西康扁桃仁中β-谷甾醇檢測方法的建立

朱子冬 李仁愛 魯澤立 程瀟瀟 田榮榮

摘? 要：

西康扁桃仁中植物甾醇含量豐富，且以β-谷甾醇為主。通過高效液相色譜法檢測波長、流動相配比、流速、柱溫等條件，確定西康扁桃仁中β-谷甾醇含量測定的最佳條件為檢測波長201 nm，流動相為100%甲醇，流速1.0 mL/min，色譜柱溫度40℃。方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的RSD值均小于2.0%，平均加標(biāo)回收率106.14%，該方法穩(wěn)定可靠，可用于西康扁桃仁中β-谷甾醇的含量測定。

關(guān)鍵詞：西康扁桃仁；β-谷甾醇；高效液相色譜法；含量測定

中圖分類號：TS207.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? 文章編號：1673－4513（2024）－02－102－06

收稿日期：2023年03月12日

作者簡介：

朱子冬（1996-），男，北京人，助理實驗師，學(xué)士，主要研究方向：食品質(zhì)量檢測技術(shù)。

通信作者：

田榮榮（1982-），女，山東榮成人，教授，博士，主要研究方向：食品質(zhì)量與安全。

基金項目：

北京城市學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（202211418019）。

引言

西康扁桃（Amygdalus tangutica （Batal.） Korsh.） 又名四川扁桃、甘肅山毛桃等，薔薇科［1-2］，密生落葉小灌木，主要產(chǎn)自甘肅南部和四川西南部，是唯一分布在我國南方的野生扁桃種［3］。作為我國特有的木本油料植物，西康扁桃同時還是一種重要的天然食品添加劑及醫(yī)藥原料，具有很高的開發(fā)潛力。

植物甾醇是一種植物中存在的甾體化合物，幾乎所有的植物性食物中均有分布。至今已發(fā)現(xiàn)的植物甾醇的種類數(shù)量超過250種，它們遍及各種植物性食物，含量最多且最為普遍的是豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾烷醇、菜油甾醇以及菜油甾烷醇 ［4］。植物甾醇不但抗氧化活性強(qiáng)，同時具有抑制膽固醇的吸收、降低血脂免疫調(diào)節(jié)作用等多種生理功效［5］。西康扁桃仁中植物甾醇含量超過300 mg/100g，其中β-谷甾醇含量豐富，占80%左右［3］。

β-谷甾醇是以環(huán)戊烷全氫菲為基本骨架的四環(huán)三萜類化合物，其分子結(jié)構(gòu)與膽固醇相近，主要區(qū)別在C-17及C-24上的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致兩者具有不同的生理活性。作為重要的天然甾醇資源，β-谷甾醇具有消炎、抗氧化、降血壓、降血脂等多種藥理活性和生理功能［5-6］。目前，β-谷甾醇的含量測定方法主要有雙波長薄層掃描法［7］、薄層色譜掃描法、高效液相色譜-ELSD［8］、高效液相色譜法等［9-10］、氣相色譜法［11］等。其中高效液相色譜法操作簡便，只需皂化和萃取等手段，即可直接進(jìn)樣，無需對樣品進(jìn)行衍生化，同時具有靈敏度高，準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，應(yīng)用較廣。本實驗擬建立一種簡單、快捷的高效液相色譜法對西康扁桃中β-谷甾醇含量進(jìn)行測定，為西康扁桃種質(zhì)資源的充分利用提供方法學(xué)支持。

一、實驗材料及儀器

（一）實驗材料及試劑

實驗中所使用的西康扁桃由林科院提供，采自四川省阿壩州松潘縣，取仁，冷藏。

β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥99%），北京索萊寶科技有限公司。

乙酸乙酯，北京市通廣精細(xì)化工公司；無水乙醇，北京市通廣精細(xì)化工公司；95%乙醇，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；氫氧化鉀，北京化學(xué)試劑公司；甲醇，北京西朧科學(xué)股份有限公司；其中甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

西康扁桃仁中β-谷甾醇檢測方法的建立

（二）實驗儀器

CTO-16高效液相色譜儀，島津儀器（蘇州）有限公司；色譜柱為C18 Inertsil ODS-3（4.6 nm × 250 nm， 5 μm）；98-I-B型電子分析天平梅特勒-托利多儀器有限公司；B-260電熱恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；MDF-86V340 -20℃冰箱，中科都菱科技有限公司；DL-101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津中環(huán)實驗電爐有限公司；200多功能粉碎機(jī)，武義意中廚具有限公司；KQ5200DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

二、實驗方法

（一）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取β-谷甾醇對照品10 mg，置于10 mL容量瓶，加入甲醇超聲溶解，并定容至刻度線，用有機(jī)微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取濾液，得1.0 mg/mLβ-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

（二）樣品溶液的制備

西康扁桃仁去皮干燥粉碎，加入定量的乙酸乙酯，超聲提取后獲得扁桃仁油，稱取適量扁桃仁油于三角瓶中加入濃度為20%的氫氧化鉀-乙醇溶液，隨后水浴加熱使其皂化，萃取得到植物甾醇粗提物，并加適量流動相溶解殘渣，得供試品溶液。

（三）β-谷甾醇檢測條件的摸索

1.檢測波長的選擇

配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。使用TU-1900紫外分光光度計，設(shè)置掃描波長為190 nm ～ 300 nm，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長掃描，根據(jù)吸光值的變化，確定β-谷甾醇的檢測波長。

2.流動相的選擇

配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，分別設(shè)置流動相為100%甲醇，甲醇一水的比例為955，甲醇一水的比例9010，選用二（三）1確定的檢測波長，流速為1.0 mL/min，柱溫設(shè)為35℃，進(jìn)樣量為10 μL，根據(jù)樣品的保留時間及峰型，確定流動相配比。

3.流速的選擇

配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，選用二（三）1確定的檢測波長及二（三）2確定的流動相，分別以0.8、1.0、1.2 mL/min 的流速分析β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，柱溫設(shè)為35℃，進(jìn)樣量為10 μL，根據(jù)樣品的保留時間及峰型，確定流速。

4.柱溫的選擇

配制0.2 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液選用二（三）1確定的檢測波長、二（三）2確定的流動相及二（三）3確定的流速，分別設(shè)柱溫為30℃、35℃、40℃、45 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，根據(jù)樣品的保留時間及峰型，確定柱溫。

（四）β-谷甾醇檢測方法的可靠性考察

1.線性關(guān)系考察

分別配制濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)液。按上述色譜條件檢測，考察標(biāo)準(zhǔn)液濃度與峰面積間的線性關(guān)系。

2.精密度考察

分別吸取同一對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察該方法的精密度。

3.穩(wěn)定性考察

取樣品溶液，室溫下放置0、4、8、12、24 h，分別進(jìn)樣，考察該樣品在24 h內(nèi)室溫下的穩(wěn)定性。

4.加標(biāo)回收率考察

取樣品溶液10份，取其中的一份進(jìn)行上機(jī)檢測β-谷甾醇含量，分別配制低、中、高3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入后9份樣品中，按照同樣方法上機(jī)測定，計算加標(biāo)回收率。

（五）西康扁桃仁中β-谷甾醇含量的檢測

利用二（二）的方法制備樣品溶液，利用建立的HPLC檢測方法，檢測并計算西康扁桃仁中β-谷甾醇的含量。

三、實驗結(jié)果

（一）β-谷甾醇高效液相色譜條件的摸索結(jié)果

1.檢測波長的確定

如圖1所示，190 nm ～ 300 nm范圍內(nèi)β-谷甾醇的吸光值呈明顯的先升高后降低趨勢，在波長201 nm處達(dá)到最高峰，

A～C 流動相分別為甲醇100%、甲醇水為955、甲醇－水為9010

A～C 流速分別為0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min

故選擇波長為201 nm為檢測波長。

2.流動相的確定

如圖2所示，當(dāng)流動相為100%甲醇時，出峰時間快，峰寬比較窄，峰型最為對稱，因此選擇100%甲醇為流動相。

3.流速的確定

如圖3所示，當(dāng)流速為1 mL/min時，出峰時間較快，峰形對稱，當(dāng)流速增加至1.2 mL/min時，雖然保留時間更短，但在檢測樣品時與其他雜峰無法達(dá)到完全分離，因此選擇1 mL/min流速最為適宜。

4.柱溫的確定

如圖4所示，當(dāng)柱溫為40℃時，峰型相對最為對稱，出峰時間較快，峰寬比較窄，且檢測樣品時與雜峰可達(dá)到完全分離，因此柱溫選擇40℃。

A～D 柱溫分別為30℃、35℃、40℃、45℃

（二）β-谷甾醇高效液相色譜檢測方法的

考察結(jié)果

1.線性關(guān)系和方法精密度考察結(jié)果

圖5所示，以β-谷甾醇濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到相關(guān)方程y＝5326472x - 42712，相關(guān)系數(shù)R2為0.9995，說明β-谷甾醇在 20～500 μg/mL內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系其回歸性較好，可進(jìn)行β-谷甾醇的定量分析。

如表1所示，同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，平行性較好， RSD值為0.75%，表明該方法精密度良好。

2.樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果

如表2所示，24小時內(nèi)檢測β-谷甾醇含量差異較小，RSD值僅為1.87%，說明在室溫條件下樣品24小時內(nèi)較為穩(wěn)定。

3.樣品加標(biāo)回收考察結(jié)果

如表3所示，加標(biāo)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，樣品回收率在94.13% ～ 115.73%范圍內(nèi) ，平均回收率為106.14%。研究表明，該方法回收率良好，可用于樣品的測定。

（三）西康扁桃樣品中β-谷甾醇含量的測定

采用優(yōu)化后的液相色譜條件檢測西康扁桃仁樣品中β-谷甾醇含量，色譜圖如圖6所示，重復(fù)三次，含量平均值為253.56 mg/100g。

結(jié)語

本實驗采用高效液相色譜法檢測西康扁桃仁中β-谷甾醇含量，分別優(yōu)化了流動相、流速、柱溫等色譜條件，并通過線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收等方法學(xué)考察，結(jié)果表明當(dāng)檢測波長為201 nm，流動相為100%甲醇，流速為1 mL/min，柱溫為40℃時，用時較短，線性關(guān)系及精密度良好，回收率高，可用于測定西康扁桃仁中β-谷甾醇含量。本實驗未對β-谷甾醇的提取條件進(jìn)行考察，未來可進(jìn)一步優(yōu)化提取過程，使西康扁桃仁中β-谷甾醇資源得以更充分地利用。

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Establishment of a method forβ-sitosterol determination

in Xikangalmond

ZHU Zidong， LI Renai， LU Zeli， CHENG Xiaoxiao， TIANRongrong

（School of Biomedicine， Beijing City University，Beijing 100094， China）

Abstract：

The phytosterol content in Xikang almond kernels is rich and dominated by β-sitosterol. By exploring the conditions such as wavelength， mobile phase ratio， flow rate and column temperature detected by high-performance liquid chromatography， the content of β-sitosterol in Xikang almond kernel was determined. The optimal conditions for the determination of β-sitosterol content are detection wavelength of 201 nm， mobile phase of 100% methanol， flow rate of 1.0 mL/min and chromatographic column temperature of 40 ℃. The methodological investigation results indicate that the method has a good linear relationship with RSD values of precision repeatability and stability are less than 2.0%， and an average spiked recovery rate is 106.14%. The method is stable and reliable which can be used for the content determination of β-sitosterol in Xikang almond kernel.

Keywords：

Xikang almond; β-sitosterol; high performance liquid chromatography; content determination

（責(zé)任編輯：劉艷麗）