崔德桂
摘 要:為了分析和研究揚(yáng)州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)中雞傳染性法氏囊病毒變異株的致病性,本文選取發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對(duì)象,采集病料組織,進(jìn)行病毒分離鑒定和致病性研究。病雞呈典型的臨床病理癥狀,RT-PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳顯示有一條大小為709 bp的特異性電泳條帶,測(cè)序比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該雞群中存在兩種類型的變異病毒株,分別命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)顯示IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)了明顯的白色沉淀線,陰性對(duì)照卻未見任何明顯的沉淀線。IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL,IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL,IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)的ELD50為106.0/0.2 mL。人工接種感染SPF雞14 d后,IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%(7/10),IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%(10/10),IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)的致死率為90.0%(9/10)。本研究成功分離鑒定出雞傳染性法氏囊病毒變異株,并在致病性方面展開了研究,這為今后江蘇揚(yáng)州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價(jià)值。
關(guān)鍵詞:雞;雞傳染性法氏囊病毒;分離鑒定;致病性
中圖分類號(hào):S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):1673-1085(2024)05-0038-05
雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease,IBD)是一種由雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)感染導(dǎo)致的急性高度接觸性傳染類疾病,也稱為甘波羅病或雞傳染性腔上囊病,常常侵害雞的法氏囊,導(dǎo)致雞的免疫功能障礙和疫苗免疫失敗,是目前養(yǎng)雞業(yè)中最常見的疾病之一[1]。該病的病原體是傳染性法氏囊病毒,屬于一種雙股RNA病毒科的禽雙股RNA病毒屬病毒,主要有兩種血清型。在自然條件下,雞傳染性法氏囊病毒只感染雞,且各品種雞均易感,好發(fā)于2~15周齡的幼雞,其中以3~6周齡雞發(fā)病率最高。本病毒可以通過(guò)病雞的糞便排出,造成環(huán)境、飼料和飲水污染,從而使整個(gè)雞群經(jīng)眼結(jié)膜、呼吸道和消化道傳播途徑而感染致病[2~3]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為病雞生長(zhǎng)緩慢、飲食不振、精神萎靡、貧血消瘦,嚴(yán)重病雞會(huì)發(fā)生脫水、虛弱、臥地不起、甚至死亡。剖檢可見病雞法氏囊黏膜有炎癥、出血、萎縮和壞死,胸部和腿部雞肉出血,腎臟腫脹,輸尿管出現(xiàn)白色尿酸鹽,脾臟和胃出血[4]。近年來(lái),該病具有發(fā)病突然、發(fā)病率高、病程短、死亡率高的特點(diǎn),給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,正確診斷本病,積極開展早期防控至關(guān)重要。臨床上可以根據(jù)發(fā)病的流行特征、臨床癥狀和病理變化進(jìn)行初步診斷。若要精準(zhǔn)地確診,往往需要進(jìn)行病毒的分離鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)。本研究以江蘇省揚(yáng)州市某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對(duì)象,采集病料組織進(jìn)行病毒分離鑒定,并對(duì)該病毒的致病性進(jìn)行研究,以期為今后江蘇揚(yáng)州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價(jià)值。
1? 材料與方法
1.1? 材料
1.1.1? 組織病料? 病料無(wú)菌采自2022年1月~2022年6月在江蘇揚(yáng)州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)疑似患有傳染性法氏囊病的30只病雞的法氏囊組織。
1.1.2? 主要試劑與毒株? IBDV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),Trizol總RNA提取試劑盒(Invitrogen公司),瓊脂糖(OXOID),M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、dNTP、pMD18-T克隆載體、DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司,氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、鹽酸等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)的國(guó)產(chǎn)分析純。IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。
1.2.3? 引物設(shè)計(jì)? 根據(jù)NCBI庫(kù)中公布的IBDV高度保守序列VP2基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì),其中上游引物為DV-F:5-CGATGATTACCAATTCTCA-3,下游引物為DV-R:5-GGATTATGTCTTTGAAG-3,引物合成由上海生物生工有限公司負(fù)責(zé)完成。
1.2? 方法
1.2.1? 組織病料處理? 選擇疑似雞傳染性法氏囊病的病雞,觀察其臨床癥狀和病理學(xué)變化,剖檢可見法氏囊明顯腫大、出血,胸部和腿部肌肉出血。采集法氏囊組織,經(jīng)剪碎、研磨后,加入3倍體積的PBS溶液混合制成懸液,添加5倍體積的1 000 U/mL青鏈霉素,充分研磨成糜粥狀,轉(zhuǎn)移至另一潔凈的離心管中,4 ℃靜置2 h,然后反復(fù)凍融3次,5 000 rpm離心10 min,取上層清液,備用。
1.2.2? 雞胚傳代與病毒分離? 使用0.22 μm濾膜對(duì)上述處理后的上清液進(jìn)行過(guò)濾,取0.2 mL過(guò)濾液經(jīng)尿囊膜接種至10日齡的SPF雞胚內(nèi),轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育,24 h后,照蛋觀察雞胚情況,剔除死亡的雞胚。每間隔6 h,照蛋觀察一次,隨時(shí)剔除死亡的雞胚,連續(xù)重復(fù)5次。將雞胚轉(zhuǎn)移至4 ℃冷卻處理,無(wú)菌手術(shù)剝除蛋殼,選取尿囊膜增厚或產(chǎn)生痘斑病變的雞胚和尿囊膜、尿囊液,充分研磨后,反復(fù)凍融3次,5 000 rpm離心10 min,取上清液,繼續(xù)接種雞胚,連續(xù)傳代5次,收集第5代雞胚液,用于后續(xù)試驗(yàn)研究。
1.2.3? RT-PCR檢測(cè)? 選取第5代雞胚液,按照Trizol總RNA提取試劑盒操作流程,提取病毒總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA,以該cDNA基因組作為模板,以DV-F和DV-R作為上下游引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:2 μL 10×反應(yīng)緩沖液、1 μL dNTPs、0.5 μL上游引物DV-F、0.5 μL下游引物DV-R、0.5 μL Taq DNA聚合酶,1 μL cDNA模板,添加滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性40 s,49 ℃退火35 s,72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃繼續(xù)延伸5 min,4 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn),并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)分析。
1.2.4? 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)? 按照瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的常規(guī)操作步驟,制作1%濃度的瓊脂板、打孔、封底,分別加入雞胚分離的IBDV毒株、IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)、生理鹽水空白對(duì)照、SPF雞血清陰性對(duì)照,觀察和比較分析各樣品孔是否出現(xiàn)明顯的白色沉淀線。
1.2.5? 致病性測(cè)定
1.2.5.1? 雞胚半數(shù)致死量(ELD50)測(cè)定? 使用滅菌PBS將IBDV病毒液分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5,每個(gè)濃度接種6枚10日齡SPF雞胚,接種量為0.2 mL/枚,同時(shí)以PBS作為陰性對(duì)照。依據(jù)Reed-Muench法來(lái)計(jì)算本研究分離病毒株的ELD50。
1.2.5.2? SPF雞致死率測(cè)定? 將分離病毒分別經(jīng)滴鼻的方式接種10只28日齡SPF雞,按照每只雞接種量為10 ELD50/0.2 mL進(jìn)行操作,同時(shí)以PBS滴鼻28日齡SPF雞作為陰性對(duì)照,采取隔離飼養(yǎng)。攻毒后,每天觀察SPF雞的死亡情況,連續(xù)跟蹤記錄14 d,比較和分析病毒對(duì)SPF雞的致死率情況。
2? 結(jié)果
2.1? 臨床癥狀
發(fā)病雞主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、雙翅下垂、虛弱消瘦、喜臥不起、排白色稀粥樣糞便等臨床癥狀。剖檢可見,法氏囊明顯腫大、出血、有膠凍樣炎性滲出物,腿部肌肉、胸部肌肉有出血斑點(diǎn),肝臟、脾臟、腺胃、肌胃等多處有出血癥狀。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)法氏囊內(nèi)有大量的異嗜性細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖,脾臟和法氏囊濾泡中可見B淋巴細(xì)胞發(fā)生一定程度的破裂和崩解。
2.2? RT-PCR及測(cè)序結(jié)果分析
分離病毒株經(jīng)提取RNA后,進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見一條大小為709 bp的特異性電泳條帶,與預(yù)期目的條帶大小相一致,見圖1。經(jīng)進(jìn)一步的基因測(cè)序,發(fā)現(xiàn)這些雞群中存在兩種變異病毒株,其基因序列存在不一致,將分離獲得的病毒株命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。
2.3? 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果分析
瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)顯示,IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)了明顯的白色沉淀線,陰性對(duì)照卻未見任何明顯的沉淀線,這說(shuō)明分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2和IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株能夠與IBDV血清發(fā)生反應(yīng)。
2.4? 致病性結(jié)果分析
將分離病毒株和陽(yáng)性對(duì)照病毒株分別稀釋成不同濃度梯度來(lái)接種SPF雞胚,測(cè)定其毒價(jià),依據(jù)Reed-Muench法計(jì)算0.2 mL尿囊膜懸浮液中的病毒ELD50,結(jié)果顯示IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL,IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL,IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)的ELD50為106.0/0.2 mL。通過(guò)人工接種感染SPF雞試驗(yàn)結(jié)果顯示,感染14 d后,IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%(7/10),IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%(10/10),IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)的致死率為90.0%(9/10)。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1所示。
3? 討論
雞傳染性法氏囊病最早見報(bào)道是在1962年美國(guó)特拉華州甘布羅鎮(zhèn)某肉雞群,隨后陸續(xù)流行至英國(guó)、印度、中國(guó)、日本等國(guó)家,常導(dǎo)致病雞體重下降、脫水、出血和死亡[1,5]。本病可發(fā)生于任何品種的雞,尤以肉雞最易感,常發(fā)生于2~15周齡的雞,且最易發(fā)于3~6周齡的雞,可通過(guò)接觸病雞的飼料、糞便、飲水、用具等方式傳播,一旦感染,死亡率可高達(dá)70%以上,給養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展造成了較大的影響[6]。因此,積極正確地診斷雞傳染性法氏囊病,對(duì)于群體發(fā)病的防控具有重要意義。
目前,為了精準(zhǔn)確診,一般均采取病毒分離和血清學(xué)鑒定。孟凱等[7]通過(guò)對(duì)山東省不同地區(qū)的疑似傳染性法氏囊病的病雞采集病料,分離鑒定出3株雞傳染性法氏囊病毒株,同源性為96.3%~99.3%。揭鴻英等[8]通過(guò)對(duì)江蘇地區(qū)的雞傳染性法氏囊病毒的分離和鑒定,獲得一株超強(qiáng)毒株NJ09,且對(duì)60日齡的SPF雞致死率達(dá)到100%。嚴(yán)專強(qiáng)等[9]通過(guò)對(duì)廣東省某肉雞場(chǎng)中的疑似雞傳染性法氏囊病的病雞中分離出一株毒性較強(qiáng)的病毒株,與經(jīng)典毒株的同源性為97.5%,口服接種SPF雞后可導(dǎo)致雞死亡,法氏囊出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮和出血癥狀。
本研究通過(guò)對(duì)江蘇揚(yáng)州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)疑似患有雞傳染性法氏囊病的30只雞進(jìn)行觀察,并采集病料、分離鑒定,結(jié)果表明病雞呈典型的雞傳染性法氏囊病臨床病理特點(diǎn);提取病毒RNA后,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳顯示有一條大小為709 bp的特異性電泳條帶,測(cè)序比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該雞群中存在兩種類型的變異病毒株,分別命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)顯示IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)明顯的白色沉淀線,陰性對(duì)照卻未見任何明顯的沉淀線,這說(shuō)明分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2和IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株能夠與IBDV血清發(fā)生反應(yīng)。此外,在致病性研究中顯示,IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL,IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL,IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)的ELD50為106.0/0.2 mL。通過(guò)人工接種感染SPF雞試驗(yàn)結(jié)果顯示,感染14 d后,IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%(7/10),IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%(10/10),IBDV陽(yáng)性對(duì)照毒株(BC6/85)的致死率為90.0%(9/10)。本研究的上述結(jié)果與目前國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的雞傳染性法氏囊病相關(guān)研究報(bào)道文獻(xiàn)較一致[7-10]。
綜上所述,本研究選取了江蘇省揚(yáng)州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對(duì)象,采集病料組織,成功地分離鑒定出雞傳染性法氏囊病毒變異株,并在致病性方面開展了研究,這為今后江蘇揚(yáng)州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價(jià)值。
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