抗根腫病長(zhǎng)柄芥育種材料的創(chuàng)制與鑒定

李崇娟 楊鼎 呂鳳仙 和江明 蘭梅 楊紅麗 徐學(xué)忠 胡靖鋒 張麗琴

摘要：通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交及回交將白菜的抗病基因?qū)氲浇娌酥?，?chuàng)制獲得優(yōu)質(zhì)的抗根腫病長(zhǎng)柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）育種材料。采用人工接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定相結(jié)合法，對(duì)10份抗根腫病白菜材料進(jìn)行抗性分析，篩選出1份可作為長(zhǎng)柄芥抗根腫病育種材料創(chuàng)制的抗性資源CCR21002。利用CCR21002分別作為父本、母本提供抗根腫病基因，與長(zhǎng)柄芥進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，結(jié)合胚挽救技術(shù)獲得正反雜交種F1，選取植株形態(tài)偏向芥菜的F1與長(zhǎng)柄芥回交獲得BC1，對(duì)BC1植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)分析及抗病性鑒定。結(jié)果表明，回交一代比雜種一代更難獲得，胚挽救成活的13株BC1中，僅篩選出1株基因型為AABB且抗根腫病的植株，經(jīng)分子標(biāo)記鑒定所含抗病基因?yàn)镃Rb，在植株形態(tài)上保留有長(zhǎng)柄芥的大部分性狀。證明經(jīng)過(guò)與抗根腫病白菜遠(yuǎn)緣雜交及回交，獲得對(duì)4號(hào)生理小種表現(xiàn)抗性的長(zhǎng)柄芥新種質(zhì)1份，可用于繼續(xù)回交轉(zhuǎn)育。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）； 抗根腫?。?胚挽救； 正反雜交； 創(chuàng)制與鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.3? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）04-0082-08

Creation and identification of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen breeding materials resistant to clubroot

Abstract： The high quality breeding and clubroot disease resistance material of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen was created by introducing the clubroot disease resistance gene of Brassica rapa into Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen through distant and reciprocal hybridization. The resistance of 10 Chinese cabbage materials to clubroot disease was analyzed by the combination of artificial inoculation identification and molecular marker identification， and one material CCR21002 was selected as the resistant resource to be created as the breeding material for clubroot disease resistance of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen. CCR21002 was used as the male parent and female parent to provide anti-clubroot disease genes， and the hybrid F1 was obtained with the embryo rescue technique. F1， whose plant morphology was more favorable to Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen， was backcrossed to obtain BC1， and the BC1 generation plants were analyzed by morphology， cytology and disease resistance identification. The results showed that the backcross generation was more difficult to obtain than the hybrid generation. Among the 13 strains of BC1 that survived by embryo rescue， only 1 strain was screened with genotype AABB and resistance to clubroot disease. The resistance gene was identified by molecular markers as CRb， and most of the traits of Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen were retained in plant morphology. It was proved that a new germplasm resistant to physiological race 4 was obtained through remote cross and backcross with anti-clubroot disease Chinese cabbage， which could be used for backcrossing breeding.

Key words： Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen； resistance to clubroot； embryo rescue； reciprocal crosses； creation and identification

長(zhǎng)柄芥（Brassica juncea var. longepetiolata Yang et Chen）是十字花科蕓薹屬葉用芥菜中的一個(gè)變種類(lèi)群，主要起源于四川省，因其葉柄細(xì)長(zhǎng)而得名，可鮮食或加工成酸腌菜［1］，因葉肉肥厚、質(zhì)地脆嫩、纖維較少而深受人們的喜愛(ài)，在云南省被廣泛種植，形成了一個(gè)以長(zhǎng)柄芥種植、加工、消費(fèi)為中心的產(chǎn)業(yè)體系［2］。隨著長(zhǎng)柄芥在云南省的栽培面積逐年擴(kuò)大， 4號(hào)生理小種導(dǎo)致的根腫病危害也日益嚴(yán)重，威脅著長(zhǎng)柄芥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為解決根腫病對(duì)長(zhǎng)柄芥生產(chǎn)的限制，培育抗根腫病長(zhǎng)柄芥品種是最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，而篩選優(yōu)質(zhì)的抗根腫病種資質(zhì)源，創(chuàng)制抗根腫病的長(zhǎng)柄芥育種材料，可為培育抗根腫病長(zhǎng)柄芥品種奠定基礎(chǔ)。

根腫病是由根腫菌侵染植株根部皮層細(xì)胞所引起的一種土傳病害［3］，Williams鑒別系統(tǒng)將根腫菌劃分為16個(gè)生理小種，其中4號(hào)生理小種的致病力最強(qiáng)。沈向群等［4］、陳靜等［5］對(duì)云南省發(fā)病地區(qū)的菌樣進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)致病菌主要以4號(hào)生理小種為主。江瑩芬等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，與C基因組相比，蕓薹屬A基因組內(nèi)所含的抗源較豐富，而B(niǎo)基因組則尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此在十字花科蕓薹屬蔬菜抗根腫病育種中，選用的抗性基因主要來(lái)源于A基因組。白菜已報(bào)道的抗性位點(diǎn)多達(dá)23個(gè)［7］，其中CRb基因?qū)Ω[菌生理小種2、4和8均具有良好抗性，并表現(xiàn)為單基因顯性遺傳特性［8］。羅延青等［9］通過(guò)甘藍(lán)型油菜種質(zhì)與根腫病高抗白菜品種“康根51”雜交，獲得對(duì)云南省特定根腫病生理小種具有抗性的甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)2份。彭麗莎等［10，11］采用胚挽救技術(shù)篩選到抗根腫病的甘藍(lán)×大白菜和甘藍(lán)型油菜新材料，利用種間雜交獲得抗根腫病莖瘤芥育種材料。李倩等［12］以含有CRb抗根腫病位點(diǎn)的白菜為供體親本，通過(guò)與甘藍(lán)型油菜雜交、回交及自交，成功選育了中國(guó)首個(gè)抗根腫病雜交油菜新品種華油雜62R。

白菜與芥菜同為蕓薹屬蔬菜，具有相同的染色體組AA。利用篩選出對(duì)4號(hào)生理小種表現(xiàn)抗性、含聚合抗病基因的白菜抗源材料CCR21002與長(zhǎng)柄芥進(jìn)行遠(yuǎn)緣正反雜交及回交，通過(guò)胚挽救結(jié)合抗根腫病基因的背景選擇技術(shù)，將白菜的CRb基因轉(zhuǎn)育到芥菜中，獲得抗根腫病芥菜種質(zhì)資源，從而改良芥菜的抗根腫病性狀，為培育抗根腫病長(zhǎng)柄芥品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

白菜腫根來(lái)自云南省昆明市，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所實(shí)驗(yàn)室分離獲得根腫菌，使用Williams鑒定系統(tǒng)將其病原菌鑒定為4號(hào)生理小種。供接種試驗(yàn)材料為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所葉菜類(lèi)團(tuán)隊(duì)從全國(guó)各地收集的10份抗根腫病白菜資源，1份感病白菜資源，材料名稱(chēng)及來(lái)源見(jiàn)表1；長(zhǎng)柄芥JC21001為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所選育的高代自交材料。

1.2 方法

1.2.1 休眠孢子懸浮液的制備 將白菜腫根用研磨機(jī)研磨成勻漿，過(guò)濾后3 100 r/min離心15 min，棄上清液，加入50%的蔗糖溶液，再次離心后棄上清液，使用無(wú)菌水將孢子懸浮液濃度調(diào)至1×108個(gè)孢子/mL。

1.2.2 人工接種鑒定 接種材料于2020年5月1日播種，長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，以孢子濃度為1×108個(gè)孢子/mL的4號(hào)生理小種根腫菌菌液在根際周?chē)M(jìn)行接種，每穴1 mL，每處理15穴，3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。30 d后拔出幼苗，洗凈根部雜質(zhì)，參考司軍等［13］、楊曉云等［14］的方法進(jìn)行病情調(diào)查統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 分子標(biāo)記鑒定 以植株幼嫩葉片為材料，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司試劑盒提取DNA，利用與白菜抗根腫病CRb［3］、CRa［15］、CRk［16］、Crr1［17］、CRd［18］、CRbkato［19］基因緊密連鎖的6個(gè)分子標(biāo)記引物組（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物采用1.8%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，在Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行觀(guān)察。

1.2.4 種間雜交及不同培養(yǎng)方式 將白菜與長(zhǎng)柄芥進(jìn)行正反交，配制2個(gè)雜交組合。于授粉后13 d選取部分植株胚珠進(jìn)行胚挽救，另一部分植株胚珠留在母本植株上繼續(xù)生長(zhǎng)。觀(guān)察自然生長(zhǎng)條件下的雜交結(jié)實(shí)率，并與胚挽救的結(jié)實(shí)率進(jìn)行比較。

1.2.5 選擇回交及胚挽救 將正反交雜種F1定植于基地大棚內(nèi)，于抽薹前觀(guān)察植株的生長(zhǎng)形態(tài)，選擇保留較多芥菜性狀的植株與長(zhǎng)柄芥進(jìn)行回交。授粉后13 d選取部分植株胚珠進(jìn)行胚挽救，另一部分留在母本植株上繼續(xù)生長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)回交自然結(jié)子率。

1.2.6 雜種植株F1代及BC1代的鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。對(duì)雜種植株生長(zhǎng)勢(shì)、株型、株高、葉片、花蕾等特征特性進(jìn)行觀(guān)察記錄，并利用亞歷山大染色液隨機(jī)抽取花藥鏡檢，分析育性情況。

2）染色體分析。將雌蕊置于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中暗處理3～4 h，轉(zhuǎn)入卡諾固定液中固定12 h，于1 mol/L的HCl中60 ℃水浴7 min，在載玻片上搗碎，卡寶品紅染色30 s，于顯微鏡下觀(guān)察。

3）倍性鑒定。取幼嫩葉片100 mg沖洗干凈，加入600 μL裂解液解離，切碎后用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，加入1 μL的裂解液、5 μL的PI（碘化丙啶，Propidium iodide）染料、2.5 μL的RnaseA混勻，冰上避光孵化30 min后移至上樣管上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)分析，用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同白菜材料抗根腫病鑒定結(jié)果

2.1.1 人工接種鑒定結(jié)果 抗病性鑒定結(jié)果如圖1所示，未接種菌液的空白對(duì)照均未發(fā)病，感病對(duì)照CCR21010表現(xiàn)為高感?。℉S），病情指數(shù)為75.64。由表3可知，表現(xiàn)為免疫（I）的材料2份，為CCR21001、CCR21002，病情指數(shù)和發(fā)病率均為0，顯著低于其他8份材料。表現(xiàn)為高抗（HR）的材料? 2份，為CCR21000、CCR21009，病情指數(shù)分別為5.01、4.46。表現(xiàn)為抗病（R）的材料3份，為CCR21004、CCR21005、CCR21006，病情指數(shù)為19.71～30.14。CCR21003、CCR21007表現(xiàn)為感病（S），在病情指數(shù)和發(fā)病率方面無(wú)顯著差異。

2.1.2 分子標(biāo)記鑒定結(jié)果 利用與白菜抗根腫病常見(jiàn)基因緊密連鎖的6個(gè)分子標(biāo)記對(duì)上述材料進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明5個(gè)分子標(biāo)記具有多態(tài)性，分別是TCR02a、SC2930、HC688、BRMS-088、KBrH129J18，對(duì)應(yīng)的基因分別為CRb、CRa、CRK、Crr1、CRbkato。由表4可以看出，10份抗根腫病白菜材料均檢測(cè)到1個(gè)或多個(gè)與CR基因連鎖的分子標(biāo)記抗性條帶。其中CCR21001、CCR21002涉及到CRb、CRbkato、CRk? ? 3個(gè)基因；CCR21000涉及到CRb、CRbkato 2個(gè)基因；CCR21003、CCR21006分別涉及到CRk、Crr1基因；CCR21004涉及到Crr1和CRb 2個(gè)基因；CCR21005涉及到Cra和CRk 2個(gè)基因；CCR21009涉及到CRb和CRk 2個(gè)基因；CCR21007涉及到Crr1和Cra 2個(gè)基因，CCR21008涉及到Crr1和CRbkato? 2個(gè)基因；感病對(duì)照CCR21010未涉及到以上抗病基因。

結(jié)合人工接種鑒定結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)含有抗病基因相對(duì)較多的白菜材料對(duì)接種的根腫菌表現(xiàn)的抗性水平相對(duì)較高，如CCR21001和CCR21002含有3個(gè)抗病基因，抗性表現(xiàn)為免疫，含2個(gè)或1個(gè)抗病基因的白菜材料抗性表現(xiàn)為抗病或感病。含有相同的抗病基因，不同白菜材料間抗性水平也存在差異，如CCR21003與CCR21001、CCR21002含有相同的抗病基因CRk，但CCR21003表現(xiàn)為感病。此外，含有CRb基因的5份材料在不同程度上表現(xiàn)為抗病，說(shuō)明CRb基因?qū)?號(hào)生理小種表現(xiàn)為抗病，故篩選出? 2份可以作為長(zhǎng)柄芥抗根腫病材料創(chuàng)制的抗性資源，分別是CCR21001、CCR21002。由于CCR21001是雄性不育材料，無(wú)法在后續(xù)正反交試驗(yàn)中提供花粉，因此選擇CCR21002作為抗性資源進(jìn)行轉(zhuǎn)育。

2.2 不同雜交組合及培養(yǎng)方式的雜種獲得率

對(duì)正反交以及不同培養(yǎng)方式的結(jié)實(shí)率進(jìn)行比較，由圖2可知，正反雜交結(jié)實(shí)率有一定的差異，以長(zhǎng)柄芥為母本的正交組合，在田間常規(guī)培養(yǎng)即可獲得F1代種子，而以白菜為母本的反交組合，田間常規(guī)培養(yǎng)時(shí)種莢會(huì)出現(xiàn)焦黃干癟或假膨大的現(xiàn)象，導(dǎo)致胚敗育不結(jié)子，需要通過(guò)胚挽救技術(shù)才能獲得雜交種F1代幼苗。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表5）顯示，長(zhǎng)柄芥×白菜的正交組合田間常規(guī)培養(yǎng)共獲得501粒F1代種子，顏色偏向母本長(zhǎng)柄芥，體積小于兩親本，成苗率僅達(dá)19.76%；通過(guò)胚挽救共獲得F1代幼苗313株，成苗率為37.49%，胚挽救的成苗率是田間授粉常規(guī)培養(yǎng)的1.90倍，利用胚挽救技術(shù)獲得種間雜種的比例明顯高于人工授粉。白菜×長(zhǎng)柄芥的反交組合，田間常規(guī)培養(yǎng)未獲得種子，通過(guò)胚挽救成苗率為14.13%，是田間常規(guī)培養(yǎng)的14.13倍。比較不同雜交組合胚挽救的成苗率，發(fā)現(xiàn)以長(zhǎng)柄芥為母本的成苗率是以白菜為母本成苗率的2.65倍，表明長(zhǎng)柄芥與白菜正反雜交親和性有差異，以染色體數(shù)目多的長(zhǎng)柄芥作母本時(shí)更容易獲得雜交種。

2.3 種間雜交種F1鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將正反雜交獲得的F1材料移栽到大田后植株生長(zhǎng)狀況良好，形態(tài)觀(guān)察結(jié)果如圖3所示。正交F1（圖3C）生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，開(kāi)展度較大，葉下表面無(wú)刺毛，在葉片、花蕾、植株高度等方面具有明顯的超親優(yōu)勢(shì)，在株型、葉數(shù)、葉柄長(zhǎng)度以及蠟粉量方面偏向母本長(zhǎng)柄芥（圖3B），葉形、葉柄寬度及顏色偏向父本白菜（圖3A），花瓣的顏色及大小介于雙親之間，有微量花粉，可染率為3.2%（圖3G），育性較低。反交F1（圖3D）保留了母本白菜的大部分性狀，植株較矮小，葉背具有刺毛，葉片卵圓形且呈環(huán)抱狀態(tài)，葉緣波狀，葉面綠色微皺，葉柄背部有微量蠟粉，側(cè)生分枝量及花的形態(tài)與父本長(zhǎng)柄芥相似，葉數(shù)、葉柄長(zhǎng)度及寬度介于親本之間，花粉可染率為0（圖3H），表現(xiàn)為完全不育。正反雜交所獲得F1植株形態(tài)差異較大，有明顯的母本偏向性，育性檢測(cè)結(jié)果表明均存在不同程度的敗育。

2.3.2 染色體分析 在親本和正反雜交F1減數(shù)分裂過(guò)程中，觀(guān)察雌蕊染色體數(shù)目及形態(tài)，壓片的鏡檢結(jié)果（圖4）表明，正交F1（圖4C）和反交F1（圖4D）雌蕊染色體數(shù)目相等，均為28，是親本長(zhǎng)柄芥（圖4B）（AABB，2n=36）產(chǎn)生的配子AB與親本白菜（圖4A）（AA，2n=20）產(chǎn)生的配子A染色體數(shù)目之和，與預(yù)期染色體數(shù)目相符，為異源三倍體植株。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同的聯(lián)會(huì)染色體在細(xì)胞中隨機(jī)分布，沒(méi)有表現(xiàn)出一定程度的分群現(xiàn)象，說(shuō)明白菜A基因組染色體的導(dǎo)入可能打破了長(zhǎng)柄芥A基因組和B基因組之間相對(duì)的局域性分布，白菜A基因組可能與芥菜B基因組染色體存在著部分同源性。綜合以上結(jié)果表明獲得的種質(zhì)為長(zhǎng)柄芥與白菜的雜交種（AAB，2n=28）。

2.3.3 倍性鑒定 以親本作為參照，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)正反雜交種F1的倍性，結(jié)果如圖5所示，親本長(zhǎng)柄芥（圖5B）的熒光強(qiáng)度高峰位于50，白菜（圖5A）的熒光強(qiáng)度高峰位于30，正交F1（圖5C）的熒光強(qiáng)度高峰位于40，為親本的平均值，為異源三倍體，反交F1（圖5D）的熒光強(qiáng)度高峰位置與正交F1相同，位于40，為異源三倍體。經(jīng)驗(yàn)證，30株雜交種后代中無(wú)自然加倍的雙三倍體或其他倍性植株，均為異源三倍體。鑒定結(jié)果與染色體觀(guān)察結(jié)果一致，表明正反雜交得到的F1植株是基因型為AAB的三倍體雜交種。

2.3.4 抗病性鑒定 對(duì)雜交種進(jìn)行人工接種根腫菌抗性鑒定，結(jié)果如圖6所示，對(duì)照親本長(zhǎng)柄芥（圖6C）主根膨大，側(cè)根出現(xiàn)腫塊，存在弱苗以及萎蔫現(xiàn)象，表現(xiàn)為感病。正交組合F1（圖6D）和反交組合F1（圖6B）的須根發(fā)達(dá)細(xì)長(zhǎng)，根系未出現(xiàn)腫大部分，與抗病對(duì)照親本白菜（圖6A）相似，均表現(xiàn)為抗病。以上結(jié)果表明，遠(yuǎn)緣雜交已將白菜的抗性基因?qū)腚s交種后代中，正反交F1對(duì)4號(hào)生理小種均表現(xiàn)為抗病。

對(duì)雜交種進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，正交F1和反交F1擴(kuò)增出特異性條帶的位置均與抗病親本白菜保持一致，其中引物TCR02a擴(kuò)增的條帶大小在400 bp左右，引物KBrH129J18擴(kuò)增的條帶大小在230 bp左右，引物HC688擴(kuò)增的條帶大小在1 000 bp左右，感病親本長(zhǎng)柄芥均未擴(kuò)增出明顯的特異性條帶。以上結(jié)果表明，正反交雜交種F1中均含有CRb、CRbkato、CRk基因，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交成功將白菜中的抗病基因轉(zhuǎn)育到雜交種后代中，創(chuàng)制出了抗根腫病的種間雜交種，此結(jié)果與人工接種鑒定結(jié)果一致。

2.4 回交后代BC1鑒定結(jié)果

回交一代比雜交種一代更難獲得，授粉后田間自然生長(zhǎng)的BC1胚完全敗育不結(jié)子，未獲得BC1種子；授粉13 d后取300個(gè)胚珠進(jìn)行胚挽救，僅獲得13株BC1，定植后最終成活9株BC1。7、8、9（圖8）在株型與株高上近似輪回親本長(zhǎng)柄芥，7在葉形、葉數(shù)以及葉色方面都與輪回親本長(zhǎng)柄芥高度相似。雌蕊染色體觀(guān)察結(jié)果表明，保留部分白菜性狀的1、2、3、4、5、6有26條或28條染色體；8、9有38條染色體；7有36條染色體，可以推斷該株的基因型為AABB，在植株形態(tài)上符合選育長(zhǎng)柄芥的目標(biāo)?？垢[病分子標(biāo)記鑒定結(jié)果（圖9）表明，1、5、7中含有CRb基因，F(xiàn)1中的CRbkato、CRk基因均未遺傳到BC1中。綜合植株形態(tài)與基因型分析，9株BC1中只有7是抗根腫病的芥菜材料。

3 小結(jié)與討論

在創(chuàng)制抗根腫病新種質(zhì)的研究中，對(duì)收集的抗病品種和資源進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，是篩選抗病親本的重要依據(jù)。種質(zhì)材料的抗性評(píng)價(jià)采取人工接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定相結(jié)合的方法，可明確種質(zhì)材料對(duì)不同生理小種的抗性及含抗病基因的類(lèi)型，有利于提高抗病育種的效率。張淑霞等［20］通過(guò)人工接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定相結(jié)合的方法，對(duì)收集的94份抗根腫病大白菜資源進(jìn)行抗性分析，篩選到56個(gè)含CRb基因的品種，與人工接種鑒定結(jié)果一致。楊征等［21］利用2個(gè)與抗根腫病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)78份大白菜材料進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)有23份材料同時(shí)含有CRa和CRb基因，為抗病育種提供了材料選擇依據(jù)。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)10份抗根腫病白菜材料進(jìn)行人工接種和分子標(biāo)記鑒定，獲得2份含CRb、CRk、CRbkato基因、對(duì)4號(hào)生理小種表現(xiàn)抗病的白菜材料，可作為后續(xù)抗根腫病長(zhǎng)柄芥材料創(chuàng)制的抗性資源。此外，本研究在2種方法結(jié)合鑒定的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，即使含有相同的抗病基因CRb，白菜材料的抗性水平也存在差異，這一結(jié)果與黃新彪等［22］的研究結(jié)果相似，分析產(chǎn)生差異的原因，可能是這些白菜材料還含有其他CR位點(diǎn)，或是其攜帶的CR基因不純合。此外，在檢測(cè)的10份抗根腫病白菜種質(zhì)中，CCR21003、CCR21008表現(xiàn)出了特殊性，檢測(cè)到了CRk、CRbkato基因的連鎖標(biāo)記，但又表現(xiàn)出對(duì)4號(hào)生理小種的感病，其解釋可能需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證和研究。

遠(yuǎn)緣雜交可以實(shí)現(xiàn)異屬、種間的遺傳物質(zhì)引入和轉(zhuǎn)移， 達(dá)到改良農(nóng)藝性狀以及創(chuàng)制新作物類(lèi)型的目的，是拓寬種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)的重要手段，但獲得遠(yuǎn)緣雜交種通常需要克服雜交不親和、雜交種幼胚敗育等問(wèn)題。王丹等［23］、周慶紅等［24］的研究表明芥菜型油菜與白菜無(wú)論正交、反交都存在一定程度的受精不親和性，以芥菜型油菜作母本的正交組合能獲得種子，反交組合的雜交種胚則全部敗育。徐書(shū)法等［25］在不同芥菜和白菜配制的多對(duì)正反雜交組合中，發(fā)現(xiàn)有6對(duì)反交組合的親和指數(shù)高于正交組合，說(shuō)明以白菜作母本、芥菜作父本也能獲得雜交種。本試驗(yàn)以長(zhǎng)柄芥分別作為父本、母本與白菜進(jìn)行雜交，長(zhǎng)柄芥×白菜的正交組合獲得種子，反交組合的雜交種胚敗育，這與王丹等［23］的結(jié)果一致，與徐書(shū)法等［25］的結(jié)果有差異，這可能與親本的基因型有關(guān)。胚挽救技術(shù)可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的問(wèn)題，提高遠(yuǎn)緣雜交種的獲得率。Diederichsen等［26］通過(guò)胚挽救技術(shù)獲得了西蘭花與白菜雜交的F1，為后續(xù)將A基因組CR基因轉(zhuǎn)育到C基因組中奠定了基礎(chǔ)。曾愛(ài)松等［27］在抗根腫病甘藍(lán)新種質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，胚挽救技術(shù)獲得遠(yuǎn)緣雜交種比例最高為常規(guī)人工授粉的35倍。在本試驗(yàn)中，對(duì)反交組合白菜×長(zhǎng)柄芥授粉13 d后的胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，成功獲得了F1代幼苗，雜交種獲得率是大田常規(guī)培養(yǎng)的14.12倍，該結(jié)果證明了胚挽救技術(shù)能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和導(dǎo)致的胚敗育問(wèn)題。對(duì)能正常結(jié)子的正交組合進(jìn)行胚挽救研究，發(fā)現(xiàn)獲得幼苗率是大田常規(guī)培養(yǎng)的1.89倍，說(shuō)明利用胚挽救技術(shù)獲得種間雜交種的比例顯著高于人工授粉，這與曾愛(ài)松等［27］的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)通過(guò)遠(yuǎn)緣正反雜交及選擇回交法將白菜的抗病基因轉(zhuǎn)育到芥菜中，選育出1株抗根腫病的長(zhǎng)柄芥育種材料，該材料可為選育長(zhǎng)柄芥抗根腫病新品種奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 楊以耕，劉念慈，陳學(xué)群，等.芥菜分類(lèi)研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，? ? 1989（2）：114-121，161-162.

［2］ 劉發(fā)萬(wàn)，任洪冰，秦 榮，等.云南15個(gè)特有少數(shù)民族葉用芥菜資源與保護(hù)利用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2020，48（6）：40-44，47.

［3］ PIAO Z Y，DENG Y Q，CHOI S R，et al. SCAR and CAPS mapping of CRb，a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage （ Brassica rapa ssp. pekinensis）［J］.Theoretic and applied genetics，2004，108（8）：1458-1465.

［4］ 沈向群，聶 凱，吳 瓊，等.大白菜根腫病主要生理小種種群分化鑒定初報(bào)［J］.中國(guó)蔬菜，2009（8）：59-62.

［5］ 陳 靜，任雪松，宋洪元，等.4個(gè)不同地區(qū)十字花科根腫病菌生理小種鑒定及甘藍(lán)新組合的抗性鑒定［J］.西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2016，38（1）：67-72.

［6］ 江瑩芬，戰(zhàn)宗祥，樸鐘云，等.油菜抗根腫病資源創(chuàng)新與利用的研究進(jìn)展與展望［J］.作物學(xué)報(bào)， 2018，44（11）：1592-1599.

［7］ 劉栓桃，王樹(shù)彬，王榮花，等.大白菜抗根腫病分子標(biāo)記研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，54（6）：156-164.

［8］ SUWABE K，TSUKAZAKI H，IKETANI H，et al. Simple sequence repeatbased comparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana genetic origin of clubroot resistance［J］.Genetics，2006，173（1）：309-319.

［9］ 羅延青，王云月，趙德勝，等.抗根腫病甘藍(lán)型油菜新種質(zhì)的創(chuàng)制及抗性評(píng)價(jià)［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，32（4）：699-705.

［10］ 彭麗莎，周俐利，任雪松，等.用胚挽救法創(chuàng)建甘藍(lán)×大白菜抗根腫病新材料［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2016，43（3）：419-426.

［11］ 彭麗莎，沈進(jìn)娟，冷 容，等.莖瘤芥抗根腫病育種材料篩選與創(chuàng)制［J］.植物保護(hù)，2021，47（5）：286-291，296.

［12］ 李 倩，SHAH N，周元委，等.抗根腫病甘藍(lán)型油菜新品種華油雜62R的選育［J］.作物學(xué)報(bào)，2021，47（2）：210-223.

［13］ 司 軍，李成瓊，宋洪元，等.結(jié)球甘藍(lán)對(duì)根腫病的抗性鑒定與評(píng)價(jià)［J］.西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2009，31（6）：26-30.

［14］ 楊曉云，張淑霞，張清霞，等.抗根腫病大白菜品種對(duì)不同地區(qū)根腫病菌的抗性鑒定［J］.中國(guó)蔬菜， 2015（6）：38-41.

［15］ UENO H，MATSUMOTO E，ARUGA D，et al.Molecular characterization of the CRa gene conferring clubroot resistance in Brassica rapa［J］.Plant molecular biology，2012，80（6）：621-629.

［16］ MATSUMOTO E，HAYASHIDA N，SAKAMOTO K，et al. Behavior of DNA markers linked to a clubroot resistance gene in segregating populations of Chinese cabbage （Brassica rapa ssp. pekinensis）［J］.Journal of the Japanese society for horticultural science，2005，74（5）：367-373.

［17］ SUWABE K，TSUKAZAKI H，IKETANI H，et al. Simple sequence repeat-based comparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana［J］.Genetics，2006，173（1）：309-319.

［18］ CHO K H，PARK S H，KIM K T，et al. Mapping quantitative trait loci （QTL） for clubroot resistance in Brassica rapa L.［J］.The journal of horticultural science and biotechnology，2012，87（4）：325-333.

［19］ KATO T，HATAKEYAMA K，F(xiàn)UKINO N，et al. Identificaiton of a clubroot resistance locus conferring resistance to a Plasmodiophora brassicae classified into pathotype group 3 in Chinese cabbage （Brassica rapa L.）［J］.Breeding science，2012，62（3）：282-287.

［20］ 張淑霞，張清霞，司朝光，等.大白菜品種資源抗根腫病鑒定［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，50（5）：98-102，108.

［21］ 楊 征，楊曉云，張清霞，等.大白菜抗根腫病基因位點(diǎn)CRa和CRb的分子標(biāo)記鑒定［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2015，30（2）：87-92.

［22］ 黃新彪，李光寧，軒淑欣，等.蕪菁種質(zhì)根腫病抗性鑒定及CR基因連鎖標(biāo)記分析［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2022，23（5）：1310-1320.

［23］ 王 丹，王文和，史滟澦.芥菜型油菜與白菜正反雜交的胚胎學(xué)研究［J］.植物學(xué)通報(bào)，2006（2）：158-163.

［24］ 周慶紅，周 燦，范淑英.遠(yuǎn)緣雜交在蕓薹屬作物育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2015（2）：165-170.

［25］ 徐書(shū)法，軒正英，馮 輝.蕓薹屬農(nóng)作物種間雜交的親和性［J］.中國(guó)蔬菜，2004（3）：29-30.

［26］ DIEDERICHSEN E，F(xiàn)RAUEN M，LINDERS E G A，et al. Status and perspectives of clubroot resistance breeding in crucifer crops［J］.Journal of plant growth regulation，2009，28（3）：265-281.

［27］ 曾愛(ài)松，李家慶，夏彭飛，等.基于遠(yuǎn)緣雜交法的抗根腫病甘藍(lán)新種質(zhì)創(chuàng)制研究［J］.金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)， 2021，37（1）：74-81.