連續(xù)繼代培養(yǎng)下培養(yǎng)基降本措施對甘薯組培苗生長的影響

趙元增 王永剛 陳丹

摘要：為降低甘薯（Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill）組培苗快繁培養(yǎng)的生產(chǎn)成本，提高工廠化育苗的經(jīng)濟(jì)效益，在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過簡化培養(yǎng)基組成、以自來水代替去離子水、以白砂糖代替蔗糖等降本措施，研究了連續(xù)繼代培養(yǎng)下培養(yǎng)基組成簡化或替代措施對甘薯組培苗生長的影響。結(jié)果表明，無論是初代培養(yǎng)還是繼代培養(yǎng)，以白砂糖代替蔗糖，對甘薯組培苗生長無顯著影響，但去除培養(yǎng)基中的微量元素、有機(jī)物質(zhì)或以自來水代替去離子水，均對組培苗產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致株高降低、增殖系數(shù)減小、根系生長變差，且這種不利影響在經(jīng)歷長時間的繼代培養(yǎng)后進(jìn)一步加劇，組培苗生長更差。因此，在甘薯組培苗的工廠化生產(chǎn)中，可以用白砂糖代替蔗糖，降低組培生產(chǎn)成本，而其他降本措施不宜采用。

關(guān)鍵詞：甘薯（Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill）；組培苗；離體快繁；降本措施；連續(xù)繼代培養(yǎng)

中圖分類號：S531? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）04-0179-06

Effect of medium cost reduction measures on the growth of sweet potato tissue culture seedlings under continuous subculture

Abstract： In order to reduce the production cost of rapid propagation of sweet potato （Dioscorea esculenta （Lour.） Burgill） tissue culture seedlings and improve the economic benefits of factory seedling cultivation，on the basis of MS basic culture medium， the effects of simplifying or replacing the composition of culture medium on the growth of sweet potato tissue culture seedlings under continuous subculture were studied through cost reduction measures such as simplifying the composition of culture medium， replacing deionized water with tap water， and replacing sucrose with granulated sugar. The results showed that using white sugar instead of sucrose had no significant effect on the growth of sweet potato tissue cultured seedlings， whether in primary or secondary culture. However， removing trace elements and organic matter from the culture medium， or using tap water instead of deionized water， all had adverse effects on tissue culture seedlings， leading to a decrease in plant height， a decrease in proliferation coefficient， and poorer root growth，and this adverse effect was further exacerbated after prolonged subculture， resulting in poorer growth of tissue cultured seedlings. Therefore， in the factory production of sweet potato tissue culture seedlings， white sugar could be used instead of sucrose to reduce the production cost of tissue culture， while other cost reduction measures were not suitable.

Key words： sweet potato（Dioscorea esculenta （Lour.） Burgill）； tissue culture seedlings； in vitro rapid propagation； cost reduction measures； continuous subculture

甘薯（Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill）為無性繁殖作物，在長期種植與連年留種過程中會因病毒感染、逐年積累和世代相傳而使病情逐代加重，最終導(dǎo)致甘薯種性退化、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降而失去應(yīng)用價值［1，2］。通過組織培養(yǎng)技術(shù)培育脫毒甘薯苗并進(jìn)行規(guī)模化擴(kuò)繁仍是目前國內(nèi)外防治甘薯病毒病、提高甘薯產(chǎn)量與品質(zhì)較有效的方法［3-5］，但其偏高的生產(chǎn)成本是制約工廠化生產(chǎn)的瓶頸，不僅影響甘薯脫毒原原種的生產(chǎn)與供應(yīng)，而且直接決定種苗的價格、用戶的經(jīng)濟(jì)承受能力、脫毒甘薯的普及程度和生產(chǎn)單位的經(jīng)濟(jì)效益［6］。

在現(xiàn)代工廠化脫毒苗的生產(chǎn)中，脫毒苗的組培擴(kuò)繁是首要環(huán)節(jié)，也是重要的組成部分，在保證種苗質(zhì)量的前提下，降低組培環(huán)節(jié)的生產(chǎn)成本是種苗生產(chǎn)技術(shù)體系中降本增效的重要措施［7］。為此，許多研究采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方［8-10］、簡化培養(yǎng)基組成（如減少或去除培養(yǎng)基中的微量元素或有機(jī)成分）［11，12］、應(yīng)用廉價的替代品（如以自來水或白開水代替去離子水，以白砂糖代替蔗糖等降本措施）［13-15］，應(yīng)用到草莓［7，16］、甘薯［6，11］、馬鈴薯［17-19］、葡萄［20］、石竹［21］等植物的組培快繁中，在不降低組培苗質(zhì)量的情況下，明確了這些降本措施的有效性。但這些研究普遍存在2個方面的問題，第一，試驗材料來源于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基組成簡化或替代的培養(yǎng)基上培養(yǎng)會受到前代培養(yǎng)基的影響；第二，試驗結(jié)論來自1代培養(yǎng)的結(jié)果，培養(yǎng)周期短。在工廠化種苗生產(chǎn)中，脫毒苗擴(kuò)繁是一個反復(fù)繼代且長期進(jìn)行的增殖過程，培養(yǎng)基的簡化或替代措施必須在多次繼代和長期培養(yǎng)的情況下保持有效。為此，本研究在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，以經(jīng)簡化或替代處理的培養(yǎng)基為甘薯脫毒苗擴(kuò)繁培養(yǎng)基，采用對應(yīng)處理連續(xù)繼代、長期培養(yǎng)的方式，探討培養(yǎng)基組成簡化和替代處理措施對甘薯組培苗擴(kuò)繁的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘薯品種龍薯9號、洛薯13號的脫毒組培苗，擴(kuò)繁培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IBA+6.0 g/L瓊脂粉+30 g/L蔗糖。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過去除或替代某些成分配制A～E 5種不同的培養(yǎng)基。A（對照處理）：MS+蔗糖3%；B：MS+蔗糖3%（去除微量元素）；C：MS+蔗糖3%（去除有機(jī)物質(zhì)）；D：MS+白砂糖3%（以白砂糖代替蔗糖）；E：MS+蔗糖3%（以自來水代替去離子水）。以上培養(yǎng)基均添加0.1 mg/L IBA，6.0 g/L瓊脂粉，pH調(diào)節(jié)為5.8，分裝量30 mL/瓶。

配制培養(yǎng)基所用的量筒、燒杯、培養(yǎng)瓶等器皿在洗刷干凈后，用去離子水漂洗3遍。以自來水代替去離子水是指除母液用去離子水配制外，溶解瓊脂粉與定容均采用自來水，而其他處理全部為去離子水。白砂糖為南京甘汁園股份有限公司市售食糖；其他試劑均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)的分析純。

1.2.2 接種方法 初代培養(yǎng)：選取來源、培養(yǎng)周期一致，且主莖粗壯、長勢均一的龍薯9號與洛薯13號的組培苗，將其切成至少帶有1個腋芽的長度為1.5～2.0 cm的莖段，接種到A～E培養(yǎng)基中。每個處理接種5瓶，每瓶6個莖段，重復(fù)3次。

繼代培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的組培苗在完成結(jié)果調(diào)查后，將同一處理的組培苗按照初代培養(yǎng)時的接種方法，將其切成1.5～2.0 cm的莖段，接種到對應(yīng)的新配制A～E培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基組成不變），即A處理初代培養(yǎng)的組培苗莖段接種到新配制的A培養(yǎng)基中，B處理的莖段接種B培養(yǎng)基，依次類推。

1.2.3 培養(yǎng)條件 溫度（25±1）℃，光照度2 000～? ? 3 000 lx，光照周期12 h/d。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 在1代的培養(yǎng)周期內(nèi)，進(jìn)行2次結(jié)果調(diào)查：接種莖段培養(yǎng)20 d后調(diào)查各處理的成苗率、組培苗株高、根系生長狀況等；接種莖段培養(yǎng)60 d后調(diào)查各處理的單瓶成苗數(shù)、增殖系數(shù)、平均株高等。在每代培養(yǎng)結(jié)束時，將組培苗切成1.5～2.0 cm的莖段，統(tǒng)計每個處理截取的莖段數(shù)，據(jù)此計算增殖系數(shù)，計算公式如下。

K=a/b? （1）

式中，K為增殖系數(shù)；a為培養(yǎng)結(jié)束后每個處理的莖段數(shù)；b為該處理接種的莖段數(shù)。

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組成簡化和替代措施對甘薯組培苗初代培養(yǎng)的影響

2.1.1 初代培養(yǎng)20 d后甘薯組培苗的性狀差異 初代培養(yǎng)20 d后，所有處理的接種莖段都已萌發(fā)成苗，成苗率均達(dá)100%，各處理的萌芽莖葉生長狀況差異不大，不同處理間的差異主要表現(xiàn)在根系上（表1，圖1）。無論是龍薯9號還是洛薯13號，A、D處理中甘薯組培苗形成的根系發(fā)達(dá)，不僅根數(shù)多，而且初生根上形成的須根多而長，根在瓶底邊緣纏繞成束，株間根系交錯纏繞形成密集的根系網(wǎng)絡(luò)；其次是E處理，組培苗形成的根系較發(fā)達(dá)，雖然在瓶底邊緣纏繞成束，但瓶底中央的根系稀疏，沒有形成密集交叉的根系網(wǎng)絡(luò)；與A、D、E處理相比，B、C處理形成的根數(shù)明顯減少，根短，根雖然在株間重疊，但根系稀疏，沒有形成密集的根系網(wǎng)絡(luò)。B、C處理的根系也存在細(xì)微差異，B處理的初生根數(shù)量少，其上形成的須根少且短，而C處理形成的初生根較多，其上形成的須根多而長。

綜上，在初代培養(yǎng)的早期，與對照（A處理）相比，去除培養(yǎng)基中的微量元素、有機(jī)物質(zhì)或以自來水代替去離子水，主要影響組培苗根的分化和伸長，而對組培苗莖葉的生長影響較小。以白砂糖代替蔗糖，對組培苗的生長無明顯影響。2個甘薯品種的生長狀況呈相似規(guī)律，不存在基因型差異。

2.1.2 初代培養(yǎng)60 d后甘薯組培苗的性狀差異 經(jīng)過60 d的持續(xù)培養(yǎng)，龍薯9號、洛薯13號組培苗在各處理間的根系特征與培養(yǎng)20 d后的特征基本一致（表2），即A、D處理的根系發(fā)達(dá)，其次是E處理，根系較發(fā)達(dá)，B、C處理的根系不發(fā)達(dá)。在A、D處理中，植株形成的根系交錯纏繞布滿瓶底，不僅根數(shù)多且根細(xì)長，形成發(fā)達(dá)的根系網(wǎng)絡(luò)。與A、D處理相比，B、C、E處理形成的根數(shù)量明顯減少，多數(shù)植株僅有3～5條/株，初生根上形成的須根較短，根系稀疏，沒有形成發(fā)達(dá)的根系網(wǎng)絡(luò)。值得注意的是，在去除微量元素的B處理中，形成的根顏色偏黃，根尖出現(xiàn)棕褐色壞死，黃化枯死的葉片數(shù)也高于其他處理，表現(xiàn)出明顯的缺素癥狀。初代培養(yǎng)60 d后，洛薯13號組培苗各處理的莖葉生長狀況存在明顯區(qū)別， A、D處理的植株生長狀況較好，平均株高為4.10 cm，顯著高于其他處理；而在培養(yǎng)基簡化處理的B、C處理和以自來水代替去離子水的E處理中，大多數(shù)植株低矮，平均株高均低于3.00 cm。洛薯13號各處理的增殖系數(shù)由大到小依次為A、D、B、E、C，A、D處理的增殖系數(shù)顯著高于C、E處理；B、C、E處理的增殖系數(shù)較小，處理間無顯著差異。

龍薯9號組培苗的單瓶成苗數(shù)、增殖系數(shù)在各處理間無顯著差異，B、C、E處理中組培苗平均株高、增殖系數(shù)、根系發(fā)達(dá)程度明顯低于A、D處理。龍薯9號組培苗的單瓶成苗數(shù)、增殖系數(shù)和平均株高均高于洛薯13號。

綜上，在甘薯組培苗的擴(kuò)繁培養(yǎng)中，可以用白砂糖代替培養(yǎng)基中的蔗糖，組培苗生長狀況與對照無顯著差異。但去除培養(yǎng)基中的微量元素、有機(jī)物質(zhì)或以自來水代替去離子水的降本措施，對甘薯組培苗的生長均產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致植株變矮、增殖系數(shù)降低、根系生長受到抑制，特別是去除培養(yǎng)基中的微量元素，對組培苗生長的不利影響更大。

2.2 培養(yǎng)基組成簡化和替代措施對甘薯組培苗繼代培養(yǎng)的影響

2.2.1 繼代培養(yǎng)20 d后甘薯組培苗的性狀差異 由表3可知，組培苗繼代培養(yǎng)20 d后，A、D處理的組培苗根系與株高表現(xiàn)較好，其次是E處理，B、C處理的表現(xiàn)較差；2個甘薯品種的成苗率在初代培養(yǎng)20 d后均達(dá)100%，但在繼代培養(yǎng)20 d后，2個甘薯品種的成苗率降低，其中B處理的成苗率顯著低于A、C、D處理。由圖2可知，與對照和初代培養(yǎng)20 d后的組培苗相比，繼代培養(yǎng)20 d后龍薯9號B處理的組培苗植株低矮、葉片稀少，且形成的葉片小而狹長。

2.2.2 繼代培養(yǎng)60 d后甘薯組培苗的性狀差異 由表4可知，在繼代培養(yǎng)60 d后，洛薯13號組培苗在A、D、E處理中茁壯生長，平均株高均高于3.40 cm。A、D、E處理中洛薯13號的增殖系數(shù)較高且處理間差異不顯著。B、C處理中洛薯13號組培苗節(jié)間長度短、植株低矮、葉片較小，其中B處理的增殖系數(shù)顯著低于對照A，C處理的增殖系數(shù)顯著低于A、D、E處理。A、D、E處理中洛薯13號組培苗的根數(shù)多且長，須根發(fā)達(dá)，株間根系相互纏繞布滿瓶底，形成異常發(fā)達(dá)的根系網(wǎng)絡(luò)；B處理形成的根粗壯，但根數(shù)少，單株生根數(shù)3～5條，須根少且短，根系稀疏不發(fā)達(dá)；C處理的根細(xì)長，根數(shù)多，單株生根數(shù)4～7條，須根多而細(xì)長。此外，與其他處理形成的青綠色根不同，B處理的根呈棕黃色，多數(shù)根上出現(xiàn)棕褐色或黑褐色的節(jié)點，或根尖2～3 mm呈棕褐色。

龍薯9號組培苗的單瓶成苗數(shù)、增殖系數(shù)、平均株高與根系發(fā)達(dá)程度在各處理間均存在差異，且處理間的差異表現(xiàn)與洛薯13號相似。A、D處理中龍薯9號組培苗生長表現(xiàn)較好，E處理次之，B、C處理表現(xiàn)較差。E處理中龍薯9號組培苗平均株高、增殖系數(shù)均顯著低于A對照（處理）。

綜上，在甘薯組培苗擴(kuò)繁中，去除培養(yǎng)基中的微量元素、有機(jī)物質(zhì)或以自來水代替去離子水的降本措施，對苗的莖葉生長和根系形成均產(chǎn)生不利影響。以白砂糖代替蔗糖，對組培苗的生長無不良影響，可降低組培苗生產(chǎn)成本。

2.3 連續(xù)繼代培養(yǎng)對甘薯組培苗生長的影響

無論是初代培養(yǎng)還是繼代培養(yǎng)，均表現(xiàn)為A、D處理的甘薯組培苗綜合生長表現(xiàn)較好，E處理次之，B、C處理表現(xiàn)較差（表2、表4，圖3、圖4）。

初代培養(yǎng)60 d后，龍薯9號組培苗單瓶成苗數(shù)與增殖系數(shù)在各處理間均不存在顯著差異（表2），但在繼代培養(yǎng)60 d后，B處理中龍薯9號組培苗單瓶成苗數(shù)顯著低于A、D處理；B、C處理中龍薯9號組培苗增殖系數(shù)顯著低于A、D處理，E處理的增殖系數(shù)顯著低于A處理（表4）。與初代培養(yǎng)相比，龍薯9號繼代培養(yǎng)60 d后的組培苗株高、葉片的形態(tài)大小在處理間的差異進(jìn)一步加大（表2、表4、圖3），相較初代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)結(jié)束時B、C、E處理的組培苗節(jié)間更短、株高更低，與A、D處理的株高差距呈增大的趨勢，特別是B處理的組培苗，不僅植株低矮，而且葉片小而狹，尤其是植株中上部葉片更細(xì)小，葉長寬僅有2～3 mm×1～2 mm，葉面出現(xiàn)黃色褪綠斑紋，甚至整片葉出現(xiàn)黃褐色。

洛薯13號組培苗的生長狀況在初代培養(yǎng)與繼代培養(yǎng)間也存在差異，特別是B、C處理的組培苗，繼代培養(yǎng)的性狀表現(xiàn)不及初代培養(yǎng)。由表2、表4、圖4可知，初代培養(yǎng)60 d后洛薯13號單瓶成苗數(shù)在各處理間無顯著差異，但繼代培養(yǎng)60 d后B處理的單瓶成苗數(shù)卻顯著低于對照處理；B、C處理中初代培養(yǎng)的組培苗葉片形態(tài)大小正常，株高較高，而繼代培養(yǎng)中B、C處理的組培苗葉片相比其他處理明顯變小，株高較低。

綜上，與初代培養(yǎng)相比，去除培養(yǎng)基中的微量元素、有機(jī)物質(zhì)或以自來水代替去離子水，在經(jīng)歷長時間的初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)后，組培苗的綜合性狀進(jìn)一步變差。

3 小結(jié)與討論

在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的蔗糖、去離子水的用量較大，培養(yǎng)基成本較高［7，15］，在不影響培養(yǎng)效果的前提下，若能采用相對廉價的替代物，可顯著降低培養(yǎng)基的配制成本［22］。作為培養(yǎng)基中必不可少的成分，植物組培中一般用分析純蔗糖作為碳源和滲透調(diào)節(jié)物，白砂糖的主要成分也是蔗糖，但通常情況下蔗糖的市場價為白砂糖的3倍，以白砂糖代替蔗糖配制培養(yǎng)基，可顯著降低培養(yǎng)基的制作成本［15］。本研究結(jié)果表明，在甘薯組培苗擴(kuò)繁中，以白砂糖代替蔗糖，組培苗的成苗率、平均株高、增殖系數(shù)、根系發(fā)達(dá)程度等均與對照處理無顯著差異，即使經(jīng)歷120 d的初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)，白砂糖的培養(yǎng)效果與蔗糖無顯著差異。因此，在甘薯組培苗的工廠化快繁中，白砂糖可替代蔗糖作為組培苗快繁的培養(yǎng)基糖源，這與閆明明等［6］、姜秀芳等［23］的研究結(jié)果一致。為避免水中離子的干擾，植物組培研究中一般用去離子水配制培養(yǎng)基，但制備去離子水耗電費(fèi)水，成本高。有研究表明，用白開水或自來水代替去離子水用于植物組培，對組培苗的增殖和生長無不良影響［6，14］，但也有研究認(rèn)為自來水代替去離子水會導(dǎo)致組培苗生長變差，增殖倍數(shù)降低［15］。本研究中，龍薯9號2次培養(yǎng)的結(jié)果都表明，用自來水代替去離子水，導(dǎo)致甘薯組培苗株高降低，根系變差，初代培養(yǎng)的增殖系數(shù)與對照無顯著差異，但繼代培養(yǎng)的增殖系數(shù)顯著低于對照；洛薯13號組培苗在初代培養(yǎng)中E處理的平均株高、增殖系數(shù)都顯著低于對照，但繼代培養(yǎng)中組培苗的平均株高、增殖系數(shù)與對照無顯著差異。結(jié)果表明，用自來水配制培養(yǎng)基，試驗的重復(fù)性較差，造成這種差異的原因可能與不同批次的自來水水質(zhì)有關(guān)。與去離子水相比，自來水中的離子雜質(zhì)多，不同時間接取的自來水中離子雜質(zhì)存在差異［24］。

在一些植物的組培快繁中，微量元素可以被部分或全部去除，對培養(yǎng)物的生長并沒有顯著的影響［25］，對于一些痕跡量的微量元素，可通過瓊脂粉或其他試劑得到補(bǔ)充［26］。但本研究的結(jié)果表明，去除培養(yǎng)基中的微量元素，在初代培養(yǎng)時已經(jīng)顯著影響甘薯組培苗的生長，導(dǎo)致株高降低、增殖系數(shù)減小、根系生長變差，在經(jīng)歷連續(xù)繼代培養(yǎng)后，這種不利影響會進(jìn)一步加劇。因此，在甘薯組培快繁中，不能去除培養(yǎng)基中的微量元素，特別是在長期的規(guī)?；a(chǎn)中更是如此。

一般認(rèn)為，大多數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞都能合成所有必需的維生素和部分氨基酸，但合成量卻難以滿足細(xì)胞分裂分化的需要［27］。本研究結(jié)果表明，去除培養(yǎng)基中的有機(jī)物質(zhì)，無論初代培養(yǎng)還是繼代培養(yǎng)，均對甘薯組培苗的生長不利，導(dǎo)致組培苗整體生長狀況變差。也有研究表明，去除培養(yǎng)基中的有機(jī)成分，對組培苗的生長無顯著影響［25，28］。因此，對于植物快繁培養(yǎng)時培養(yǎng)基中有機(jī)物質(zhì)保留與否，應(yīng)該與植物種類和外植體類型有關(guān)，不能一概而論。

不同基因型甘薯組培苗對培養(yǎng)基成分有較強(qiáng)的選擇性，高淀粉型甘薯品種成苗率低、莖段增殖系數(shù)小，而含水量較大的鮮食型甘薯品種，成苗率較高、莖段增殖系數(shù)大［29，30］。本研究采用了高淀粉型品種洛薯13號和鮮食型品種龍薯9號，2次培養(yǎng)的結(jié)果都表明，龍薯9號的株高與增殖系數(shù)均高于同等培養(yǎng)條件下的洛薯13號，這與前人的研究結(jié)果［29，30］一致。初代培養(yǎng)與繼代培養(yǎng)相比，2個甘薯品種的組培苗在不同處理間的生長差異，均是繼代培養(yǎng)各處理間的差異比初代培養(yǎng)更大，這表明培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素的匱乏，如微量元素的缺失，在經(jīng)歷連續(xù)的長期培養(yǎng)后會進(jìn)一步加劇，從而對組培苗的生長不利。值得注意的是，在同樣的不利培養(yǎng)條件下（如去除培養(yǎng)基中的微量元素），2個甘薯品種在經(jīng)歷長期的繼代培養(yǎng)后，組培苗生長狀況也存在差異：龍薯9號B處理的組培苗葉片顯著變小、畸形、黃化，根尖變褐；而洛薯13號B處理的組培苗雖然葉片變小，但變化幅度相對較小。造成這種差異的原因，可能與甘薯類型有關(guān)，在一定條件下，洛薯13號對不利培養(yǎng)條件的耐受性可能比龍薯9號更強(qiáng)。

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