玉米須絞股藍(lán)復(fù)合提取總黃酮工藝及其降壓片的制備

劉霞 馬澤剛 馬林

摘要：以玉米須（stigma maydis）、絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）（1∶1）為提取原料，總黃酮含量為考察指標(biāo)，通過(guò)提取溶劑、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)等單因素考察對(duì)復(fù)合總黃酮含量的影響，再通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化總黃酮的提取工藝，最后將優(yōu)化提取的總黃酮過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂精制后制備成降壓片。結(jié)果表明，復(fù)方總黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶10，50 ℃下提取3.5 h。制備的片劑質(zhì)量（片重差異±5.1%，脆碎度0.83%，崩解時(shí)限2.41 min）符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）片劑的有關(guān)規(guī)定，并且降壓片能降低SHR大鼠血壓。

關(guān)鍵詞：玉米須（stigma maydis）；絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）；總黃酮；提取工藝；降壓片；制備

中圖分類號(hào)：R284? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）04-0136-05

Extraction process of total flavonoids from stigma maydis and Gynostemma pentaphyllum and preparation of the antihypertensive tablets

Abstract： Taking stigma maydis and Gynostemma pentaphyllum （1∶1） as the extraction raw material and the total flavonoids content as the investigation index， the effect of compound total flavonoids content was investigated by single factors including extraction solvent， ethanol volume fraction， extraction temperature， extraction time， material-liquid ratio and extraction times. Then， the extraction process of total flavonoids was optimized by the orthogonal test. Finally， the optimized total flavonoids were refined by D101 macroporous adsorption resin and prepared into antihypertensive tablets. The results showed that the best extraction process of compound total flavonoids was 50% ethanol volume fraction， the material-liquid ratio was 1∶10， and the extraction time was 3.5 h at 50 ℃. The quality of the prepared tablets （weight difference ±5.1%， fragmentability 0.83%， disintegration time 2.41 min） was in line with the relevant provisions of the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China （2020 edition）， and the antihypertensive tablets could reduce the blood pressure of SHR rats.

Key words：stigma maydis；Gynostemma pentaphyllum；total flavonooids；extraction process；antihypertensive tablets；preparation

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum （Thunb.）Makino）又名七葉膽，為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)全草，富含皂苷、氨基酸、黃酮、萜類、生物堿、多糖、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)［1-3］。其中的活性成分黃酮與抗氧化有密切關(guān)系［4］。玉米須含有黃酮類、多糖類、氨基酸類、生物堿等多種生物活性物質(zhì)，具有利尿、降壓、降糖、降脂等功效。黃酮類物質(zhì)作為玉米須重要的活性成分之一，其含量遠(yuǎn)高于玉米粒，是天然無(wú)毒的抗氧化劑［5-7］。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道了絞股藍(lán)總黃酮［8］、玉米須總黃酮［9］的提取工藝，但對(duì)兩者復(fù)配提取總黃酮及復(fù)合黃酮降壓片的研究未有涉及。本研究以總黃酮含量為指標(biāo)，先對(duì)玉米須、絞股藍(lán)復(fù)配提取總黃酮工藝進(jìn)行探討，再將黃酮精制后制備成降壓片，并對(duì)片劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)（按《中華人民共和國(guó)藥典》2020標(biāo)準(zhǔn)）［10］，最后進(jìn)行SHR大鼠降壓試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

原材料：絞股藍(lán)，購(gòu)于瀘州江陽(yáng)西路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院副主任藥師鐘輝云鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)［Gynostemma pentaphyllum （Thunb.）Makino］；玉米須：干品，購(gòu)于瀘州江陽(yáng)西路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；無(wú)水乙醇、NaOH、NaNO2，天津市福晨化學(xué)試劑廠；Al（NO3）3，南京化學(xué)試劑有限公司，以上均為分析純。純凈水（農(nóng)夫山泉）；D101型大孔吸附樹(shù)脂，中山東鴻化工有限公司；微晶纖維素、硬脂酸鎂、羧甲基纖維素鈉、滑石粉等輔料均購(gòu)于濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司，食品級(jí)；淀粉、山梨糖醇、乳粉、檸檬酸等添加劑均購(gòu)于浙江華康藥業(yè)股份有限公司，食品級(jí)。原發(fā)性高血壓（SHR）大鼠，15只，SCXK（京）2018-0009，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

R201D型恒溫水浴鍋，鞏義市英浴高科儀器廠；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上 海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，上海一展實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公 司；BL610型電子天平，上海上天精密儀器有限公司；UV1000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；DP120型壓片機(jī)，江蘇泰興制藥機(jī)械二廠；CJY-300D型脆碎度測(cè)定儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；LB-2D型崩解儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；moorLAB-NIBP型大鼠無(wú)創(chuàng)血壓儀，美國(guó)吉安得爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮的提取及測(cè)定

1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［11］：配制0.200 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL分別置于10 mL容量瓶中；加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，靜置6 min ，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，靜置60 min；加入4 mL的4%氫氧化鈉溶液，靜置15 min后用60%乙醇定容至刻度，靜置15 min；測(cè)定其在505 nm處的吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）基礎(chǔ)提取方法：稱取1∶1（g∶g）的絞股藍(lán)、玉米須各50 g，1 000 g 50%乙醇浸泡，拌勻，60 °C下攪拌回流2 h， 共回流3次，合并提取液，45 °C真空旋干，稱重，得絞股藍(lán)、玉米須復(fù)合總黃酮。取0.1 g干粉末，60%乙醇溶解并定容至50 mL，取1 mL定容液，根據(jù)上步獲取的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用分光光度法測(cè)定黃酮含量。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1）不同提取溶劑試驗(yàn)：分別用乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿替代基礎(chǔ)提取方法中的提取溶劑，其余操作不變。

2）不同乙醇體積分?jǐn)?shù)試驗(yàn)：分別用40%、50%、60%、70%、80%、90%替代基礎(chǔ)提取方法中的乙醇體積分?jǐn)?shù)，其余操作不變。

3）不同料液比試驗(yàn)：分別用1∶2、1∶6、1∶10、? ? ? 1∶14、1∶18、1∶22的料液比替代基礎(chǔ)提取方法中的料液比，其余操作不變。

4）不同提取溫度試驗(yàn)：分別用40、50、60、70、80、90 ℃替代基礎(chǔ)提取方法中的提取溫度，其余操作不變。

5）不同提取時(shí)間試驗(yàn)：分別用1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h替代基礎(chǔ)提取方法中的提取時(shí)間，其余操作不變。

6）不同提取次數(shù)試驗(yàn)：分別用1、2、3、4、5、6次替代基礎(chǔ)提取方法中的提取次數(shù)，其余操作不變。

1.3.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)總黃酮影響最大的4個(gè)因素及水平（表1），以總黃酮含量為指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，每組3次平行，確定總黃酮的最佳提取工藝。

1.3.4 總黃酮精制試驗(yàn) 對(duì)D101大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理后［12］，裝柱（50 cm玻璃柱裝35 cm）， 將最優(yōu)工藝下提取的總黃酮濃縮液100 mL過(guò)D101大孔吸附柱（流速2 mL/min），60%乙醇1 500 mL洗脫（流速2 mL/min），收集洗脫液，真空濃縮成黃酮粉末，備用。

1.3.5 復(fù)合降壓片的制備

1）混合：稱取制備好的復(fù)方黃酮粉末5 g，微晶纖維素2.4 g，乳粉8 g，木糖醇6 g，檸檬酸0.03 g，淀粉8.57 g，混合均勻，過(guò)80目篩。

2）制軟材：混合粉末和3 g淀粉漿混勻，手握成團(tuán)不黏手，手指輕壓裂開(kāi)即可。

3）制粒：軟材過(guò)16目的尼龍篩制得濕粒，40 ℃烘箱干燥。

4）整粒：干燥后的顆粒過(guò)14目的尼龍網(wǎng)。

5）壓片：硬脂酸鎂0.45 g、滑石粉0.1 g加入到顆粒中混勻，壓片機(jī)壓片。

以上制備的復(fù)合降壓片為100片，片重300 mg，含50 mg/片黃酮提取物。

1.3.6 復(fù)合降壓片的檢測(cè) 參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）片劑檢測(cè)方法，主要檢測(cè)復(fù)合降壓片外觀、重量差異、崩解時(shí)限及脆碎度。

1.3.7 降壓試驗(yàn)

1）藥劑：復(fù)合降壓片1片為300 mg，其中含黃酮提取物50 mg。

2）分組：將SHR大鼠15只平均分為A、B、C組，其中A組為陽(yáng)性對(duì)照組，灌胃給藥卡托普利［4 mg/（只·d）］；B組為試驗(yàn)組，每只每天喂食1片復(fù)合降壓片（碾碎去離子水溶解），采用灌胃方式喂食；C組為空白組，每天每只給予去離子水，每天上午9：00灌胃試驗(yàn)。

3）試驗(yàn)：使用 moorALB-NIBP無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)定大鼠血壓（尾動(dòng)脈血壓），每次給藥后1 h測(cè)量，每次連續(xù)測(cè)3次，取平均值作為測(cè)定血壓值，共試驗(yàn)5周。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量采用單因素方差分析，均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 不同溶劑對(duì)總黃酮含量的影響 由圖1可知，丙酮和甲醇對(duì)總黃酮的提取效果相當(dāng)，乙醇次之，石油醚提取效果最差，考慮到后續(xù)制備玉米須、絞股藍(lán)片劑以及丙酮和甲醇的毒性，故該試驗(yàn)以下研究均以乙醇為提取溶劑。

3.1.2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮含量的影響 由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮含量逐步趨于平穩(wěn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%后，繼續(xù)加大乙醇體積分?jǐn)?shù)，總黃酮含量變化不大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)略有下降趨勢(shì)，分析原因，可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，導(dǎo)致提取液極性發(fā)生變化，從而提取出了許多可溶于大濃度乙醇的雜質(zhì)。

3.1.3 不同料液比對(duì)總黃酮含量的影響 由圖3可知，隨著溶劑體積的增加，總黃酮含量也隨之提高，當(dāng)料液比為1∶14時(shí)，總黃酮含量最大，隨后趨于穩(wěn)定，但從減少溶劑用量、減少能耗、降低濃縮負(fù)荷等多方面考慮，乙醇用量不宜過(guò)大，因此選擇1∶10作為最佳料液比。

3.1.4 不同提取溫度對(duì)總黃酮含量的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的提高，總黃酮含量不斷升高，在70 ℃時(shí)達(dá)到最高，但考慮提取溫度會(huì)直接影響原料中黃酮分子的運(yùn)動(dòng)，過(guò)高的提取溫度容易造成黃酮的結(jié)構(gòu)被破壞，溶出的雜質(zhì)增多，另一方面也容易造成溶劑損失，考慮提取的安全問(wèn)題，選擇60 ℃為最佳的提取溫度。

3.1.5 不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響 由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)3.0 h，總黃酮含量已基本達(dá)到平穩(wěn)，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮含量變化不大，從節(jié)約能耗以及總黃酮純度考慮，若持續(xù)提取，可能會(huì)提取出更多的雜質(zhì)，因此，選擇3.0 h作為最佳的提取時(shí)間。

3.1.6 不同提取次數(shù)對(duì)總黃酮含量的影響 由圖6可知，當(dāng)提取次數(shù)為1～3次時(shí)，總黃酮含量呈直線上升狀態(tài)；當(dāng)提取次數(shù)為4次時(shí)，總黃酮含量有下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)殡S著提取次數(shù)的增加，總提取時(shí)間也相應(yīng)增加，提取出了其他雜質(zhì)，從而影響總黃酮含量。如果繼續(xù)增加提取次數(shù)，勢(shì)必會(huì)造成能耗、雜質(zhì)的增加，因此，選擇最佳提取次數(shù)為3次。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)L9（34）共9組，每組3次重復(fù)，結(jié)果見(jiàn)表 2。根據(jù)極差R的大小，判斷提取時(shí)間是影響總黃酮含量的主要因素，然后依次是提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比。從極差分析的均值大小確定優(yōu)化水平為A1B2C2D2， 但根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，總黃酮提取含量最大的組合為A1B2C3D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比1∶10，50 ℃下提取時(shí)間3.5 h。與正交得出的結(jié)論不同，因此進(jìn)行組合A1B2C2D2和組合A1B2C3D2的驗(yàn)證試驗(yàn)。由表3可知，組合A1B2C3D2提取的總黃酮含量高于A1B2C2D2，分析原因，可能為組合A1B2C3D2的提取時(shí)間較組合A1B2C2D2長(zhǎng)，而提取時(shí)間是影響總黃酮含量的主要因素。綜上，確定A1B2C3D2為最優(yōu)組合，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50 %，料液比1∶10，提取時(shí)間3.5 h，提取溫度50 ℃。

對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析（表4）結(jié)果表明，提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比4個(gè)因素對(duì)總黃酮含量的影響均顯著。

3.3 復(fù)合降壓片質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)制備的復(fù)合總黃酮降壓片顏色為淡黃色，表面完整光潔，色澤均勻，無(wú)雜斑，口感柔和，考慮到服用該片劑的部分人群可能為糖尿病人，故甜度劑選用與白砂糖甜度相當(dāng)?shù)哪咎谴?，為解決提取的黃酮略苦的問(wèn)題，配方中添加乳粉及檸檬酸來(lái)掩蓋黃酮苦澀問(wèn)題并改善片劑口感。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）片劑要求，測(cè)定的片重差異為±5.1%，脆碎度為0.83%，平均崩解時(shí)間為2.41 min，均符合藥典要求（表4）。

3.4 復(fù)合降壓片對(duì)SHR大鼠血壓的影響

由表5、表6可知，給藥前SHR大鼠的血壓基本處于同一個(gè)水平。給藥1周后，血壓均有一定程度的下降。當(dāng)給藥到第3周時(shí)，血壓下降程度逐漸平穩(wěn)，第4～5周收縮壓下降結(jié)果與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P<0.05），第3～5周舒張壓下降結(jié)果與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異（P<0.05）。

4 小結(jié)與討論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，提取總黃酮最佳的溶劑體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比為1∶10，這與潘志浩等［13］的研究結(jié)論（乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40）存在較大差異，分析原因，可能與此研究所用原料為復(fù)合原料不同有關(guān)。本研究得出60 °C為最佳的總黃酮提取溫度，3.0 h為最佳提取時(shí)間，與譚曾勇等［14］的研究中單因素最佳提取溫度為90 °C，提取時(shí)間為2 h有一定差異，產(chǎn)生此差異的原因可能是因?yàn)椴捎玫奶崛》椒ú煌?/p>

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液比1∶10，50 ℃下提取3.5 h為最佳的玉米須絞股藍(lán)復(fù)合總黃酮提取工藝。華心愉等［15］采用同種提取方法確定玉米須黃酮的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比1∶16，60 ℃下提取3 h，兩者存在差異，分析原因可能是本研究加入了絞股藍(lán)復(fù)合提取，導(dǎo)致最佳工藝與單獨(dú)提取有出入。

制備的復(fù)合降壓片劑質(zhì)量（片重差異±5.1%，脆碎度0.83%，崩解時(shí)限2.41 min）符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版）片劑的有關(guān)規(guī)定，并且服用降壓片第3周能明顯降低SHR大鼠血壓。與紀(jì)麗蓮［16］報(bào)道的玉米須乙醇浸出液對(duì)家兔有顯著降壓作用一致，分析原因可能是由于復(fù)合降壓片中含大量的玉米須黃酮。

目前以玉米須、絞股藍(lán)為原料的產(chǎn)品僅有袋泡茶，尚未形成片劑產(chǎn)品，本研究證實(shí)玉米須、絞股藍(lán)復(fù)合提取液黃酮含量豐富，存在降低SHR大鼠血壓的作用，可為后續(xù)開(kāi)發(fā)玉米須、絞股藍(lán)復(fù)合降壓片提供有利的數(shù)據(jù)支持。

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