無(wú)核荔枝僵果病的病原菌鑒定、入侵途徑及快速檢測(cè)技術(shù)

王偉博 李松剛 胡美姣 曹學(xué)仁 李敏 李煥苓 李芳 高兆銀

關(guān)鍵詞：無(wú)核荔枝；僵果??；病原菌；鑒定；檢測(cè)

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是原產(chǎn)于我國(guó)的重要的熱帶果樹之一。無(wú)核荔枝是海南選育的地方特色品種，其果大皮紅，果肉晶瑩、口感清脆無(wú)渣，食用時(shí)不吐核，備受消費(fèi)者喜愛。隨著荔枝栽培技術(shù)的提高，并蒂雙生的無(wú)核荔枝成為無(wú)核荔枝生產(chǎn)的主流，在果實(shí)長(zhǎng)至花生米大小時(shí)，通過(guò)疏除單果、有核果實(shí)，保留并蒂成對(duì)的無(wú)核果實(shí)，實(shí)現(xiàn)并蒂雙生無(wú)核荔枝的生產(chǎn)，其售價(jià)高，是單果售價(jià)的2～4倍，經(jīng)濟(jì)效益顯著[1-3]。近年來(lái)無(wú)核荔枝上發(fā)生了一種為害果實(shí)的新病害，與荔枝常見的果實(shí)病害，如炭疽病、霜疫霉病、酸腐病引起的果皮褐變，在樹上或者采后果實(shí)腐爛不同，這種新病害主要為害幼果，果實(shí)長(zhǎng)至蠶豆大小時(shí)，發(fā)病果實(shí)的外果皮局部顏色變暗，剖開后變暗部位內(nèi)果皮發(fā)生不規(guī)則褐變，果實(shí)不再膨大，形成無(wú)肉僵果，命名為無(wú)核荔枝僵果病。該病害僅導(dǎo)致幼果發(fā)育停止、內(nèi)果皮呈灰褐色，褐變位置多發(fā)生在果實(shí)縱莖中間位置，較少發(fā)生在果柄和果頂端部位，這種蠶豆大小的僵果一直維持到果實(shí)成熟期不腐爛，果皮比正常果實(shí)提前3～7 d 變紅。如果并蒂雙生無(wú)核荔枝果實(shí)中有1個(gè)果實(shí)發(fā)生這種病害，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值將顯著降低。2019—2021 年本課題組調(diào)查該病害的發(fā)病率在5%～15%之間，嚴(yán)重影響并蒂雙生果實(shí)的生產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病害的癥狀與GAO 等[4]報(bào)道的桂花香荔枝變紅鐮刀菌（Fusarium incarnatum）果腐病的癥狀相似，不同的是變紅鐮刀菌果腐病的癥狀為果實(shí)外觀無(wú)明顯病變表現(xiàn)，近果柄處果皮變硬，剖開后內(nèi)果皮果柄周圍呈灰褐色褐變，發(fā)病部位在果柄處或近果柄處居多，變紅鐮刀菌果腐病不影響桂花香荔枝果肉的正常生長(zhǎng)和食用品質(zhì)，果實(shí)可以正常成熟。而目前國(guó)內(nèi)外均未見無(wú)核荔枝僵果病的報(bào)道。本研究對(duì)無(wú)核荔枝僵果病的病原菌進(jìn)行分離、鑒定，并研究其入侵途徑和分子快速檢測(cè)、診斷技術(shù)，為該病的鑒別和高效防治提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

無(wú)核荔枝果實(shí)（感病果實(shí)和健康果實(shí)）采自海南澄邁無(wú)核荔枝基地。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離采回感病無(wú)核荔枝果實(shí)后，參照胡美姣等[5]的方法進(jìn)行病原菌分離。從PDA 培養(yǎng)分離物中挑取菌絲置于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)2～3 d，長(zhǎng)出菌絲后在菌落邊緣用無(wú)菌鑷子剪取形態(tài)單一的小菌絲塊接種至PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行純化。培養(yǎng)6 d 待菌落長(zhǎng)出孢子后采用標(biāo)記法獲得單孢分離物，用于后續(xù)致病性試驗(yàn)、病菌鑒定和檢測(cè)等研究。

1.2.2 致病性測(cè)定致病力測(cè)定方法參考胡美姣等[6]的方法，選取果實(shí)縱經(jīng)約1 cm，大小一致（約花生米大?。┑慕】倒麑?shí)，采用無(wú)刺傷接種和昆蟲針刺傷果面接種2 種方式。用打孔器將培養(yǎng)7 d的單孢分離菌株P(guān)DA 培養(yǎng)基打成直徑為5 mm 的菌餅，菌絲一面貼到荔枝果皮上，用脫脂棉保濕，24 h 后去除脫脂棉，每個(gè)菌株接種12 個(gè)果實(shí)，3 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，共接種64 株單孢分離物，以空白PDA 培養(yǎng)基瓊脂餅為對(duì)照（CK）。

1.2.3 病原菌鑒定（1）形態(tài)學(xué)鑒定。培養(yǎng)7 d后，在徠卡生物顯微鏡下觀察病原菌分生孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，根據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行病原菌鑒定。（2）分子鑒定。使用CATB 法提取病原菌DNA[7]，進(jìn)行ITS、RPB2、EF-1α 擴(kuò)增。ITS 擴(kuò)增引物序列參照WHITE 等[8]設(shè)計(jì)的真菌rDNA-ITS 序列，PCR 條件參考胡美姣等[5]的方法。RPB2、EF-1α 基因的引物序列及PCR 條件參照WANG 等[9]的方法。凝膠電泳檢驗(yàn)合格后將產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，基于ITS 測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行比對(duì)，確定病原菌的屬，再?gòu)腘CBI上下載相關(guān)屬種的序列及外群序列，基于RPB2、EF-1α 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確認(rèn)病原菌的生物學(xué)種類[10]。

1.2.4 病原菌的侵染途徑試驗(yàn)田間幼果經(jīng)農(nóng)事活動(dòng)碰傷、自然風(fēng)力較大擦傷以及昆蟲口器刺傷等傷害后，果皮受傷部位會(huì)流出明顯的黑色汁液。選取縱徑為10 mm 的3 串健康果實(shí)，每串4 個(gè)果實(shí)，共12 個(gè)流黑汁的果實(shí)進(jìn)行侵入途徑試驗(yàn)。接種方法和發(fā)病統(tǒng)計(jì)同1.2.2。以15 cm×20 cm 大小的紗網(wǎng)套住果穗，每個(gè)紗網(wǎng)放入5 只荔枝蝽，24 h后選擇果皮變黑的果實(shí)接種病原菌，以表面無(wú)損傷的果皮接種病原菌為對(duì)照（CK），探究病原菌的侵染途徑。

1.2.5 病原菌的分子檢測(cè)以伯氏鐮刀菌和分離獲得的其他鐮刀菌屬真菌基因組DNA 為模板，利用鐮刀菌屬通用引物TUB2F/TUB2R 對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。根據(jù)測(cè)序獲得的序列信息，采用MEGA 11 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，找到伯氏鐮刀菌和其他鐮刀菌基因序列的差異性位點(diǎn)，利用NCBI 設(shè)計(jì)檢測(cè)伯氏鐮刀菌的特異性引物序列，選用契合度最高的一對(duì)引物F1D/R1D 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果判斷引物的特異性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。為了進(jìn)一步鑒定篩選獲得的伯氏鐮刀菌檢測(cè)引物的特異性，以分離獲得的所有菌株為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行PCR 檢測(cè)，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果判斷引物的特異性；從盛花期后第10 天開始取樣（不同生長(zhǎng)期共取9 次樣，編號(hào)為1～9），每個(gè)時(shí)期取樣18 個(gè)單果，表面經(jīng)75%酒精消毒30 s，用滅菌濾紙吸干水分，單果包裝置于–80 ℃保存?zhèn)溆?。以不同時(shí)期的單果DNA為檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行PCR 檢測(cè)，使用Plant Genomic DNA Kit 試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進(jìn)行果實(shí)DNA 的提取，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷病原菌入侵情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SAS 9.1 軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離、純化與致病性測(cè)定

從發(fā)病無(wú)核荔枝果實(shí)中分離獲得64 株菌株，根據(jù)形態(tài)特征分為14 種，每種菌株接種1 株，所有菌株均未能侵染無(wú)刺傷果實(shí)，導(dǎo)致刺傷果實(shí)發(fā)病的共有8 株，分為3 個(gè)種類，菌株編號(hào)分別為SLZ-1-2、02、32。其中致病性最強(qiáng)的病原菌株為SLZ-1-2，發(fā)病癥狀與自然發(fā)病果實(shí)癥狀一致（圖1）。從刺傷接種發(fā)病果實(shí)中，再次分離獲得的菌株與SLZ-1-2 一致，表明菌株SLZ-1-2 為本研究的主要致病菌。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌菌株SLZ-1-2 在PDA 平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌絲密集，氣生菌絲呈淡黃色，菌落背面呈淡棕色（圖2）。分生孢子的形態(tài)呈鐮刀型，整體稍彎曲，1～5 個(gè)分隔。根據(jù)培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，鑒定該病原菌為鐮刀菌（Fusarium）。

2.3 病原菌的分子鑒定

將病原菌菌株SLZ-1-2 的RPB2 和TEF1 序列與GenBank 中下載的27 個(gè)菌株的相關(guān)基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，以PhyloSuite 進(jìn)行拼接，用Cipres 以伯氏鐮刀菌（F. pernambucanum）為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。本研究致病菌株SLZ-1-2與伯氏鐮刀菌以100%的高支持率聚為一支，支持形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，因此，基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，將該致病菌株鑒定為伯氏鐮刀菌（F.pernambucanum）。

2.4 病原菌的入侵途徑

在田間無(wú)刺傷接種病原菌時(shí)，果實(shí)不發(fā)病，機(jī)械損傷接種后發(fā)病率為92.24%；刺吸式害蟲為害后，發(fā)病率為82.27%（圖4）。因此，無(wú)核荔枝果實(shí)表面出現(xiàn)損傷時(shí)病原菌能入侵致病。

2.5 伯氏鐮刀菌引物的特異性驗(yàn)證

用 F1D（5-CCTGGCAGGAGTGATGAAAC-3）/R1D（5-AATCAGACCGGTCAGTGCGT-3）對(duì)伯氏鐮刀菌和分離獲得的其他鐮刀菌屬真菌及非鐮刀菌屬真菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證引物的特異性，結(jié)果表明，僅伯氏鐮刀菌基因組DNA 可以擴(kuò)增出1 條220 bp 左右的特異性片段，與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，而從無(wú)核荔枝上分離供試的3種鐮刀菌屬真菌和其他非鐮刀菌屬真菌無(wú)目的條帶出現(xiàn)，CK 也無(wú)目的條帶出現(xiàn)（圖5，圖6），試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了該對(duì)引物的特異性，可用于田間檢測(cè)病原菌。

2.6 發(fā)病果實(shí)的分子檢測(cè)

在田間隨機(jī)采集無(wú)核荔枝僵果果實(shí)，利用特異性引物F1D/R1D 對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，僵果均可以擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而CK 無(wú)條帶產(chǎn)生。說(shuō)明該特異性引物可以用于生產(chǎn)中無(wú)核荔枝僵果病病原菌及病果的快速檢測(cè)（圖7）。

2.7 病原菌入侵時(shí)期

從表 1 可以看出，無(wú)核荔枝幼果期帶菌率較高，特別是果實(shí)縱徑小于10 mm 時(shí)，果實(shí)帶菌率比較高，隨著荔枝果實(shí)的生長(zhǎng)，果實(shí)角質(zhì)層逐漸增厚，帶菌率逐漸降低。分別以田間隨機(jī)采集的果實(shí)和伯氏鐮刀菌基因組DNA 為模板，利用特異性引物F1D/R1D 對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，部分無(wú)癥狀幼果可以擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，其中以果實(shí)縱徑為3.2～4.8 mm 時(shí)期檢出率最高，說(shuō)明此階段為病原菌的主要入侵時(shí)期，果實(shí)大于9.8 mm后，病原菌入侵逐漸降低。

3 討論

鐮刀菌屬真菌病害是造成植物發(fā)生病害的主要病原之一，如枯萎、腐爛和枯死[11-15]。OMAR等[16]報(bào)道了由伯氏鐮刀菌（F. pernambucanum）引起的馬來(lái)西亞芒果葉斑病。GUO 等[17]報(bào)道了由伯氏鐮刀菌引起的我國(guó)芒果的葉斑病。ZHANG等[18]報(bào)道了由伯氏鐮刀菌引起的甜瓜僵果病，發(fā)病部位呈灰褐色、水漬狀，發(fā)病后期可導(dǎo)致整個(gè)果實(shí)腐爛，果實(shí)表面布滿白色至玫瑰紅色的霉層。LU 等[19]報(bào)道了由伯氏鐮刀菌引起的李葉枯病，發(fā)病葉片邊緣或尖端出現(xiàn)不規(guī)則的棕色斑點(diǎn)，發(fā)病后期，整個(gè)葉片枯萎褐變、卷曲或脫落。本研究發(fā)現(xiàn)引起無(wú)核荔枝的新型僵果病的病原菌為伯氏鐮刀菌。該病原菌主要為害幼果，發(fā)病時(shí)幼果果實(shí)外觀無(wú)明顯變化，但無(wú)核荔枝完成疏果后，果實(shí)長(zhǎng)至蠶豆大小時(shí)，發(fā)病果實(shí)的外果皮變暗，剖開后內(nèi)果皮發(fā)生不規(guī)則褐變，果實(shí)不再膨大，形成僵果。

GUO 等[17]的研究表明，由伯氏鐮刀菌引起的芒果葉斑病在葉片表面存在傷口時(shí)才能入侵致病。本研究中也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)農(nóng)事操作，如打藥、施肥等人工擦傷，大風(fēng)后機(jī)械摩擦損傷，荔枝蝽為害等方式，在荔枝果實(shí)表面造成傷口時(shí)，伯氏鐮刀菌則入侵致病，果皮無(wú)傷口時(shí)不致病。經(jīng)過(guò)全面的田間調(diào)查，未發(fā)現(xiàn)該病原菌為害無(wú)核荔枝的嫩梢和葉片。

分子檢測(cè)技術(shù)以其高效、靈敏、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物病害的檢測(cè)[20]。李亭潞等[21]利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)建立了荔枝霜疫霉和炭疽病的快速檢測(cè)技術(shù)。而利用PCR 或qPCR（quantitative real-time PCR）技術(shù)可檢測(cè)到的植物病原已達(dá)50 余種[22]。本研究根據(jù)伯氏鐮刀菌的序列信息，利用MEGA 11 軟件與其他鐮刀菌進(jìn)行序列比對(duì)，找到差異性位點(diǎn)，合成引物F1D/R1D 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)帶致病菌果實(shí)的檢測(cè)率達(dá)到100%。

無(wú)核荔枝是海南本地選育的優(yōu)良品種，其獨(dú)特的品質(zhì)和生產(chǎn)模式，以及高價(jià)值的經(jīng)濟(jì)效益已經(jīng)成為海南重要的農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志產(chǎn)品。無(wú)核荔枝新型僵果病果實(shí)的果皮受傷后，由伯氏鐮刀菌入侵為害，該菌主要通過(guò)農(nóng)事操作、風(fēng)、刺吸口器昆蟲造成荔枝果皮傷口后侵入感染，果實(shí)縱徑為3.2～4.8 mm 時(shí)為病原菌的主要入侵時(shí)期。本研究建立的無(wú)核荔枝僵果病的快速檢測(cè)方法，不僅靈敏度高，能區(qū)分其他屬病原菌，也能區(qū)分親緣關(guān)系較近的鐮刀菌屬真菌?？蔀榻┕〉脑缙陬A(yù)防，遏制病害的發(fā)生和傳播提供技術(shù)保障。但該病原菌是否為害葉片，以及是否入侵如蒂蛀蟲等其他因素造成的幼果傷口有待進(jìn)一步研究。