正己醇對(duì)機(jī)械傷香蕉采后生理特性影響及磷脂酶D的抑制作用

甘婷 黃方 黃敏 易萍 李麗 李杰民 零東寧 陳瑜嫻 張?zhí)m

關(guān)鍵詞：香蕉；正己醇；磷脂酶D 抑制劑；采后品質(zhì)；生理特性

香蕉（Musa nana L.）是世界四大水果之一，原產(chǎn)于東南亞，目前國內(nèi)主產(chǎn)于廣西、云南、海南及臺(tái)灣等地[1]。成熟香蕉具有氣味芬芳、果肉細(xì)膩的特點(diǎn)。其次，香蕉因富含蛋白質(zhì)、VC、礦物質(zhì)K 等營養(yǎng)元素和多酚、胺類等活性成分，且具有抗氧化、預(yù)防心血管等保健功能，因此深受消費(fèi)者喜愛[2]。另外，香蕉屬于呼吸躍變型果實(shí)，采后出現(xiàn)呼吸躍變，乙烯釋放量迅速上升，從而促進(jìn)香蕉成熟和衰老。但由于香蕉在貯運(yùn)、銷售等過程中易產(chǎn)生微生物、機(jī)械傷、冷害等采后病害，尤其在貯運(yùn)過程中常因振動(dòng)產(chǎn)生的碰撞和擠壓，使組織細(xì)胞膜系統(tǒng)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成果實(shí)采后品質(zhì)劣變，加速果實(shí)成熟和衰老，嚴(yán)重影響果實(shí)貯藏期限，降低商品價(jià)值[3]。因此，有效延長(zhǎng)具有機(jī)械傷香蕉的貯藏保鮮期，保持其在貯藏期間的品質(zhì)對(duì)香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

磷脂酶D（phospholipase D，PLD），全稱磷脂酰膽堿磷脂水解酶，是催化生物膜主要成分磷脂水解的關(guān)鍵酶[4]。由于機(jī)械傷可使植物細(xì)胞膜完整性喪失，激活并促進(jìn)PLD 與膜結(jié)合而提高PLD 活性，導(dǎo)致磷脂降解，膜通透性改變，最終造成植物傷害甚至死亡[5]。目前，隨著人們生活水平提高，越來越注重果蔬采后品質(zhì)，因此對(duì)果蔬采后保鮮技術(shù)的要求也不斷提高。正己醇是植物脂氧合酶代謝途徑中形成的代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞膜衰老代謝關(guān)鍵酶磷脂酶D 的抑制劑，可用于果蔬采后保鮮[6-8]。李英華等[9-10]研究了不同濃度正己醇對(duì)草莓的保鮮效果，發(fā)現(xiàn)0.05%正己醇處理可有效抑制采后草莓呼吸作用和果實(shí)軟化，降低果實(shí)采后腐爛率，較好地維持草莓VC 含量；0.1%正己醇顯著提高草莓在貯藏期間的抑菌能力，減少微生物病害，此外，正己醇處理還有效抑制草莓LOX 活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高POD活性。正己醇處理在桃[11]、桑葚[12]等作物中均較好地維持果實(shí)品質(zhì)，延緩果實(shí)成熟衰老進(jìn)程。

目前，正己醇對(duì)香蕉在機(jī)械傷脅迫后其生理特性的影響尚無報(bào)道。因此，研究正己醇對(duì)機(jī)械傷香蕉采后貯藏期間生理特性的影響，為維持機(jī)械傷香蕉采后品質(zhì)和延長(zhǎng)貯藏期限提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用香蕉品種為桂蕉6 號(hào)，成熟度為7～8 成熟，采自廣西南寧市壇洛鎮(zhèn)果園。采后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，將香蕉分成單根果指，挑選果實(shí)外觀完好、成熟度一致、大小相近、無病蟲害的果實(shí)為材料。用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡清洗10 min，取出晾干備用。

正己醇（1-hexanol）購自中和化學(xué)（山東）有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸乙酯、NaOH 等試劑均為國產(chǎn)分析純。

本試驗(yàn)所用儀器設(shè)備：BSA124s 型電子天平、GY-4 型果實(shí)硬度計(jì)、UV-3200 PCS 型紫外可見分光光度計(jì)、3-18ks 型高速冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將預(yù)處理的香蕉果實(shí)進(jìn)行模擬機(jī)械損傷處理，采用不銹鋼打孔器（直徑為2 mm）在香蕉中軸部位戳傷。隨后將處理好的香蕉隨機(jī)分成2 組，每組60 個(gè)香蕉果實(shí)，分別用蒸餾水（對(duì)照組）和（正己醇處理組）0.1%濃度正己醇浸泡處理果實(shí)10 min，然后自然晾干。晾干后的香蕉置于PE 保鮮袋中扎口包裝，于25 ℃室溫下貯藏15 d，每3 d 取樣觀察并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2 硬度的測(cè)定 使用GY-4 型果實(shí)硬度計(jì)測(cè)定（探頭直徑為5 mm），每次隨機(jī)取6～8 個(gè)香蕉，每個(gè)果面測(cè)2 個(gè)點(diǎn)，最終取平均值為該果實(shí)的硬度。

1.2.3 可溶性固形物（TSS）含量測(cè)定 使用MZB-53（N）便攜式數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)定，取去皮香蕉的中部果肉進(jìn)行切塊打漿，重復(fù)測(cè)6 次，最終取平均值為果實(shí)的TSS 含量。

1.2.4 呼吸強(qiáng)度的測(cè)定 呼吸強(qiáng)度測(cè)定參照曹健康等[13]的方法，采用靜置法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 病情指數(shù)的測(cè)定 參考吳小建等[14]的方法并加以改進(jìn)，根據(jù)香蕉果實(shí)表面腐爛面積大小分為0～4 級(jí)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0 級(jí)果（無病斑）、1級(jí)果（<1/10 病斑）、2 級(jí)果（1/10～1/4 病斑）、3級(jí)果（1/4～1/2 病斑）、4 級(jí)果（>1/2 病斑）。每次取樣測(cè)量香蕉表面病斑的大小。

病情指數(shù)=Σ（腐爛級(jí)別×該級(jí)別樣品數(shù)量）/（最高級(jí)別×樣品總數(shù)量）×100%

1.2.6 MDA 含量測(cè)定 參照劉瑤等[15]的方法，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定450、532、600 nm 處的吸光值。

1.2.7 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定 參考SONG 等[16]的方法，用相對(duì)電導(dǎo)率表示膜透性，并稍作修改。將樣品煮沸10 min 并冷卻至室溫，測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。

1.2.8 PLD 酶活性測(cè)定 參照SUN 等[17]和CHEN 等[18]的方法，取磨樣后的香蕉果肉組織1 g，測(cè)定PLD 活性及蛋白質(zhì)含量，單位用U/g表示。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量分析 按照RNAprep PurePlant Kit 試劑盒說明書，提取香蕉果皮中軸組織總RNA。取總RNA 1 μg 使用HiFiScript cDNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量分析[17]。根據(jù)PLD 基因序列，使用Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。根據(jù)Real time PCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR。以香蕉Actin 基因?yàn)閮?nèi)參基因[19-20]，采用2–ΔΔCT 法計(jì)算PLDγ 和PLDζ 基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；利用SPSS 26.0 軟件Duncans 法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析；使用Origin 2018 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后正己醇處理對(duì)香蕉硬度的影響

硬度是反映果實(shí)采后軟化程度的重要指標(biāo)[21]。如圖1 所示，采后貯藏過程中，香蕉硬度整體呈下降趨勢(shì)。貯藏0 d，果實(shí)硬度最大，為378.89 N。至貯藏3 d，2 組硬度變化不明顯。隨貯藏時(shí)間增加，果實(shí)硬度逐漸降低。貯藏6 d 時(shí)，處理組硬度為262.38 N，在貯藏15 d 降至最低值165.25 N，較對(duì)照組顯著提高71%（P<0.05）。貯藏15 d，對(duì)照組和處理組較貯藏6 d 分別降低65.5%和37%，表明正己醇處理可延緩香蕉果實(shí)軟化的進(jìn)程。

2.2 采后正己醇處理對(duì)香蕉可溶性固形物（TSS）含量的影響

可溶性固形物（TSS）可反映果蔬的成熟度和品質(zhì)狀況。如圖2 所示，采后貯藏過程中，香蕉TSS 含量整體呈上升趨勢(shì)。貯藏6 d 前，2 組的TSS 含量無顯著差異。貯藏9 d，對(duì)照組和處理組的TSS 含量分別為9.35%和6.07%。貯藏15 d，香蕉TSS 含量積累至最大值，處理組為16.27%，較對(duì)照組降低20%（相對(duì)值）。貯藏9 d后， 處理組TSS 含量極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），表明PLD 抑制劑正己醇在一定程度上降低了香蕉TSS 含量，維持果實(shí)品質(zhì)，延緩采后貯藏期限。

2.3 采后正己醇處理對(duì)香蕉呼吸強(qiáng)度的影響

如圖3 所示，采后貯藏過程中，香蕉呼吸強(qiáng)度整體呈先上升后下降的趨勢(shì)。貯藏0 d，香蕉呼吸強(qiáng)度為2.17 mg/（kg·h），隨后逐漸上升。貯藏6 d，處理組呼吸強(qiáng)度為7.74 mg/（kg·h），顯著低于對(duì)照組。對(duì)照組和處理組均于9 d 出現(xiàn)呼吸峰，處理組呼吸強(qiáng)度較對(duì)照組極顯著降低33.93%，隨后下降。貯藏9～15 d，對(duì)照組呼吸強(qiáng)度由14.62 降至8.27 mg/（kg·h），處理組由9.66 降至6.56 mg/（kg·h），處理組顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。采后貯藏期間，處理組呼吸強(qiáng)度均低于對(duì)照組，其中6～15 d 降低效果顯著，表明正己醇處理可有效抑制采后香蕉貯藏期間呼吸強(qiáng)度上升，延緩果實(shí)成熟和衰老的進(jìn)程。

2.4 采后正己醇處理對(duì)香蕉病情指數(shù)的影響

病情指數(shù)可反映采后貯藏期間果蔬的病害情況，是衡量果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)[22-23]。如圖4 所示，隨貯藏時(shí)間增加和果實(shí)逐漸成熟，香蕉病情指數(shù)呈上升的趨勢(shì)。貯藏0 d，香蕉病情指數(shù)為0，貯藏6 d，處理組病情指數(shù)為1.22%，顯著低于對(duì)照組。貯藏9～15 d，處理組病情指數(shù)由11.59%升至35.88%，極顯著低于對(duì)照組。貯藏15 d，香蕉病情指數(shù)最大，處理組病情指數(shù)為35.88%，較對(duì)照組極顯著降低54.07%。綜上，正己醇處理可有效抑制貯藏期間香蕉果實(shí)病斑的擴(kuò)大和增加，降低采后果實(shí)病情指數(shù)。

2.5 采后正己醇處理對(duì)香蕉MDA 含量的影響

MDA 是膜脂過氧化的產(chǎn)物，加速采后果實(shí)衰老進(jìn)程。如圖5 所示，采后貯藏期間，香蕉MDA含量整體呈上升的趨勢(shì)。貯藏9 d，對(duì)照組MDA含量為2.4 nmol/g，顯著低于對(duì)照組，隨后于15 d迅速增至最大值6.75 nmol/g。采后貯藏期間，處理組MDA含量較對(duì)照組推遲3 d 上升，貯藏12 d，處理組MDA 含量為2.25 nmol/g，較對(duì)照組極顯著降低55.00%，隨后于貯藏15 d 迅速增至最大值4.95 nmol/g，較對(duì)照組極顯著降低26.70%。綜上，PLD 抑制劑正己醇在采后貯藏過程中可抑制MDA 生成，延緩果實(shí)衰老。

2.6 采后正己醇處理對(duì)香蕉細(xì)胞膜透性的影響

如圖6 所示，隨貯藏時(shí)間增加，香蕉的相對(duì)電導(dǎo)率整體呈上升趨勢(shì)。貯藏9 d，對(duì)照組和處理組的相對(duì)電導(dǎo)率分別為22.88%和15.75%，隨后處理組相對(duì)電導(dǎo)率于貯藏12 d 升至24.56%，較對(duì)照組極顯著下降（P<0.01）。貯藏15 d，香蕉相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到最大值，處理組的電導(dǎo)率為33.84%，較對(duì)照組極顯著降低62.20%（P<0.01）。結(jié)果分析表明，貯藏9 d 后，處理組的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均低于同期對(duì)照組，說明PLD 抑制劑正己醇可有效抑制香蕉膜脂過氧化反應(yīng)，延緩果實(shí)貯藏期限。

2.7 采后正己醇處理對(duì)香蕉PLD 酶活性的影響

磷脂酶D（PLD）是催化磷脂水解的關(guān)鍵酶，在逆境脅迫下被激活的PLD 可降解果實(shí)的細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜透性增大，促進(jìn)果實(shí)老化，降低果實(shí)品質(zhì)[24]。如圖7 所示，采后貯藏過程中，對(duì)照組PLD 含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，處理組呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)。對(duì)照組PLD 活性于貯藏15 d增至最大值590.13 U/g。貯藏3 d 處理組PLD 活性為456.25 U/g，顯著低于對(duì)照組（P<0.05），隨后于6 d 降至407 U/g，較對(duì)照組極顯著降低17.4%（P<0.01）。貯藏15 d，處理組PLD 活性增至最大值531.88 U/g，較對(duì)照組顯著降低10%（P<0.05）。處理組PLD 活性在采后貯藏期間顯著低于對(duì)照組（P<0.05），表明正己醇處理可有效抑制PLD 生成，維持果實(shí)品質(zhì)，延緩貯藏期限。

2.8 采后正己醇處理對(duì)香蕉PLDγ 基因表達(dá)的影響

如圖8 所示，香蕉PLDγ 表達(dá)量整體呈上升的趨勢(shì)。貯藏0～12 d，對(duì)照組和處理組的PLDγ表達(dá)量均較低，且兩組間的PLDγ 表達(dá)量無顯著差異。貯藏15 d，香蕉PLDγ 表達(dá)量達(dá)到峰值，處理組PLDγ 表達(dá)量為5.39，較對(duì)照組極顯著降低72.06%；對(duì)照組和處理組PLDγ 表達(dá)量較12 d上升11.18 倍和2.68 倍。綜上，PLD 抑制劑正己醇可抑制采后香蕉PLDγ 表達(dá)，降低采后果實(shí)的膜脂代謝，延長(zhǎng)貯藏期限。

2.9 采后正己醇處理對(duì)香蕉PLDζ 基因表達(dá)的影響

如圖9 所示，香蕉PLDζ 表達(dá)量在貯藏過程中呈先下降后上升的趨勢(shì)。貯藏第3 天，處理組PLDζ 表達(dá)量降至0.41，較對(duì)照組顯著降低46.75%（P<0.05），隨后上升。隨貯藏時(shí)間增加，香蕉PLDζ 表達(dá)量于15 d 達(dá)到峰值，處理組PLDζ 表達(dá)量為1.78，較對(duì)照組極顯著降低33.08%（P<0.01）。綜上，PLD 抑制劑正己醇可抑制采后香蕉PLDζ表達(dá)，降低采后果實(shí)的膜脂代謝，延長(zhǎng)貯藏期限。

3 討論

硬度是果實(shí)采后品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，可反映果實(shí)采后的耐貯性。本研究結(jié)果表明，隨貯藏時(shí)間增加，香蕉果實(shí)硬度不斷降低，但與對(duì)照組相比，正己醇處理可有效抑制香蕉果實(shí)軟化。采后貯藏期間，香蕉果實(shí)中的淀粉降解轉(zhuǎn)化成葡萄糖，使果實(shí)TSS 含量累積增大，表現(xiàn)為果實(shí)采后成熟度變大而衰老，因此TSS 含量可反映果實(shí)的營養(yǎng)價(jià)值和果實(shí)品質(zhì)[25-26]。本研究結(jié)果顯示，貯藏期間香蕉果實(shí)TSS 含量呈上升趨勢(shì)，正己醇處理在貯藏后期極顯著抑制了香蕉可溶性固形物含量上升（P<0.01），從而維持采后香蕉貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)果實(shí)貨架期。李英華[27]研究發(fā)現(xiàn)，正己醇處理顯著延緩采后草莓果實(shí)軟化、抑制MDA 累積，但對(duì)草莓TSS 含量的影響不顯著。

呼吸強(qiáng)度和病情指數(shù)是衡量果實(shí)采后貯藏期間的重要指標(biāo)[22，28]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，正己醇處理在貯藏期間可有效抑制采后香蕉果實(shí)呼吸強(qiáng)度和病情指數(shù)的上升，維持果實(shí)貯藏品質(zhì)，其中，貯藏后期抑制效果極顯著（P<0.01）?；魬椘餥12]研究了不同濃度正己醇對(duì)采后桑葚的影響，發(fā)現(xiàn)1.5 mL/L 和1.0 mL/L 正己醇抑制采后桑葚呼吸強(qiáng)度的效果最佳。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產(chǎn)物，可反映膜脂過氧化的程度[29]。果實(shí)采后的成熟衰老與膜脂過氧化反應(yīng)密切相關(guān)，機(jī)械傷等非生物性逆境脅迫會(huì)促進(jìn)膜脂過氧化反應(yīng)，造成膜透性增大，電解質(zhì)外滲，因此相對(duì)電導(dǎo)率可間接反映果實(shí)的膜透性[30-32]。本研究結(jié)果顯示，貯藏0 d 時(shí)，香蕉MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率均較低，說明此時(shí)香蕉細(xì)胞膜完整性良好，過氧化程度不大。隨貯藏時(shí)間增加，果實(shí)逐漸成熟衰老，香蕉MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，正己醇處理組MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率在貯藏后期顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說明果實(shí)的成熟衰老會(huì)引起果實(shí)膜透性的改變，正己醇處理可有效抑制果實(shí)MDA 含量上升和膜透性的增大，從而延緩果實(shí)衰老的進(jìn)程。

當(dāng)果實(shí)衰老或遭受機(jī)械損傷等逆境脅迫時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞膜發(fā)生膜脂代謝，促進(jìn)果實(shí)衰老[33]。磷脂是細(xì)胞膜的重要組成成分，PLD 是膜脂代謝過程中的關(guān)鍵酶，被激活的PLD 可催化磷脂水解，進(jìn)而破壞膜結(jié)構(gòu)和膜功能，因此，PLD 的活性可反映磷脂的降解程度。蟠桃[11]、青棗[34]和南果梨[35]的研究中表明，PLD 活性上升，膜脂代謝變快，說明PLD 在膜脂代謝中有重要作用。

本研究結(jié)果顯示，正己醇處理顯著抑制了PLD 活性的上調(diào)（P<0.05），與對(duì)照組相比，正己醇處理在貯藏結(jié)束時(shí)極顯著抑制了PLDγ 和PLDζ的表達(dá)量（P<0.01），表明PLD 抑制劑正己醇可有效延緩采后香蕉果實(shí)膜脂代謝的進(jìn)程。李銀[11]研究發(fā)現(xiàn)，正己醇和正己醛處理均可抑制PLD 活性，提高抗氧化酶系活性，延緩果實(shí)軟化，維持果實(shí)采后品質(zhì)。

綜上，正己醇處理可有效抑制采后貯藏期間香蕉果實(shí)的呼吸作用，減輕果實(shí)病情指數(shù)，從而延緩香蕉果實(shí)軟化的進(jìn)程和減慢TSS 的產(chǎn)生；另一方面，采后正己醇處理能有效抑制PLD 活性，從而降低MDA 含量和膜透性增大，并下調(diào)PLDγ和PLDζ 表達(dá)。因此，正己醇處理能夠降低機(jī)械損傷對(duì)采后果實(shí)生物膜的影響，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)和膜功能，延長(zhǎng)采后果實(shí)的貯藏期限，是維持機(jī)械傷香蕉采后貯藏品質(zhì)的新方法。但正己醇處理延緩果實(shí)衰老的機(jī)理是否與果實(shí)本身抗氧化相關(guān)酶活性的提高有關(guān)，這有待于進(jìn)一步研究。