhuǎn)化子DNA 進(jìn)行PCR 檢測(cè)（引物所在位置見圖1，引物序列見表1），分別利用外部引物對(duì)SSK1-UouF/DouR、基因內(nèi)部引物對(duì)SSK1-OF/OR，以及和ILV1 基因內(nèi)部引物S1R、S2F 組合進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。此外，利用Southern Blot 技術(shù)對(duì)敲除轉(zhuǎn)化子內(nèi)整合的ILV1 基因拷貝數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，提取野生型和ΔCsSSK1 突變體轉(zhuǎn)化子DNA，用EcoRⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，以ILV1 基因的PCR 片段為探針進(jìn)行雜交，雜交步驟參照DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit Ⅰ。

1.2.2 回補(bǔ)菌株ΔCsSSK1（CsSSK1）的獲得 以野生型HN08 DNA 為模板，用引物HB-SSK1-UouF/UouR 擴(kuò)增CsSSK1 基因及其自身啟動(dòng)子序列（3282 bp），將PCR 擴(kuò)增片段與經(jīng)XhoⅠ內(nèi)切酶酶切回收的pXY203 載體一同轉(zhuǎn)化到酵母菌XK-125 中，然后涂布于SD/-Trp 平板上，置于30 ℃培養(yǎng)3 d 后挑取酵母單克隆進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，獲得回補(bǔ)載體pXY203-CsSSK1，將回補(bǔ)載體轉(zhuǎn)入缺失突變體ΔCsSSK1 的原生質(zhì)體中（原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化步驟同上），在含有300 μg/mL 潮霉素的PDS 平板培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。待長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子后，挑取轉(zhuǎn)化子到新的含有400 μg/mL 潮霉素的PDS 平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩，用引物HB-SSK1-UouF 與載體pXY203 引物stag-R 對(duì)回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證（引物位置見圖2），最終獲得含有重組質(zhì)粒pXY203-CsSSK1 的回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子ΔCsSSK1（CsSSK1）。12.5 μL PCR 反應(yīng)體系：6 μL 2×Taq PCRMaster Mix，10 μmol/L 引物各0.5 μL，0.5 μL 模板，加ddH2O 補(bǔ)足至12.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

1.2.3 菌落形態(tài)觀察及生長(zhǎng)速率測(cè)定 將野生型HN08、突變體ΔCsSSK1 及回補(bǔ)菌株ΔCsSSK1（CsSSK1）分別接種于PDA 平板，培養(yǎng)3 d 后刮取菌絲置于PD 液體培養(yǎng)基中于28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)5 d，用滅菌Miracloth 過濾，5000 g 離心3 min后用無菌水重懸孢子。利用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子懸浮液濃度至105 個(gè)/mL，接種于CM 培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)5 d 后測(cè)量菌落直徑。

1.2.4 分生孢子形態(tài)觀察及產(chǎn)孢量和萌發(fā)率測(cè)定分生孢子形態(tài)觀察：用上述方法培養(yǎng)野生型HN08（WT-HN08）、ΔCsSSK1、ΔCsSSK1（CsSSK1）分生孢子，分生孢子懸浮液濃度調(diào)至5×105 個(gè)/mL，備用。吸取供試菌株的分生孢子懸浮液20 μL 滴于載玻片表面，用顯微鏡觀察孢子形態(tài)，并分別選取100 個(gè)分生孢子，測(cè)量長(zhǎng)度和寬度，重復(fù)3 次。

產(chǎn)孢量統(tǒng)計(jì)：用4 mL 無菌水洗下平板表面的分生孢子，再用滅菌Miracloth 過濾至2 mL 離心管中，用無菌水將孢子液定容至1 mL。吸取10 μL孢子液于血球計(jì)數(shù)板上，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)分生孢子數(shù)目。

萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)：用無菌水收集孢子液并將濃度調(diào)至105 個(gè)/mL 左右。取10 μL 孢子液滴至疏水玻片表面，置于保濕盒中進(jìn)行保濕處理，分別在0、2、4、6、8 h 在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況并記錄，重復(fù)3 次，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和處理。

1.2.5 脅迫響應(yīng)及藥劑敏感性測(cè)定 配制含藥的CM 培養(yǎng)基，使其分別含0.5 mol/L NaCl、1.0 mol/LNaCl、1.0 mol/L 山梨醇、1.0 mol/L 蔗糖、1.0 mol/L葡萄糖、100 μg/mL 剛果紅，以及不同濃度藥劑咯菌腈（0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL）、2.5 μg/mL氟康唑、0.5 μg/mL 戊唑醇。分生孢子懸浮液配制方法同上，取10 μL 分生孢子懸浮液（105 個(gè)/mL）接種于含藥培養(yǎng)基平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)5 d，采用“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑并拍照記錄。計(jì)算抑制率，抑制率＝（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.6 致病力測(cè)定 用血球計(jì)數(shù)板將分生孢子懸浮液濃度調(diào)至106 個(gè)/mL，將其接種于未刺傷和刺傷的離體橡膠樹葉片上，每次接種10 μL，重復(fù)30 張葉片，在接種后5 d 左右觀察發(fā)病情況，拍照并測(cè)量病斑面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncans 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 暹羅炭疽菌CsSSK1 基因敲除突變體及其回補(bǔ)菌株的獲得

利用基因同源重組法， 構(gòu)建缺失突變體ΔCsSSK1。在含氯嘧磺隆藥劑平板上篩選獲得36個(gè)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過多對(duì)引物PCR 驗(yàn)證，篩選獲得1個(gè)缺失突變體ΔCsSSK1。PCR 驗(yàn)證結(jié)果見圖3A，利用引物對(duì)SSK1-OF/SSK1-OR 在野生型菌株中可擴(kuò)增獲得1 條大小為2018 bp 的條帶（泳道4），在ΔCsSSK1 突變體轉(zhuǎn)化子中未檢測(cè)到該序列條帶（泳道8）；在ΔCsSSK1 中，利用引物SSK1-UouF和ILV1 基因內(nèi)部S1R 在ΔCsSSK1 突變體中可擴(kuò)增到1 條大小為2280 bp 的條帶（泳道6），利用SSK1-DouR 與ILV1 基因S2F 擴(kuò)增到1 條大小為2548 bp 的條帶（泳道7），而野生型中未擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶（泳道2 和3）；用外部引物SSK1-UouF 及SSK1-DouR 在野生型菌株中可擴(kuò)出1 條大小為3413 bp 的條帶（泳道1），在ΔCsSSK1 突變體中擴(kuò)增出1 條大小為4212 bp 的條帶（泳道5）。經(jīng)測(cè)序分析，顯示目的基因CsSSK1（2018 bp）被ILV1 基因（2817 bp）所替換。通過Southern blot分析顯示（圖3B），以ILV1 基因內(nèi)部序列為探針，在ΔCsSSK1 基因組DNA 中雜交僅產(chǎn)生1 條條帶，而與野生型HN08 基因組DNA 雜交未產(chǎn)生條帶，說明ΔCsSSK1 基因組內(nèi)僅整合1 個(gè)拷貝的ILV1基因序列。研究結(jié)果說明ΔCsSSK1 確實(shí)是CsSSK1基因缺失突變體。

通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建的pXY203-CsSSK1 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入ΔCsSSK1 突變體中獲得回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子ΔCsSSK1（CsSSK1），利用引物HB-SSK1-UouF 與載體pXY203 引物stag-R 進(jìn)行驗(yàn)證（圖3A）。在缺失突變體ΔCsSSK1 中未檢測(cè)到擴(kuò)增條帶（泳道9），而回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子ΔCsSSK1（CsSSK1）及回補(bǔ)載體pXY203-CsSSK1 可擴(kuò)增到1 條大小為3382 bp 的目的條帶（泳道10 和11），說明目的序列已重新轉(zhuǎn)入，獲得基因回補(bǔ)菌株ΔCsSSK1（CsSSK1）。

2.2 暹羅炭疽菌突變體ΔCsSSK1 菌株的表型觀察

2.2.1 對(duì)菌落形態(tài)及生長(zhǎng)速率的影響 在CM 培養(yǎng)基上突變體ΔCsSSK1 菌株的菌落形態(tài)和野生型菌株無明顯差異，但菌落直徑較小，菌落直徑測(cè)定結(jié)果顯示，ΔCsSSK1 菌株較野生型HN08 小12.50%（圖4）。結(jié)果說明CsSSK1 基因影響暹羅炭疽菌菌落的生長(zhǎng)速率。

2.2.2 對(duì)產(chǎn)孢量、分生孢子形態(tài)及萌發(fā)率的影響經(jīng)顯微觀察，ΔCsSSK1 的分生孢子比WT-HN08明顯較短圓（圖5A），長(zhǎng)度比WT-HN08 短22.80%，寬度增14.01%（圖5B）。分生孢子產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果顯示，WT-HN08 的孢子濃度約為（1.43±0.056）×106 個(gè)/mL，而ΔCsSSK1 敲除突變體的孢子濃度約為（0.43±0.043）×106 個(gè)/mL，回補(bǔ)菌株ΔCsSSK1（CsSSK1）的孢子濃度約為（1.13±0.032）×106 個(gè)/mL，ΔCsSSK1 敲除突變體的產(chǎn)孢量明顯減少（圖5C）。結(jié)果說明CsSSK1 基因影響暹羅炭疽菌分生孢子的產(chǎn)孢量及分生孢子的大小。

孢子萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果顯示，在接種后0～8 h內(nèi)，ΔCsSSK1 的分生孢子萌發(fā)率低于WT-HN08 和回補(bǔ)菌株ΔCsSSK1（CsSSK1），其中接種6 h 后，WTHN08分生孢子萌發(fā)率為82.75%±0.097%，ΔCsSSK1的萌發(fā)率為76.84%±0.10%，ΔCsSSK1（CsSSK1）的萌發(fā)率為83.95%±0.045%（圖5D）。說明CsSSK1的缺失會(huì)降低暹羅炭疽菌分生孢子的萌發(fā)。

2.2.3 對(duì)鹽脅迫、滲透脅迫及剛果紅脅迫的反應(yīng)在含有0.5、1.0 mol/L NaCl，1.0 mol/L 山梨醇、1.0 mol/L 蔗糖、1.0 mol/L 葡萄糖、100 μg/mL 剛果紅的培養(yǎng)基上測(cè)量供試菌株菌落直徑， 與WT-HN08 相比，ΔCsSSK1 在含0.5、1.0 mol/L NaCl的平板上菌落直徑減小，抑制率分別為75.3%和100%，說明ΔCsSSK1 對(duì)高鹽脅迫反應(yīng)敏感；ΔCsSSK1 在1.0 mol/L 山梨醇、1.0 mol/L 蔗糖、1.0 mol/L 葡萄糖平板上菌落直徑減小，抑制率依次為74.0%、81.5%、77.4%，說明ΔCsSSK1 對(duì)高滲透脅迫反應(yīng)敏感；此外，在100 μg/mL 剛果紅平板上ΔCsSSK1 菌落直徑也減小，抑制率為15.1%，說明ΔCsSSK1 對(duì)剛果紅脅迫反應(yīng)敏感，推測(cè)該基因影響細(xì)胞壁完整性（圖6）。結(jié)果表明，CsSSK1 基因參與應(yīng)答鹽脅迫和滲透脅迫，可能影響細(xì)胞壁完整性。

2.2.4 對(duì)藥劑脅迫反應(yīng) 通過測(cè)定化學(xué)藥劑咯菌腈、氟康唑和戊唑醇對(duì)供試菌株的影響，結(jié)果顯示，在含咯菌腈平板上，與WT-HN08 相比，ΔCsSSK1突變體的菌落直徑均極顯著增加，ΔCsSSK1 在咯菌腈濃度梯度為0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL 的平板上，其抑制率依次為15.6%、20.0%、17.5%、30.0%；在三唑類殺菌劑氟康唑和戊唑醇平板上，ΔCsSSK1突變體的菌落直徑減小，抑制率分別為21.6%和48.1%（圖7）。顯著性分析結(jié)果表明，CsSSK1 基因負(fù)調(diào)控炭疽菌對(duì)咯菌腈的敏感性，但正調(diào)控其對(duì)氟康唑、戊唑醇的敏感性。

2.2.5 致病力測(cè)定 在刺傷和未刺傷的橡膠樹葉片上分別接種供試菌株，5 d 后測(cè)量病斑面積。結(jié)果顯示，在刺傷和未刺傷葉片上，ΔCsSSK1 突變體的病斑面積均比WT-HN08 極顯著減小，分別減少79.8%和86.9%（圖8）。表明CsSSK1 基因參與暹羅炭疽菌的致病力調(diào)控。

3 討論

炭疽病是橡膠樹重要的葉部病害之一，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)橡膠樹炭疽菌的耐藥性分子機(jī)制及致病力的研究基礎(chǔ)還較薄弱。本研究構(gòu)建了CsSSK1基因敲除突變體及回補(bǔ)菌株，表型觀察證實(shí)了暹羅炭疽菌CsSSK1 基因影響炭疽菌的菌落生長(zhǎng)速率、分生孢子大小、產(chǎn)孢量及分生孢子萌發(fā)率，參與鹽脅迫、滲透脅迫和剛果紅脅迫反應(yīng)，負(fù)調(diào)控炭疽菌對(duì)咯菌腈藥劑的敏感性，正調(diào)控其對(duì)氟康唑和戊唑醇的敏感性，且影響致病力。

SSK1 作為雙組分系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，在病原菌中具有許多功能，但不同病原真菌的SSK1基因功能存在差異。很多研究均顯示，SSK1 可參與滲透脅迫反應(yīng)，如稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）與灰霉菌（Botrytis cinerea）中的SSK1 同源基因等[9-10]； 但克魯氏乳酸酵母菌（Kluyveromyceslactis）中的SSK1 基因缺失對(duì)高滲透壓的敏感性無影響[14]。在藥劑敏感性調(diào)控方面，不同病原菌中該基因缺失對(duì)藥劑敏感性的表型也不盡相同。有研究顯示該基因缺失可對(duì)吡咯類等藥劑表現(xiàn)抗性，如稻瘟菌中的MoSSK1[9]和鏈格孢菌（Alternaria alternata）中的SSK1[23]；但在部分真菌中的表現(xiàn)卻相反，如灰霉菌中SSK1 的缺失對(duì)異菌脲、咯菌腈和三唑酮3 種殺菌劑更敏感，在白念珠菌（Candida albicans）中CaSSK1 突變體對(duì)氟康唑敏感[12-13]；也有些病原菌，如絲狀真菌柄孢霉（Podospora anserina）中，ΔPaSSK1 突變株對(duì)氟康唑不敏感[15]。并且不同病原菌在致病力方面也存在差異，灰霉菌中的SSK1 同源基因Brrg-1 不參與毒力調(diào)控；而大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）中的VdSsk1、萊氏野村菌（Nomuraea rileyi）中的Nrssk1、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中的FgRrg-l（同源于釀酒酵母的Ssk1）均參與致病力的調(diào)控[11， 24-25]。本研究對(duì)暹羅炭疽菌的CsSSK1 基因功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CsSSK1 基因的缺失不僅對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫敏感，對(duì)咯菌腈抗性增強(qiáng)，還對(duì)剛果紅、氟康唑和戊唑醇敏感性增強(qiáng)，并且使炭疽菌致病力降低，研究結(jié)果說明在不同病原真菌中的SSK1 基因功能存在一定差異。但CsSSK1 基因的這些功能對(duì)調(diào)控炭疽菌的脅迫響應(yīng)、耐藥性、致病力等分子機(jī)制尚無相關(guān)研究，后續(xù)可進(jìn)一步分析CsSSK1 的互作蛋白及上下游調(diào)控因子，可為深入了解CsSSK1 如何影響相關(guān)功能進(jìn)行深入分析，為解析炭疽菌致病機(jī)理和應(yīng)答抗逆反應(yīng)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。