達(dá)格列凈中特定雜質(zhì)分析及穩(wěn)定性研究

范祥元 杜陳俠

摘 要：為建立達(dá)格列凈中的特定雜質(zhì)DGL301分析方法，采用十四酸丙酰胺基團(tuán)鍵合硅膠為填充劑（Poroshell 120Bonus-RP，100 mm×4.6 mm，2.7 μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；流動(dòng)相A：0.085%的磷酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；控制體積流量為1.0 mL/min進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣體積10 μL。在優(yōu)化的色譜條件下，主峰、特定雜質(zhì)DGL301及其他雜質(zhì)分離度符合要求；特定雜質(zhì)DGL301在0.16～0.79 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為A =24.869 C+0.5787，r =0.9992，檢測(cè)限為17.56 ng·mL-1，定量限為59.85 ng·mL-1，RSD=0.9%（n =6），平均回收率為98.37%（n =9）。本方法可用于達(dá)格列凈中特定雜質(zhì)DGL301的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：達(dá)格列凈，特定雜質(zhì)，高效液相色譜法

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.05.036

0 引 言

達(dá)格列凈原研企業(yè)為百時(shí)美施貴寶公司和阿斯利康公司，其為SGLT2抑制劑，于2012年12月在歐盟獲批上市，臨床適應(yīng)證為2型糖尿病，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)國(guó)內(nèi)上市的生產(chǎn)企業(yè)僅有3家。研究表明，達(dá)格列凈降糖通過二個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)降糖作用[1-2]：第一，通過調(diào)節(jié)抑制腎臟對(duì)葡萄糖的重吸收作用，第二、通過增加腎臟對(duì)葡萄糖的排泄作用。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，關(guān)于達(dá)格列凈的研究方向主要集中在臨床領(lǐng)域，針對(duì)達(dá)格列凈雜質(zhì)分析研究報(bào)告很少，截至投稿，國(guó)內(nèi)外針對(duì)達(dá)格列凈雜質(zhì)分析公開發(fā)表的文章不足10篇[3-7]。研究人員通過對(duì)合成工藝的深入研究，將產(chǎn)生可能性最大的DGL301定為特定雜質(zhì)，而此雜質(zhì)在進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)未進(jìn)行控制，已發(fā)表的文獻(xiàn)中也未對(duì)此雜質(zhì)進(jìn)行報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了達(dá)格列凈雜質(zhì)分析方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為達(dá)格列凈原料藥雜質(zhì)評(píng)價(jià)方法。

1 儀器與試藥

氣相色譜儀；梅特勒XS105電子天平。

達(dá)格列凈原料藥（宣城美諾華藥業(yè)有限公司，批號(hào)為DGBB-9-210901、DGBB-9-210902、DGBB-9-210903）；DGL301對(duì)照品（批號(hào)07-APR-20-16-01，純度97.8%），達(dá)格列凈對(duì)照品（宣城美諾華藥業(yè)有限公司自制，批號(hào)D009-200402KB）。

鹽酸、氫氧化鈉、30％過氧化氫為分析純，乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent In f inity L ab Poroshell120Bonus-RP（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相A：0.085%的磷酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫；流速為1.0 mL /min；檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 溶液制備

稀釋劑∶乙腈∶水=50∶50（V/V）

雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液：稱取DGL301雜質(zhì)對(duì)照品3 mg，取稀釋液溶解并稀釋至濃度為0.03 mg/mL雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：稱取達(dá)格列凈對(duì)照品15 mg及雜質(zhì)DGL301儲(chǔ)備溶液0.5 mL，取稀釋液溶解并稀釋至DGL301濃度為0.03 μg/mL雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液（達(dá)格列凈：0.03 μg/mL）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱取達(dá)格列凈對(duì)照品15 mg，取稀釋液溶解并稀釋至濃度為0.03 μg/mL。

樣品溶液： 在50 mL容量瓶中加入本品15 mg，加入稀釋劑超聲處理至完全溶解，定容至刻度，搖勻。平行配制2份。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)圖譜如圖1所示。結(jié)果表明，主峰與雜質(zhì)DGL301依次出峰，分離度為4.3，符合分析要求。

2.4 檢測(cè)方法

測(cè)定法：精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。限度：按外標(biāo)法以對(duì)照品溶液主峰峰面積計(jì)算，DGL不得大于0.10%，其他單個(gè)雜質(zhì)不得大于0.10%，各雜質(zhì)的和不得大于1.0%。供試品溶液色譜圖中小于0.05%的雜質(zhì)忽略不計(jì)。

2.5 專屬性試驗(yàn)

（1）酸破壞。50 mL量瓶中加入精密稱定的達(dá)格列凈原料藥15 mg（批號(hào)：DGBB-9-210901），移取1.0 mL鹽酸溶液（濃度為5 mol/L）加入量瓶，搖勻后靜置，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度至60℃恒定，將其放置24小時(shí)后，取出并放至室溫，加入1.0 mL氫氧化鈉溶液（濃度為5 mol/L）作為中和試劑，加乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋至刻度，搖勻。

（2）堿破壞。50 mL量瓶中精密稱定達(dá)格列凈原料藥15 mg（批號(hào)：DGBB-9-210901），移取1.0 mL氫氧化鈉溶液（濃度為5 mol/L），搖勻后靜置，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度至60℃恒定，將其放置24小時(shí)后，取出并放至室溫，加入1.0 mL鹽酸溶液（濃度為5 mol/L）作為中和試劑，加乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋至刻度，搖勻。

（3）氧化破壞。50 mL量瓶中精密稱定達(dá)格列凈原料藥（批號(hào)：DGBB-9-210901）15mg，加入30%過氧化氫，室溫條件下放置24小時(shí)，加乙腈-水（50：50）溶解并稀釋至刻度，搖勻。

（4）高溫破壞。50 mL量瓶中精密稱定達(dá)格列凈原料藥15 mg（批號(hào)：DGBB-9-210901），置50 mL量瓶中，加乙腈-水（50∶50）30 mL使溶解，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度至60℃恒定，將其放置24小時(shí)后，取出并放至室溫，加乙腈-水（50∶50）稀釋至刻度，搖勻。

（5）光照破壞 。50 mL量瓶中精密稱定達(dá)格列凈原料藥（批號(hào)：DGBB-9-210901）15 mg，加乙腈-水（50∶50）溶解并稀釋至刻度，搖勻，于4500 Lx光照條件下放置3天。

精密量取上述溶液，分別注入液相色譜儀。結(jié)果顯示，DGL301在高溫、酸、堿等條件下均能與主峰及降解產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)有效分離，此方法可以用于特征雜質(zhì)DGL301的測(cè)定。

2.6 線性和范圍

精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液和DGL301對(duì)照品貯備液，用乙腈-水（50∶50）逐步稀釋，制成不同濃度的混合溶液作為系列線性溶液。

精密量取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見表1。

2.7 校正因子

對(duì)表3 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算的到特定雜質(zhì)DGL301的校正因子為1.07。

2.8 檢測(cè)限與定量限

取標(biāo)準(zhǔn)溶液及特定雜質(zhì)DGL301儲(chǔ)備溶液，用乙腈-水（50∶50）逐級(jí)稀釋，計(jì)算結(jié)果見表2。

2.9 精密度試驗(yàn)

2.9.1 重復(fù)性

按照“2 . 2”項(xiàng)規(guī)定，制備6 份平行樣，按照“2.1”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件檢測(cè)，考察6份加標(biāo)樣品溶液中各雜質(zhì)測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.9%，結(jié)果表明重復(fù)性好。

2.9.2 中間精密度

另一人按照“2. 2”項(xiàng)規(guī)定，制備6份平行樣，按照“2.1”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件檢測(cè)。計(jì)算2未測(cè)定人員中間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差R SD（n =12）為1.13%，因此，該分析方法具有良好的中間精密度。

2.10 加樣回收率（見表3）

從上述結(jié)果分析，在LOQ～150%濃度水平下，DGL301在各濃度下3份加標(biāo)樣品溶液中的回收率和回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在可接受標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

2.11 溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)溶液在常溫下放置不同時(shí)間，0小時(shí)，5小時(shí)，10小時(shí)…25小時(shí)，48小時(shí)，比較不同時(shí)間點(diǎn)樣品溶液和加標(biāo)樣品溶中各雜質(zhì)結(jié)果與初始結(jié)果的絕對(duì)差異值，以及不同時(shí)間點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液中主峰峰面積的相對(duì)偏差，結(jié)果總雜含量的RSD為6.08%，表明溶液在測(cè)試條件下穩(wěn)定性良好。

2.12 耐用性試驗(yàn)

本試驗(yàn)考察了流速、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相比例對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。從結(jié)果來看，流動(dòng)相中磷酸比例（±0.01%）、流速（±0.1 mL/min）、柱溫（±2℃）、波長(zhǎng)（±2 nm）的細(xì)微變化沒有影響各雜質(zhì)含量的檢測(cè)，且滿足可接受標(biāo)準(zhǔn)的要求。

2.13 穩(wěn)定性研究

考察樣品在室溫條件下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，定期檢測(cè)雜質(zhì)成分，結(jié)果如表4所示。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)建立了達(dá)格列凈特定雜質(zhì)的分析方法，其H PL C檢測(cè)方法通過方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單易操作、靈敏度、專屬性好，穩(wěn)定性研究結(jié)果理想，可用于達(dá)格列凈的特定雜質(zhì)DGL301的測(cè)定。

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作者簡(jiǎn)介

范祥元，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锖铣杉八幤焚|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

杜陳俠，通信作者，本科，主管藥師，研究方向?yàn)樗幨鹿芾砑八幤焚|(zhì)量分析。

（責(zé)任編輯：袁文靜）