雞傳染性法氏囊病毒變異株的分離鑒定與致病性研究

崔德桂

摘 要：為了分析和研究揚(yáng)州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)中雞傳染性法氏囊病毒變異株的致病性，本文選取發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對(duì)象，采集病料組織，進(jìn)行病毒分離鑒定和致病性研究。病雞呈典型的臨床病理癥狀，RT-PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳顯示有一條大小為709 bp的特異性電泳條帶，測(cè)序比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該雞群中存在兩種類型的變異病毒株，分別命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)顯示IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)了明顯的白色沉淀線，陰性對(duì)照卻未見任何明顯的沉淀線。IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL，IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL，IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）的ELD50為106.0/0.2 mL。人工接種感染SPF雞14 d后，IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%（7/10），IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%（10/10），IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）的致死率為90.0%（9/10）。本研究成功分離鑒定出雞傳染性法氏囊病毒變異株，并在致病性方面展開了研究，這為今后江蘇揚(yáng)州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：雞；雞傳染性法氏囊病毒；分離鑒定；致病性

中圖分類號(hào)：S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2024）05-0038-05

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是一種由雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）感染導(dǎo)致的急性高度接觸性傳染類疾病，也稱為甘波羅病或雞傳染性腔上囊病，常常侵害雞的法氏囊，導(dǎo)致雞的免疫功能障礙和疫苗免疫失敗，是目前養(yǎng)雞業(yè)中最常見的疾病之一[1]。該病的病原體是傳染性法氏囊病毒，屬于一種雙股RNA病毒科的禽雙股RNA病毒屬病毒，主要有兩種血清型。在自然條件下，雞傳染性法氏囊病毒只感染雞，且各品種雞均易感，好發(fā)于2～15周齡的幼雞，其中以3～6周齡雞發(fā)病率最高。本病毒可以通過(guò)病雞的糞便排出，造成環(huán)境、飼料和飲水污染，從而使整個(gè)雞群經(jīng)眼結(jié)膜、呼吸道和消化道傳播途徑而感染致病[2～3]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為病雞生長(zhǎng)緩慢、飲食不振、精神萎靡、貧血消瘦，嚴(yán)重病雞會(huì)發(fā)生脫水、虛弱、臥地不起、甚至死亡。剖檢可見病雞法氏囊黏膜有炎癥、出血、萎縮和壞死，胸部和腿部雞肉出血，腎臟腫脹，輸尿管出現(xiàn)白色尿酸鹽，脾臟和胃出血[4]。近年來(lái)，該病具有發(fā)病突然、發(fā)病率高、病程短、死亡率高的特點(diǎn)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，正確診斷本病，積極開展早期防控至關(guān)重要。臨床上可以根據(jù)發(fā)病的流行特征、臨床癥狀和病理變化進(jìn)行初步診斷。若要精準(zhǔn)地確診，往往需要進(jìn)行病毒的分離鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)。本研究以江蘇省揚(yáng)州市某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對(duì)象，采集病料組織進(jìn)行病毒分離鑒定，并對(duì)該病毒的致病性進(jìn)行研究，以期為今后江蘇揚(yáng)州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價(jià)值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 組織病料? 病料無(wú)菌采自2022年1月～2022年6月在江蘇揚(yáng)州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)疑似患有傳染性法氏囊病的30只病雞的法氏囊組織。

1.1.2? 主要試劑與毒株? IBDV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），Trizol總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司），瓊脂糖（OXOID），M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、dNTP、pMD18-T克隆載體、DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司，氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、鹽酸等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)的國(guó)產(chǎn)分析純。IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2.3? 引物設(shè)計(jì)? 根據(jù)NCBI庫(kù)中公布的IBDV高度保守序列VP2基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中上游引物為DV-F：5-CGATGATTACCAATTCTCA-3，下游引物為DV-R：5-GGATTATGTCTTTGAAG-3，引物合成由上海生物生工有限公司負(fù)責(zé)完成。

1.2? 方法

1.2.1? 組織病料處理? 選擇疑似雞傳染性法氏囊病的病雞，觀察其臨床癥狀和病理學(xué)變化，剖檢可見法氏囊明顯腫大、出血，胸部和腿部肌肉出血。采集法氏囊組織，經(jīng)剪碎、研磨后，加入3倍體積的PBS溶液混合制成懸液，添加5倍體積的1 000 U/mL青鏈霉素，充分研磨成糜粥狀，轉(zhuǎn)移至另一潔凈的離心管中，4 ℃靜置2 h，然后反復(fù)凍融3次，5 000 rpm離心10 min，取上層清液，備用。

1.2.2? 雞胚傳代與病毒分離? 使用0.22 μm濾膜對(duì)上述處理后的上清液進(jìn)行過(guò)濾，取0.2 mL過(guò)濾液經(jīng)尿囊膜接種至10日齡的SPF雞胚內(nèi)，轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育，24 h后，照蛋觀察雞胚情況，剔除死亡的雞胚。每間隔6 h，照蛋觀察一次，隨時(shí)剔除死亡的雞胚，連續(xù)重復(fù)5次。將雞胚轉(zhuǎn)移至4 ℃冷卻處理，無(wú)菌手術(shù)剝除蛋殼，選取尿囊膜增厚或產(chǎn)生痘斑病變的雞胚和尿囊膜、尿囊液，充分研磨后，反復(fù)凍融3次，5 000 rpm離心10 min，取上清液，繼續(xù)接種雞胚，連續(xù)傳代5次，收集第5代雞胚液，用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

1.2.3? RT-PCR檢測(cè)? 選取第5代雞胚液，按照Trizol總RNA提取試劑盒操作流程，提取病毒總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA，以該cDNA基因組作為模板，以DV-F和DV-R作為上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2 μL 10×反應(yīng)緩沖液、1 μL dNTPs、0.5 μL上游引物DV-F、0.5 μL下游引物DV-R、0.5 μL Taq DNA聚合酶，1 μL cDNA模板，添加滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性40 s，49 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)分析。

1.2.4? 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)? 按照瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的常規(guī)操作步驟，制作1%濃度的瓊脂板、打孔、封底，分別加入雞胚分離的IBDV毒株、IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）、生理鹽水空白對(duì)照、SPF雞血清陰性對(duì)照，觀察和比較分析各樣品孔是否出現(xiàn)明顯的白色沉淀線。

1.2.5? 致病性測(cè)定

1.2.5.1? 雞胚半數(shù)致死量（ELD50）測(cè)定? 使用滅菌PBS將IBDV病毒液分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，每個(gè)濃度接種6枚10日齡SPF雞胚，接種量為0.2 mL/枚，同時(shí)以PBS作為陰性對(duì)照。依據(jù)Reed-Muench法來(lái)計(jì)算本研究分離病毒株的ELD50。

1.2.5.2? SPF雞致死率測(cè)定? 將分離病毒分別經(jīng)滴鼻的方式接種10只28日齡SPF雞，按照每只雞接種量為10 ELD50/0.2 mL進(jìn)行操作，同時(shí)以PBS滴鼻28日齡SPF雞作為陰性對(duì)照，采取隔離飼養(yǎng)。攻毒后，每天觀察SPF雞的死亡情況，連續(xù)跟蹤記錄14 d，比較和分析病毒對(duì)SPF雞的致死率情況。

2? 結(jié)果

2.1? 臨床癥狀

發(fā)病雞主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、雙翅下垂、虛弱消瘦、喜臥不起、排白色稀粥樣糞便等臨床癥狀。剖檢可見，法氏囊明顯腫大、出血、有膠凍樣炎性滲出物，腿部肌肉、胸部肌肉有出血斑點(diǎn)，肝臟、脾臟、腺胃、肌胃等多處有出血癥狀。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)法氏囊內(nèi)有大量的異嗜性細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖，脾臟和法氏囊濾泡中可見B淋巴細(xì)胞發(fā)生一定程度的破裂和崩解。

2.2? RT-PCR及測(cè)序結(jié)果分析

分離病毒株經(jīng)提取RNA后，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見一條大小為709 bp的特異性電泳條帶，與預(yù)期目的條帶大小相一致，見圖1。經(jīng)進(jìn)一步的基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這些雞群中存在兩種變異病毒株，其基因序列存在不一致，將分離獲得的病毒株命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。

2.3? 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果分析

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)顯示，IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)了明顯的白色沉淀線，陰性對(duì)照卻未見任何明顯的沉淀線，這說(shuō)明分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2和IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株能夠與IBDV血清發(fā)生反應(yīng)。

2.4? 致病性結(jié)果分析

將分離病毒株和陽(yáng)性對(duì)照病毒株分別稀釋成不同濃度梯度來(lái)接種SPF雞胚，測(cè)定其毒價(jià)，依據(jù)Reed-Muench法計(jì)算0.2 mL尿囊膜懸浮液中的病毒ELD50，結(jié)果顯示IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL，IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL，IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）的ELD50為106.0/0.2 mL。通過(guò)人工接種感染SPF雞試驗(yàn)結(jié)果顯示，感染14 d后，IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%（7/10），IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%（10/10），IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）的致死率為90.0%（9/10）。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1所示。

3? 討論

雞傳染性法氏囊病最早見報(bào)道是在1962年美國(guó)特拉華州甘布羅鎮(zhèn)某肉雞群，隨后陸續(xù)流行至英國(guó)、印度、中國(guó)、日本等國(guó)家，常導(dǎo)致病雞體重下降、脫水、出血和死亡[1，5]。本病可發(fā)生于任何品種的雞，尤以肉雞最易感，常發(fā)生于2～15周齡的雞，且最易發(fā)于3～6周齡的雞，可通過(guò)接觸病雞的飼料、糞便、飲水、用具等方式傳播，一旦感染，死亡率可高達(dá)70%以上，給養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展造成了較大的影響[6]。因此，積極正確地診斷雞傳染性法氏囊病，對(duì)于群體發(fā)病的防控具有重要意義。

目前，為了精準(zhǔn)確診，一般均采取病毒分離和血清學(xué)鑒定。孟凱等[7]通過(guò)對(duì)山東省不同地區(qū)的疑似傳染性法氏囊病的病雞采集病料，分離鑒定出3株雞傳染性法氏囊病毒株，同源性為96.3%～99.3%。揭鴻英等[8]通過(guò)對(duì)江蘇地區(qū)的雞傳染性法氏囊病毒的分離和鑒定，獲得一株超強(qiáng)毒株NJ09，且對(duì)60日齡的SPF雞致死率達(dá)到100%。嚴(yán)專強(qiáng)等[9]通過(guò)對(duì)廣東省某肉雞場(chǎng)中的疑似雞傳染性法氏囊病的病雞中分離出一株毒性較強(qiáng)的病毒株，與經(jīng)典毒株的同源性為97.5%，口服接種SPF雞后可導(dǎo)致雞死亡，法氏囊出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮和出血癥狀。

本研究通過(guò)對(duì)江蘇揚(yáng)州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)疑似患有雞傳染性法氏囊病的30只雞進(jìn)行觀察，并采集病料、分離鑒定，結(jié)果表明病雞呈典型的雞傳染性法氏囊病臨床病理特點(diǎn)；提取病毒RNA后，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳顯示有一條大小為709 bp的特異性電泳條帶，測(cè)序比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該雞群中存在兩種類型的變異病毒株，分別命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)顯示IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)明顯的白色沉淀線，陰性對(duì)照卻未見任何明顯的沉淀線，這說(shuō)明分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2和IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株能夠與IBDV血清發(fā)生反應(yīng)。此外，在致病性研究中顯示，IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL，IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL，IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）的ELD50為106.0/0.2 mL。通過(guò)人工接種感染SPF雞試驗(yàn)結(jié)果顯示，感染14 d后，IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%（7/10），IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%（10/10），IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株（BC6/85）的致死率為90.0%（9/10）。本研究的上述結(jié)果與目前國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的雞傳染性法氏囊病相關(guān)研究報(bào)道文獻(xiàn)較一致[7-10]。

綜上所述，本研究選取了江蘇省揚(yáng)州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對(duì)象，采集病料組織，成功地分離鑒定出雞傳染性法氏囊病毒變異株，并在致病性方面開展了研究，這為今后江蘇揚(yáng)州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價(jià)值。

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