雞傳染性法氏囊病毒變異株的分離鑒定與致病性研究

崔德桂

摘 要：為了分析和研究揚州地區(qū)某養(yǎng)殖場中雞傳染性法氏囊病毒變異株的致病性，本文選取發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對象，采集病料組織，進行病毒分離鑒定和致病性研究。病雞呈典型的臨床病理癥狀，RT-PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳顯示有一條大小為709 bp的特異性電泳條帶，測序比對分析發(fā)現(xiàn)該雞群中存在兩種類型的變異病毒株，分別命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。瓊脂擴散試驗顯示IBDV陽性對照毒株（BC6/85）、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)了明顯的白色沉淀線，陰性對照卻未見任何明顯的沉淀線。IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL，IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL，IBDV陽性對照毒株（BC6/85）的ELD50為106.0/0.2 mL。人工接種感染SPF雞14 d后，IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%（7/10），IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%（10/10），IBDV陽性對照毒株（BC6/85）的致死率為90.0%（9/10）。本研究成功分離鑒定出雞傳染性法氏囊病毒變異株，并在致病性方面展開了研究，這為今后江蘇揚州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價值。

關(guān)鍵詞：雞；雞傳染性法氏囊病毒；分離鑒定；致病性

中圖分類號：S858.31文獻標識碼：B文章編號：1673-1085（2024）05-0038-05

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是一種由雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）感染導(dǎo)致的急性高度接觸性傳染類疾病，也稱為甘波羅病或雞傳染性腔上囊病，常常侵害雞的法氏囊，導(dǎo)致雞的免疫功能障礙和疫苗免疫失敗，是目前養(yǎng)雞業(yè)中最常見的疾病之一[1]。該病的病原體是傳染性法氏囊病毒，屬于一種雙股RNA病毒科的禽雙股RNA病毒屬病毒，主要有兩種血清型。在自然條件下，雞傳染性法氏囊病毒只感染雞，且各品種雞均易感，好發(fā)于2～15周齡的幼雞，其中以3～6周齡雞發(fā)病率最高。本病毒可以通過病雞的糞便排出，造成環(huán)境、飼料和飲水污染，從而使整個雞群經(jīng)眼結(jié)膜、呼吸道和消化道傳播途徑而感染致病[2～3]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為病雞生長緩慢、飲食不振、精神萎靡、貧血消瘦，嚴重病雞會發(fā)生脫水、虛弱、臥地不起、甚至死亡。剖檢可見病雞法氏囊黏膜有炎癥、出血、萎縮和壞死，胸部和腿部雞肉出血，腎臟腫脹，輸尿管出現(xiàn)白色尿酸鹽，脾臟和胃出血[4]。近年來，該病具有發(fā)病突然、發(fā)病率高、病程短、死亡率高的特點，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，正確診斷本病，積極開展早期防控至關(guān)重要。臨床上可以根據(jù)發(fā)病的流行特征、臨床癥狀和病理變化進行初步診斷。若要精準地確診，往往需要進行病毒的分離鑒定和血清學(xué)試驗。本研究以江蘇省揚州市某養(yǎng)殖場發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對象，采集病料組織進行病毒分離鑒定，并對該病毒的致病性進行研究，以期為今后江蘇揚州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 組織病料? 病料無菌采自2022年1月～2022年6月在江蘇揚州地區(qū)某養(yǎng)殖場疑似患有傳染性法氏囊病的30只病雞的法氏囊組織。

1.1.2? 主要試劑與毒株? IBDV陽性標準血清（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），Trizol總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司），瓊脂糖（OXOID），M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、dNTP、pMD18-T克隆載體、DNA連接酶、各種限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司，氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、鹽酸等均購自國藥集團的國產(chǎn)分析純。IBDV陽性對照毒株（BC6/85）由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2.3? 引物設(shè)計? 根據(jù)NCBI庫中公布的IBDV高度保守序列VP2基因進行引物設(shè)計，其中上游引物為DV-F：5-CGATGATTACCAATTCTCA-3，下游引物為DV-R：5-GGATTATGTCTTTGAAG-3，引物合成由上海生物生工有限公司負責(zé)完成。

1.2? 方法

1.2.1? 組織病料處理? 選擇疑似雞傳染性法氏囊病的病雞，觀察其臨床癥狀和病理學(xué)變化，剖檢可見法氏囊明顯腫大、出血，胸部和腿部肌肉出血。采集法氏囊組織，經(jīng)剪碎、研磨后，加入3倍體積的PBS溶液混合制成懸液，添加5倍體積的1 000 U/mL青鏈霉素，充分研磨成糜粥狀，轉(zhuǎn)移至另一潔凈的離心管中，4 ℃靜置2 h，然后反復(fù)凍融3次，5 000 rpm離心10 min，取上層清液，備用。

1.2.2? 雞胚傳代與病毒分離? 使用0.22 μm濾膜對上述處理后的上清液進行過濾，取0.2 mL過濾液經(jīng)尿囊膜接種至10日齡的SPF雞胚內(nèi)，轉(zhuǎn)移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育，24 h后，照蛋觀察雞胚情況，剔除死亡的雞胚。每間隔6 h，照蛋觀察一次，隨時剔除死亡的雞胚，連續(xù)重復(fù)5次。將雞胚轉(zhuǎn)移至4 ℃冷卻處理，無菌手術(shù)剝除蛋殼，選取尿囊膜增厚或產(chǎn)生痘斑病變的雞胚和尿囊膜、尿囊液，充分研磨后，反復(fù)凍融3次，5 000 rpm離心10 min，取上清液，繼續(xù)接種雞胚，連續(xù)傳代5次，收集第5代雞胚液，用于后續(xù)試驗研究。

1.2.3? RT-PCR檢測? 選取第5代雞胚液，按照Trizol總RNA提取試劑盒操作流程，提取病毒總RNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄合成病毒cDNA，以該cDNA基因組作為模板，以DV-F和DV-R作為上下游引物，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：2 μL 10×反應(yīng)緩沖液、1 μL dNTPs、0.5 μL上游引物DV-F、0.5 μL下游引物DV-R、0.5 μL Taq DNA聚合酶，1 μL cDNA模板，添加滅菌雙蒸水補齊至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性40 s，49 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳試驗，并對PCR產(chǎn)物進行測序和序列比對分析。

1.2.4? 瓊脂擴散試驗? 按照瓊脂擴散試驗的常規(guī)操作步驟，制作1%濃度的瓊脂板、打孔、封底，分別加入雞胚分離的IBDV毒株、IBDV陽性對照毒株（BC6/85）、生理鹽水空白對照、SPF雞血清陰性對照，觀察和比較分析各樣品孔是否出現(xiàn)明顯的白色沉淀線。

1.2.5? 致病性測定

1.2.5.1? 雞胚半數(shù)致死量（ELD50）測定? 使用滅菌PBS將IBDV病毒液分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，每個濃度接種6枚10日齡SPF雞胚，接種量為0.2 mL/枚，同時以PBS作為陰性對照。依據(jù)Reed-Muench法來計算本研究分離病毒株的ELD50。

1.2.5.2? SPF雞致死率測定? 將分離病毒分別經(jīng)滴鼻的方式接種10只28日齡SPF雞，按照每只雞接種量為10 ELD50/0.2 mL進行操作，同時以PBS滴鼻28日齡SPF雞作為陰性對照，采取隔離飼養(yǎng)。攻毒后，每天觀察SPF雞的死亡情況，連續(xù)跟蹤記錄14 d，比較和分析病毒對SPF雞的致死率情況。

2? 結(jié)果

2.1? 臨床癥狀

發(fā)病雞主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、雙翅下垂、虛弱消瘦、喜臥不起、排白色稀粥樣糞便等臨床癥狀。剖檢可見，法氏囊明顯腫大、出血、有膠凍樣炎性滲出物，腿部肌肉、胸部肌肉有出血斑點，肝臟、脾臟、腺胃、肌胃等多處有出血癥狀。病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)法氏囊內(nèi)有大量的異嗜性細胞浸潤和增殖，脾臟和法氏囊濾泡中可見B淋巴細胞發(fā)生一定程度的破裂和崩解。

2.2? RT-PCR及測序結(jié)果分析

分離病毒株經(jīng)提取RNA后，進行RT-PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見一條大小為709 bp的特異性電泳條帶，與預(yù)期目的條帶大小相一致，見圖1。經(jīng)進一步的基因測序，發(fā)現(xiàn)這些雞群中存在兩種變異病毒株，其基因序列存在不一致，將分離獲得的病毒株命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。

2.3? 瓊脂擴散試驗結(jié)果分析

瓊脂擴散試驗顯示，IBDV陽性對照毒株（BC6/85）、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)了明顯的白色沉淀線，陰性對照卻未見任何明顯的沉淀線，這說明分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2和IBDV陽性對照毒株能夠與IBDV血清發(fā)生反應(yīng)。

2.4? 致病性結(jié)果分析

將分離病毒株和陽性對照病毒株分別稀釋成不同濃度梯度來接種SPF雞胚，測定其毒價，依據(jù)Reed-Muench法計算0.2 mL尿囊膜懸浮液中的病毒ELD50，結(jié)果顯示IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL，IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL，IBDV陽性對照毒株（BC6/85）的ELD50為106.0/0.2 mL。通過人工接種感染SPF雞試驗結(jié)果顯示，感染14 d后，IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%（7/10），IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%（10/10），IBDV陽性對照毒株（BC6/85）的致死率為90.0%（9/10）。詳細數(shù)據(jù)見表1所示。

3? 討論

雞傳染性法氏囊病最早見報道是在1962年美國特拉華州甘布羅鎮(zhèn)某肉雞群，隨后陸續(xù)流行至英國、印度、中國、日本等國家，常導(dǎo)致病雞體重下降、脫水、出血和死亡[1，5]。本病可發(fā)生于任何品種的雞，尤以肉雞最易感，常發(fā)生于2～15周齡的雞，且最易發(fā)于3～6周齡的雞，可通過接觸病雞的飼料、糞便、飲水、用具等方式傳播，一旦感染，死亡率可高達70%以上，給養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展造成了較大的影響[6]。因此，積極正確地診斷雞傳染性法氏囊病，對于群體發(fā)病的防控具有重要意義。

目前，為了精準確診，一般均采取病毒分離和血清學(xué)鑒定。孟凱等[7]通過對山東省不同地區(qū)的疑似傳染性法氏囊病的病雞采集病料，分離鑒定出3株雞傳染性法氏囊病毒株，同源性為96.3%～99.3%。揭鴻英等[8]通過對江蘇地區(qū)的雞傳染性法氏囊病毒的分離和鑒定，獲得一株超強毒株NJ09，且對60日齡的SPF雞致死率達到100%。嚴專強等[9]通過對廣東省某肉雞場中的疑似雞傳染性法氏囊病的病雞中分離出一株毒性較強的病毒株，與經(jīng)典毒株的同源性為97.5%，口服接種SPF雞后可導(dǎo)致雞死亡，法氏囊出現(xiàn)嚴重萎縮和出血癥狀。

本研究通過對江蘇揚州地區(qū)某養(yǎng)殖場疑似患有雞傳染性法氏囊病的30只雞進行觀察，并采集病料、分離鑒定，結(jié)果表明病雞呈典型的雞傳染性法氏囊病臨床病理特點；提取病毒RNA后，經(jīng)RT-PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳顯示有一條大小為709 bp的特異性電泳條帶，測序比對分析發(fā)現(xiàn)該雞群中存在兩種類型的變異病毒株，分別命名為IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。瓊脂擴散試驗顯示IBDV陽性對照毒株（BC6/85）、分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2三株病毒株的瓊脂板樣品孔均出現(xiàn)明顯的白色沉淀線，陰性對照卻未見任何明顯的沉淀線，這說明分離毒株IBDVYZ-1、分離毒株IBDVYZ-2和IBDV陽性對照毒株能夠與IBDV血清發(fā)生反應(yīng)。此外，在致病性研究中顯示，IBDVYZ-1病毒株的ELD50為105.5/0.2 mL，IBDVYZ-2病毒株的ELD50為106.5/0.2 mL，IBDV陽性對照毒株（BC6/85）的ELD50為106.0/0.2 mL。通過人工接種感染SPF雞試驗結(jié)果顯示，感染14 d后，IBDVYZ-1病毒株的致死率為70.0%（7/10），IBDVYZ-2病毒株的致死率為100.0%（10/10），IBDV陽性對照毒株（BC6/85）的致死率為90.0%（9/10）。本研究的上述結(jié)果與目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的雞傳染性法氏囊病相關(guān)研究報道文獻較一致[7-10]。

綜上所述，本研究選取了江蘇省揚州地區(qū)某養(yǎng)殖場發(fā)生雞傳染性法氏囊病的30只病雞作為研究對象，采集病料組織，成功地分離鑒定出雞傳染性法氏囊病毒變異株，并在致病性方面開展了研究，這為今后江蘇揚州地區(qū)的雞傳染性法氏囊病的科學(xué)有效防治提供參考價值。

參考文獻：

[1]董素鳳.雞傳染性法氏囊病的防控措施[J].家禽科學(xué)，2023，45（10）：49-50.

[2]張子言，楊冰歡，譚磊，等.傳染性法氏囊病病毒變異株的分離鑒定與分析[J/OL].中國動物傳染病學(xué)報，1-13[2023-11-09].

[3]何獻銘，任廣彩，葉俊賢，等.1株傳染性法氏囊病病毒的分離鑒定及VP2基因序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2022，49（3）：1005-1014.

[4]崔平，牛曉賽，董新榮，等.蛋雞源傳染性法氏囊病病毒變異株的分離、鑒定及攻毒保護試驗[J].中國家禽，2020，42（9）：35-39.

[5]于雷，潘雨，高潔，等.傳染性法氏囊病病毒超強毒株ZHA001株的分離及鑒定[J].中國獸藥雜志，2022，56（10）：18-24.

[6]鄒濰力，黃添祥，歐陽志良，等.一例雞傳染性法氏囊病毒新型變異株的分離與鑒定[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2022（7）：22-25.

[7]孟凱，袁小遠，張玉霞，等.3株傳染性法氏囊病病毒的分離與鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，50（11）：129-132.

[8]揭鴻英，朱亞露，畢志香，等.雞傳染性法氏囊病病毒超強毒江蘇分離株的鑒定及其致病特征分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2017，49（10）：62-68.

[9]嚴專強，尹麗娟，劉琳琳，等.雞傳染性法氏囊病毒新型變異株的分離鑒定[J].家禽科學(xué)，2020（7）：50-52.

[10]姜婷婷，焦曉麗，吳村，等.傳染性法氏囊病病毒新型變異株的分離和鑒定[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2023，44（5）：44-49.